人工ヌクレアーゼの特異性を調べるアッセイツールの開発研究分担者

(1)

厚生労働科学研究費補助金（食品の安全確保推進研究事業）

「新たなバイオテクノロジーを用いて得られた食品の安全性確保とリスクコミュニケーションのための研究」

分担研究報告書

人工ヌクレアーゼの特異性を調べる in vitro アッセイツールの開発

研究分担者中村公亮（国立医薬品食品衛生研究所）

研究要旨:

本研究では、ゲノム編集食品の安全性評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅的に推定する

SITE-seq

法の有用性について検証を行った。本法を評価するため、近年、イギリスで開発された豚繁殖・

呼吸障害症候群ウィルス（porcine reproductive and respiratory syndrome virus [PRRSV]）抵抗性ゲノム編集ブタの事例を取り上げた。本研究結果より、オフターゲット予測は、各種オンラインオフターゲット予測ツールを使った

in silico

解析だけでは不十分であることが示唆された。相同性データベース解析は高確率で生じるオフターゲットを予測するが、そのリストは

SITE-seq

の予測を完全にカバーできず、実際に起こったオフターゲットの切断を見落としたことを確認した。よって、ガイド

RNA

を設計する際には、まず

in silico

解析により最もユニークな配列を選抜した後、そのガイド

RNA

の潜在的なオフターゲットを

SITE-seq

法で生化学的に検証し、さらに培養細胞レベルでその切断の有無を確認することが推奨された。この一連の解析について、高い再現性を有する試験法を確立することで、ゲノム編集作物の開発や安全性評価に役立つことが期待され、また、

Cas9

の特異性に関する情報集積とその制御に貢献できると考える。また、本研究では、ゲノム編集食品を開発する研究者が

SITE-seq

法を容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。

協力研究者木俣真弥国立医薬品食品衛生研究所協力研究者秋本智国立医薬品食品衛生研究所

A. 研究目的

CRISPR-Cas9

システムは、RNA-DNA 相互作用を利用したゲノム編集ツールの一つで、ゲノム編集の標的ゲノム

DNA

に相同な

20

塩基のガイド

RNA

と

Cas9

ヌクレアーゼとを複合体化して、DNA の二本鎖切断を誘導することができる。ガイド

RNA

と

DNA

間の完全な配列の一致は、狙い通りの

DNA

切断（オンターゲット）を誘導する一方、その相互作用の誤認識は意図せぬ

DNA

切断（オフターゲット）とそれによる重大な形質変化を招きかねない。そこで本研究では、ゲノム編集食品の安全性評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅的に推定する

SITE-seq

法の特異性と再現性について検証を行った。近年、イギリスで開発された豚繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（

porcine reproductive and respiratory syndrome virus [PRRSV]）抵抗性ゲノム編集ブタの事例を取り上

げ、本法の有効性について評価した。また、ゲノム編集食品を開発する研究者が

SITE-seq

法を再現性良く容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。

B. 研究方法

１．培養細胞

ヒト胎児腎由来

HEK293T

細胞とブタ腎臓由来

LLC-PK1

細胞は、それぞれ

10% FBS

と

1% ペニシ

リン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液を含む

DMEM

培地と

3% FBS

と

1% ペニシリン-スト

レプトマイシン-L-グルタミン溶液を含む

DMEM

培地を用いて、37℃、

5% CO2

の条件下で培養した。

培養容器は、

75 cm²

スケールのフラスコを用いた。

各細胞の継代は、

2～3

日ごとに（50～70%コンフ

ルエント維持）行った。

(2)

２．ゲノム

DNA

の抽出と精製

HEK293T

または

LLC-PK1

培養細胞（75 cm

²

フラスコ

2

個分）は、0.5%トリプシン-5.3 mM EDTA 溶液で剥離し、冷却

PBS

緩衝液で

2

回洗浄した。

細胞は

10 mL

の冷却

PBS

で再懸濁し、細胞濃度は約 2×10

⁶

～1×10

⁷ cell/mL

とした。

各培養細胞からのゲノム

DNA

の抽出と精製は、

QIAGEN Genomic-tip 500 G

カラムとその緩衝液セット（C1、QBT、G2、GC および

GF

緩衝液）を用いて行った。細胞懸濁液

10 mL

に、冷却

C1

緩衝液

10 mL

と冷却滅菌水

30 mL

を添加し、数回の転倒混和後、氷中で

15

分間インキュベートした。

1,300×

g

、4℃, 15 分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、上清を破棄した。冷却

C1

緩衝液

2 mL

と冷却滅菌水

6 mL

を加え、細胞を再懸濁し、上記と同様の遠心条件により細胞ペレットを得た。G2 緩衝液

10 mL

と

DNase free-RNase A（10 mg/mL）

10

µL を添加し、

30

秒間の緩やかな懸濁後、37℃

で

30

分間インキュベートした。ゲノム

DNA

がせん断されるため、混和の際は、ボルテックスミキサーは使用しない（以後、同様）。さらに、

20 mg/mL Proteinase K

溶液を 200 µL 添加し、50℃で

30

分間インキュベートした。

この

DNA

溶液全量を、QBT 緩衝液

10 mL

で平衡化した

Genomic-tip 500 G

カラムにロードした。

QC

緩衝液

15 mL

で

2

回カラムを洗浄し、RNase A 等を除去した。ゲノム

DNA

は、50℃に加温した

QF

緩衝液

15 mL×2（合計30 mL）で溶出した。

QF

緩衝液

15 mL

に対して、10.5 mL のイソプロパノールを添加し、

DNA

が凝集するまで転倒混和した。13,000×

g

、4℃, 15 分間の遠心条件で

DNA

を沈殿させ、上清を破棄した。冷却

70%（v/v）

エタノール

4 mL

で

DNA

を洗浄し、遠心後、上清を破棄した。溶液は完全に取り除き、

DNA

が乾燥する前に、合計 100 µL の滅菌水で

DNA

を溶解させた。白濁の沈殿物は溶解しないため、遠心分離で除去した。

DNA

溶液 100 µL に

RNA secure

（RNase 阻害剤）を

4

µL 添加し、

60℃で10

分間インキュベートした。

DNA

溶液は室温まで冷却し、その濃度を

Nanodrop 1000 D

で測定した。DNA 溶液は、

滅菌水を用いて、375 ng/µL（HEK293T）または 250 ng/µL（LLC-PK1）に再調製し、使用するまで 4℃に保存した（長期保存はせず、数日以内に使用）。

精製されたゲノム

DNA

の品質は、1%（w/v）アガロースゲル電気泳動で評価した。

３．ガイド

RNA

の合成と精製

ガイド

RNA

の合成と精製には、

Agilent SureGuide gRNA Synthesis Kit

を用いた。付属プロトコルに従い、本検討では、長鎖型の

（extended backbone）シングルガイド

RNA

を合成した。まず、ガイド

RNA

合成の鋳型となる二本鎖

DNA

を作成するため、次のプライマーを合成した。Primer-Forward: 5’-CG ATG TAA TAC GAC TCA

CTA TAG GXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX GTT TTA GAG CTA TGC TGA AA-3’; Primer-Reverse: 5’-AAG CAC CGA CTC GGT GCC ACT TTT TCA AGT TGA TAA CGG ACT AGC CTT ATT TTA ACT TGC TAT GCT TTT CAG CAT AGC TCT AAA ACY（

「X」は標的とする

20

塩基；「X」

と「Y」は相補塩基とする；下線はオーバーラップする領域）。「表

1」に記載したプライマーを使

用し、以下の反応液（50 µL/反応）を調製した：

5x Herculase II reaction buffer （10 µL）

、2.5

mM each dNTPs

（4 µL）、

10 µM primer-forward （5

µL）、10 µM primer-reverse （5 µL）、Herculase

II Fusion DNA polymerase

（1 µL）、DW （28 µL）。この反応液を 95℃で

2

分間、次いで 60℃で

1

分間、最後に 72℃で

3

分間インキュベートした。

合成された鋳型

DNA（130 bp）は、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）を用いて精

製し、吸光度測定結果をもとに、1 µM に再調製した。

ガイド

RNA

を合成するために、次の反応液（20 µL/反応）を調製した：DPEC water（7.5 µL）、5x

Transcription buffer

（5 µL）、

rATP

（1 µL）、

rCTP

（1 µL）、rGTP（1 µL）、rUTP（1 µL）、0.75 M DTT

（1 µL）、

Yeast Pyrophosphatase

（0.5 µL）、

RNase Block（1 µL）

、T7 RNA polymerase（1 µL）。この反応液に 1 µM 鋳型

DNA

を 5 µL 添加し、混和後、

37℃ で

4

～

16

時間インキュベートした。

RNase-free DNase

を 1 µL 添加し、37℃で

20

分間インキュベートした。十分量のガイド

RNA

を得るため（50 µM 以上）、一種類のガイド

RNA

あたり、4 反応分（100 µL）調製し、キット付属のプロトコルに従い精製した。ただし、次の工程を改良した：

2

反応液分のガイド

RNA

を

1

つのカラムに吸着させ、25 µL の

nuclease-free water

で溶出させた。ガイド

RNA

量は、Nanodrop D1000 で測定し、濃度はその分子量（108 bp）をもとに算出した。ガイド

RNA

は、使用するまで-80℃に保

存した。「表

2」に今回使用したガイド RNA

の配

列を示した。

(3)

４．ゲノム

DNA

の

Cas9

切断

ゲノム

DNA

の二本鎖切断は、様々な濃度のガイド

RNA-Cas9

複合体（RNP）存在下で誘導した。本検討では、Cas9 の終濃度は

1～1,024 nM

の間で変化させ、ガイド

RNA

濃度はその

15倍添加した。

酵素反応は、1x CBB 緩衝液内（20 mM HEPES、150

mM KCl、10 mM MgCl2

、

5% [v/v] glycerol [pH 7.4]）

で行った。まず、RNP 複合体を形成させるため、

15 µL のCas9（3.3x CCB

に溶解）と 15 µL のガイド

RNA（DW

に溶解）を

1 : 15

の濃度比となるように混合し（例：213 nM Cas9 : 3.2 µM ガイド

RNA）

、37℃で

10

分間インキュベートした。ガイド

RNA

は、95℃で 2 分間加熱後、室温で

5

分間静置してから使用した。ここに、20 µL のゲノム

DNA

（HEK293T、375 ng/µL または

LLC-PK1、250

ng/µL）を添加し、37℃で

16

時間インキュベートすることで、十分にゲノム

DNA

を切断した。その後、RNA 分解溶液

6.3 µL（10 mg/mL RNase A、4.4

µL; 5x CCB、1.4 µL; DW、0.5 µL）を添加し、37℃

で

20

分間インキュベートした。さらに、

proteinase K

（20 mg/mL）を 0.5 µL 添加し、55℃

で

20

分間の処理で

Cas9

を失活させた。次の工程まで、氷中で一時的に保管した。

５．SITE-seq が示すオフターゲット切断の妥当性

SITE-seq

が示すオフターゲット切断の妥当性

は、リアルタイム

PCR

にて評価した。

RNP

で切断されたゲノム

DNAと未処理のゲノムDNA

を鋳型として、オフターゲット切断領域を増幅し、その

Ct

値を比較した。

Cas9

処理は、「方法４」で使用した濃度に準じたが、反応スケールは半量の

25

µL とした。また、消化反応の停止後、

proteinase K

を失活させるため、95℃で

10

分間加熱した。

消化

DNA

溶液は、1 ng/µL となるように

DW

で希釈し、鋳型とした。

PCR

反応液は次の通りに調製した。一反応あたり、25 µL として、12.5 µL の 2x

FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）

、各

0.4 µL の 50 µM プライマー対、6.7 µL のDW

と 5 µL の鋳型

DNA

を含めた。以下の温度サイクルで

DNA

を増幅させた：[50℃、

2

分] x1、[95℃、

10

分] x1、[95℃、15 秒；60℃、1 分] x45 サイクル。

６．シーケンスライブラリーの調製

SITE-seq

法でオフターゲット切断部位を特定

するため、Illumina MiSeq システムに対応した

DNA

ライブラリーを以下の通り作成した。図１で示すように、Cas9 で切断された

DNA

は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を利用して精製し、

Illumina

製次世代シーケンサー（MiSeq）

に対応したアダプターをPCRにより

DNAの両端に

付加した（図

2）

。すなわち、上記で

Cas9

処理し

たゲノム

DNA（50 µL 全量）は、エタノール沈殿

法により精製し、25 µL の

DW

で溶解させた。

Cas9

切断面末端にアデニンを付加するため、

DNA

溶液

（25 µL）に

10x NEB2

（5 µL）、

10 mM dATP

（5 µL）、

Klenow Exo^-

（3 µL）、DW（12 µL）を添加し、37℃

で

30

分間反応させた。この

A

突出末端へのビオチンアダプター（Adapter 1）の結合は、100 µM

Adapter 1 For（1 µL）、100 µM Adapter 1 Rev

（1 µL）、DW （8 µL）、2x annealing buffer（20 mM

Tris、100 mM NaCl、2 mM EDTA、pH 7.5）

（10 µL）

を混合し 95℃で

5

分間インキュベートした後、

室温で

45

分間放置し、この二本鎖化した

Adapter 1（2 µL）とdA

付加した

DNA（38 µL）

、NEB 10x T4

DNA ligase buffer（5 µL）、NEB Quick Ligase

（5 µL）を混合した溶液を 20℃で

30

分間、次いで 16℃で

16

時間インキュベートすることで完了した。

ビオチンアダプター付き

DNA

は、マグネットビーズ型のサイズ別

DNA

回収試薬

SPRISelect（ベ

ックマン・コールター）を用いて、付属のプロトコルに従い精製した。DNA 溶液 50 µL に対して、

0.5

倍量の

SPRISelect

試薬（25 µL）を加え、よく混合した。室温で

5

分間放置した後、マグネットスタンドを用いてビーズ（DNA）と上清を分離し、上清を破棄した。ビーズを

85%（v/v）エタ

ノール

175 µL で30

秒間洗浄した。この洗浄は二回繰り返した。完全にエタノールを取り除き、ビーズが乾燥する前に、50 µL の

DW

を加え、十分に懸濁した。室温で

10

分間静置した後、

DW

に溶出した DNA 45 µL を回収した。

DNA

の断片化は酵素的に行った。上記

DNA（40

µL）と

NEB 10x dsFragmentase buffer v2

（5 µL）、

NEB dsFragmentase Enzyme

（1.5 µL）、

DW

（3.5 µL）

を混合し、37℃で

1

時間反応させた（時間厳守；

長時間のインキュベートは

DNA

を過度に分解さ

せる）。12.5 µL の

0.5 M EDTA

を添加し触媒を停

止させ、37.5 µL の

DW

を加えた。その直後、

0.9x SPRISelect

処理により、200～1,000 bp の

DNA

断片を 45 µL 回収した。切断末端は、断片化

DNA

(4)

（ 27.7 µL ）と

NEB 10x End-repair reaction buffer（3.3 µL）、NEB End-repair enzyme mix

（1.5 µL）、

DW

（0.5 µL）を混合した反応液を 20℃,

30

分間に次ぐ

65℃、30

分間のインキュベートで修復した。修復面へのアダプター（Adapter 2）

の結合は、100 µM Adapter 2 N7 For（1 µL）と 100 µM Adapter 2 N6 For（1 µL）、100 µM Adapter

2 N5 For（1 µL）

、100 µM Adapter 2 Rev（3 µL）、

2x annealing buffer（6 µL）を混合し 95℃で5

分間インキュベートした後、室温で

45

分間放置し、この二本鎖化した

Adapter 2（1.25 µL）と

末端修復

DNA（32.5 µL）

、NEB Blunt/TA Ligase

Master Mix（7.5 µL）

、NEB Ligase enhancer（0.5 µL）を混合した溶液を 20℃で

30

分間、次いで 16℃

で

16

時間反応させることで完了した。

Cas9

で切断された

DNA

の選択的な回収は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用した。

まず、

1

反応あたり、 25 µL の

Dynabeads

（Invitrogen、ベリタス社）を

125 µL

の

1x BW buffer（5 mM Tris、1 M NaCl、0.5 mM EDTA [pH

7.5]）で5

分間、回転させながら洗浄した。これ

を二回繰り返した後、41 µL の

2x BW buffer

でビーズを再懸濁した。ここに等量の

DNA

試料（41 µL）を添加し、室温で

30

分間、溶液を混合した。

マグネットで上清を破棄し、200 µL の

1x BW buffer

で

30

秒間洗浄した。これを二回繰り返し、

さらに、同様の洗浄を

10 mM Tris-HCl（pH 8.5）

を用いて行った。

DNA

が吸着したビーズは、

20 µL

の

10 mM Tris-HCl

で再懸濁した。

DNA

ライブラリーへのインデックス付加は、リ

カバリーPCR 後に行った。上記で得た

DNA-ビーズ

混合液（20 µL）と 10 µM Recovery PCR For primer

（2.5 µL）、10 µM Recovery PCR Rev primer（2.5 µL）、NEB 2x Phusion Master Mix（25 µL）を混合し、以下の温度サイクルで

DNA

を増幅させた：

[98℃、30

秒] x 1、[98℃、10 秒；61℃、30 秒；

72℃、2

分] x 12、[72℃、2 分] x 1、[4℃、∞]

x 1。ビーズと上清とをマグネットを用いて完全

に分離し、上清 30 µL を回収した。その上清 3 µL と DW 148.5 µL を混合し、次のインデックス

PCR

の鋳型として用いた。鋳型

DNA

（12 µL）と

NEB 2x Phusion Master Mix（20 µL）、5 µM Index primer For（4 µL）

、5 µM Index primer Rev（4 µL）を混合し、以下の温度サイクルで

DNA

を増幅させた：[98℃、30 秒] x 1、[98℃、10 秒；60℃、30 秒；72℃、2 分] x 12、[72℃、2 分] x 1、[4℃、

∞] x 1。使用したインデックス配列を含むプライマーは、「表１」に列挙した。

目的サイズの

DNA

断片（200～800 bp）は、複数回の

SPRISelect

処理で精製した。上記と同様に

0.7x

処理で

DNA

を精製した後、別法により

1,000 bp

以上の断片を排除し、さらに

0.7x

処理

（一回目と同様）により僅かに残存したプライマーダイマー（～200 bp）を完全に除去した。（また、

1,000 bp

以上の

DNA

断片を排除する

SPRISelect

別法を記載する。ここでは、目的外

の

DNA

サイズ断片をビーズに吸着させ、必要な

DNA

サイズ断片を含む上清を回収する点に注意する。）まず、DNA 溶液に

0.5

倍量の

SPRISelect

試薬を混合し、室温で

5

分間静置した。マグネットを用いて上清を全量回収し、この上清に

1.3

倍量の

SPRISelect

試薬を追加した（以下、通常法に準ずる）。室温で

5

分間静置した後、マグネットを用いて上清を破棄し、1 mL の

85%（v/v）

エタノールで

2

回洗浄した。廃液を完全に取り除き、1 倍量の

DW

で

DNA

を溶出した。

調製した

DNA

ライブラリーの品質は、Agilent

Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip

を用いて評価した。プライマーダイマーが存在しないこと、また、>1,000 bp の

DNA

断片が多量に含まないことを確認した。

DNA

濃度を見積もるため、ライブラリーの平均サイズ値を記録した。（本方法で作製されるライブラリーの平均

DNA

サイズは、

約

650 bp

である（図

3）

。二本鎖

DNA

の量は

Qubit HS

で測定し、この数値（ng/µL）と平均

DNA

分子量値（X-bp x 660 g/mol）から

DNA

ライブラリーの濃度を算出した。異なるインデックス配列が付加された各試料の

DNA

濃度を同値に再調製した後、これらを等量混合し分析試料とした。

７．MiSeq を用いたシーケンス解析

上記方法では、約

1～2 nM DNA

ライブラリーが調製される。

MiSeq

解析での効果的なクラスター形成のために、qPCR でその濃度を再確認した。

ライブラリーの定量は、

KAPA library quantification kit

を用い、その付属プロトコルに従い実施した。算出された値をもとに

1 nM

または

2 nM に再調製した。

DNA

ライブラリーの変性は、サンプルと等量の

0.2 N NaOH

を添加し、室温で

5

分間静置して完了した。変性後、

DNA

は直ちに氷中に移行させた。

MiSeq Reagent Kit v3（150

サイクル）に付属の

(5)

緩衝液

HT1

を用いて、ライブラリーを

10 pM

に希釈した。この時、NaOH の終濃度は

0.001 N

以下とした。10 pM ライブラリー 600 µL を試薬カートリッジ（同キット）の

17

ポートにロードし、

フローセル（同キット）、PR2 試薬（同キット）

とともに

MiSeq

に取り付け、解析を開始した。フ

ローセルは、取り付け前に超純水で塩を洗い流し、

エタノールで汚れと曇りをふき取った。

解析のワークフローは、

Illumina Experimental Manager

（IEM、

v1.16.1）で作成し

た。（本ソフトは

Illumina

社のサイトから無償でダウンロード可能である

[http://jp.support.illumina.com/sequencing/

sequencing_software/experiment_manager/down loads.html?langsel=/jp/]。）IEM

を用いたサンプルシートの作成方法を以下に示す。まず、

Illumina Experimental Manager

を起動し、

「Create Sample Sheet」を選択する。「MiSeq」

をクリックし、「Next」ボタンを押す。次ページで、

Select Category

は「

Other

」、

Select Application

は「FASTQ Only」を選択し、「Next」

を押す。ワークフローのパラメーター以下の画面の通りに設定した（UD index が選択される任意の

work flow prep

を選択する）。画面右の

specific settings

のチェックはすべて外した。

「Finish」ボタンを押すと、エクセル上で内容を確認する。このファイル名はカートリッジに記載されている

Cartridge Barcode

として保存する。

MiSeq

装置本体に解析データを保存する場合、こ

のサンプルシートは

MiSeq

装置の特定の場所に保存した（[Computer] < [Data] < [Illumina] <

[MiSeq Control Software] < [Sample sheets]）

。

８．

DSB

のリファレンスゲノムへのマッピングとクリフ判定

様々な

DNA

断片種が収容されたライブラリーを

Cas9

切断面側からシーケンスし、得られたリードは、オン・オフターゲット部位を特定する情報とした（図

4）

。MiSeq より得られたシーケンスファイル（Fastq）は、公開されているヒト又はブタゲノムをリファレンスにマッピングし、

Cas9

で切断された位置候補の特定、切断位置のゲノム上の情報、切断効率の情報取得を行った。

マッピングソフトウェア

bowtie2（バージョン 2.3.4.2）を用い、リファレンスゲノムにはヒト

（

hg38 Illumina UCSC

）、ブタ（

Sscrofa11.1

Illumina Ensemble）をそれぞれ用いた。切断位

置候補は、原著論文内の切断位置検出スクリプト

（python）にて解析した。切断位置が遺伝子のコーディング領域内に位置するかは、公開されているアノテーションファイルと

bedtools（バージ

ョン

2.27.0）にて参照した。また、個々の切断

された位置情報は、IGV（Integrative Genomics

Viewer

バージョン

2.4）を使用しマッピング状況

の確認は目視で行なった。

９. Galaxy を使用した

DSB

判定ツールの開発上記「７．

DSB

のリファレンスゲノムへのマッピングとクリフ判定」の中で使用した各種ソフトウェアは、BioContainers（Docker）を用いて、

データ解析プラットフォーム

Galaxy

（https://galaxyproject.org/）に実装させた

SITE-seq

解析用ワークフローを作成しツールを

開発した。

C. 研究結果

１．

SITE-seq

法の再現性

ゲノム編集で生じた二本鎖切段位置を解析するに当たり、ゲノムDNAをいかに物理的な分解なしにインタクトな状態で精製するかが、

SITE-Seq

法の特異性を上げるため最も重要となる。本研究では、まず、DNA抽出精製キットを使用して培養細胞からのゲノムDNAの精製を行った。得られたゲノムDNAの品質は、

1%

（w/v）アガロースゲル電気泳動で評価した。0.5～1.0 µg DNAをアガロースゲルのウェルにロードし、観察した。その結果、

培養細胞から高分子量DNAに相当する単一バンドが観察され、分解のない良質なDNA試料を精製することが可能であったことが示唆された（データ示さず）。

SITE-seq

法の原著論文（

Nature Methods, 14, 600-606, 2017）では、複数の標的（ガイドRNA）

を用いて

SITE-seq

の有効性が検証された。我々

は本法の明確な再現を得るため、その中からヒト

のゲノム

DNA

のいわゆる「ゲノムセーフハーバー

領域」を標的に設計されたガイド

RNA

のオフター

ゲットが生じやすいガイド

RNA

とそうでないも

のの代表として、それぞれ

AAVS1

と

FANCF

を選択

し、その切断様相の違いを観察した。さらに、オ

フターゲットの出現場所と頻度はガイド

RNA

の

配列だけでなく、ゲノム編集の際に使用される

Cas9

の添加濃度とも関連することが報告されて

(6)

いる

¹⁾

ことから、様々な

Cas9

濃度（1～1024 nM）

の存在下でヒトゲノム

DNA（HEK293T

細胞由来）

を切断した。

その結果、

AAVS1

のオンターゲット切断は、

1 nM

と

1024 nM Cas9

濃度では観察されず、試験した

内

64 nM

のみオンターゲット切断が確認された

（図

5、7）

。一方、

FANCF

では試験した

1 nM

と

64 nM

の両方でオンターゲット切断が観察された

（図

6、8）

。オフターゲット切断は広範囲な

Cas9

濃度で生じ、その数は

Cas9

濃度に依存して増加した（図

7、8）

。64 nM Cas9 処理における

AAVS1

と

FANCF

のオフターゲット数を比較すると、

AAVS1

のそれは

FANCF

よりも

6

倍以上多く検出された。以上の結果は、原著論文と類似し、

SITE-seq

法は再現性の高いオフターゲット検出法であることが確かめられた。

２．SITE-seq 法で予測されるエクソン内オフターゲット（ヒト）

ゲノム編集生物において、オフターゲット切断に起因する形質変化が極大となる可能性の一つに、標的切断配列以外の遺伝子コード領域（エクソン）が非相同末端結合（non homologous end

joining [NHEJ]）による不規則な編集により予期

せぬ変異が導入されることが挙げられる。そのような変異遺伝子は、有毒・有害なタンパク質として発現、その結果、意図しない表現型が生成されることも考えられる。よって、オフターゲット予測では、まずエクソン内のオフターゲット位置を再現よく特定する必要がある。この点を検証するために、異なる

2

人の実験者によって独立した解析を行い、エクソン内切断位置のマッピングデータを比較した。その結果、

AAVS1

のエクソン内オフターゲット数は、実験者間で異なった。そのオフターゲット部位の共有率は、1 nM、64 nM と

1,024 nM Cas9

処理において、それぞれ

25%、58%

と

28%であり完全に一致しなかった。一方、高確

率で共有されるオフターゲットは、オンターゲット切断が起こる

Cas9

濃度（64 nM）で出現しやすい傾向が観察された（図

7）

。そこで、これら出現再現性の高いオフターゲット配列（31 つの候補）とガイド配列との相同性を照合すると、20 塩基中

3～8

のミスマッチが許容されており、全体的な相同性は必ずしも高くなかった（表

3）

。一方、いずれの候補には

PAM

配列の存在が認められ、その 5’側近接（シード配列：切断の特異性

を決定する配列）の相同性は高かった。これと同様のことは、

AAVS1

よりも特異性の高い

FANCF

でも観察され（表

4）、再現よく提示されるオフタ

ーゲットはこれまでに報告されている

CRISPR-Cas9

システムの切断ルールに忠実であ

ることが示された。

上記の相同性に基づいたオフターゲット予測は、ウェブツールでも可能である。そこで、最も一般的なツールの一つである

CasOFFinder

を用

いて、

SITE-seq

が予測した候補配列を検索した。

AAVS1

のオフターゲット上記

31

候補を調べた結

果、

CasOFFinder

は

31

候補中

14

つしか予測できなかった（表

3）

。

FANCF

においては、3 候補中

2

候補の予測にとどまった（表

4）

。以上より、オフターゲットは

in silico

解析だけでなく、

Cas9

の活性をもとに予測する必要性が示唆された。

３．SITE-seq が示す予測オフターゲットの妥当性（ヒト）

SITE-seq

法による予測の妥当性を評価するた

めに、オフターゲット切断部位を含む

DNA

領域をリアルタイム

PCR

にて解析した。

2

回の独立した解析で得られた共通オフターゲットの中から、マッピングされたリード数上位

3

位を選択し、その切断量をオンターゲットと比較した。切断量は、

Cas9

処理

DNA

と未処理

DNA

間の

Cq

値の差（ΔCq 値）を算出することにより推定した。オンターゲットの切断効率を

100%とした場合、上位 3

つのオフターゲット予測部位の切断効率は、

AAVS1

では

5.11～30.35%、FANCF

では

47.63～52.85%であ

った。その切断効率は、SITE-seq で得られたリード数に比例した。以上の結果より、SITE-seq 法のオフターゲット予測が定量リアルタイム

PCR

法においても支持された（図

9、10）

。

４．SITE-seq によるブタのゲノム編集に使用されたガイド

RNA

の安全性評価（ブタ）

SITE-seq

法の食用生物への応用を目指し、ブ

タゲノム（LLC-PK1 細胞）を用いた解析を試みた。

疫病耐性ゲノム編集ブタの作出に使用されたガイド

RNA（SL26

と

SL28）^2）

について、その特異性を図

4

のワークフローに従って解析した。

AAVS1

のように、SL26 と

SL28

のオンターゲット切断は限られた

Cas9

濃度範囲で観察された。

異なる

4

濃度（1、64、256、1,024 nM）で処理し

た場合、それは

64 nM

と

256 nM

で現れ、低濃度

(7)

（1 nM）と高濃度（1,024 nM）の条件では未切断と判定された。一方、オフターゲットはいずれの

Cas9

濃度でも出現した（図

11）

。その数は

Cas9

濃度依存的に増加し、最終的に～80 候補程度に達した。これらの内エクソンが切断されたのは、

SL26

で

4

遺伝子、SL28 では

3

遺伝子だった（表

5）。オンターゲット切断と同様、エクソン内切断

もまた限られた

Cas9

濃度ポイントで観察された。

SITE-seq

の予測を評価するため、各エクソン

内オフターゲット候補について、先述のリアルタイム

PCR

測定を行った。その結果、SL26 と

SL28

の各候補の内、それぞれ

1

遺伝子（

SL26、

C16H5orf34; SL28、SRFBP1

）で顕著な切断が観察された（図

12、13）

。切断が観察されたものとそうでないものの違いは、ガイド

RNA

との塩基相同性であった（表

5）

。切断が検出されなかった標的では、

PAM

配列が欠落し、ゲノム

DNA

とガイド

RNA

が部分的な結合を示唆するまばらな一致性を示した。一方、切断が検出された標的では、

PAM

配列が存在し、かつシード配列（PAM 近傍の

8

塩基）との相同性が高かった。しかしながら、その相同性は必ずしもインターネット上に公開されている

CasOFFinder³⁾

等の既存のガイド

RNA

設計オンラインツールで予測可能なほど十分ではなかった。

SL26

のオフターゲット配列は

CasOFFinder

で予測できたが、

SL28

の

RNA

バルジ

（膨らみ）が生じた複雑な規則性の無いオフターゲット配列は予測できなかった。以上の結果は、

実際にガイド

RNA

と

Cas9

の複合体をゲノム

DNA

と反応させた活性を基盤とした

SITE-seq

法の予測の必要性を支持した。

５．ブタ

CD163

遺伝子のエクソン内切断とその

オフターゲット（ブタ）

SL26

と

SL28

ガイド

RNA

は、ブタの疫病の原因となる

PPRS

ウィルスの膜融合レセプターとして機能するブタ由来

CD163

遺伝子のイントロン切断を指示する。他方、実際のゲノム編集ではエクソン内を切断する例も多く、その際に使用するガイド

RNA

はオフターゲット効果を最小限にするため、専用のガイド

RNA

設計ツールで設計される。

そこで、ゲノム編集作物の開発者側に立ち、

1

例としてブタ

CD163

遺伝子の第

7

エクソン内を標的とするガイド

RNA

を設計し、

SITE-seq

を試みた。

ガイド

RNA

は、ガイド

RNA

設計ツール（CRISPR

direct^4）

）を用い、高い特異性のある配列の中か

らガイド

RNA

の標的配列を設計した。その結果、

複数のオフターゲット候補が挙げられたが、そのほとんどは不規則な切断面とともにマッピングされた（データ示さず）。これらはガイド

RNA

によるプログラムされた切断ではなく、物理的な

DNA

切断であることが示唆された。一方、

SKA2

遺伝子はエクソン領域で切断される最も有力なオフターゲットと推定された。オンターゲット切断と同様、その切断は特定箇所で起こった。しかし、該当候補とガイド

RNA

との相同性は極めて低く、リアルタイム

PCR

による判定でも、そのオフターゲット切断は認められなかった（図

14）

。

６．Cas9 単体の非特異的切断（ブタ）

ガイド

RNA

非存在下で

Cas9

による

DNA

の非特異的切断の有無を検証するため、ブタゲノムを

DNA

切断活性に必要過剰量の

Cas9

（1,024 nM）を添加し、SITE-seq を試みた。その結果、クリフと判断された配列は十数個リストアップされたが、その候補配列の数は、同

Cas9

濃度下で

SL26

またはSL28を切断した条件よりも

3～4倍少なか

った。

D. 考察

CRISPR-Cas9

を用いたゲノム編集技術の発展に伴い、次世代シーケンサーを利用した

unbias

かつゲノムワイドなオフターゲット解析法が開発されてきた（Digenome-seq

⁵⁾

、GUIDE-seq

^5,6)

、

HTGTS⁷⁾

、CIRCLE-seq

⁸⁾

、SITE-seq 等）。その中でも、Cas9 で切断されたゲノム

DNA

を選択的に濃縮し網羅的にシーケンスするタイプの手法は、より多くのオフターゲット部位の情報を得られる点で、今回の目的であるゼロトレランスな安全性評価とマッチしている。また、SITE-Seq の原著論文では、Digenome-Seq、GUIDE-Seq、HTGTS と比較しても、SITE-seq 法で検出されるオフターゲット候補は、それらの方法を用いて検出される箇所をほぼ完全に網羅することが報告されている

⁹⁾

。そこで、本研究では

SITE-seq

法をオフターゲット解析手法として選択し、まずはその再現性を検証した。その再現性は、ヒトとブタの異なる

DNA

基質で確かめた。

先ず、本法の最大の難点として、鋳型として使

用するゲノム

DNA

の高い品質が求められること

である。抽出精製過程で人工的な切断が生じた場

合、切断されたゲノム

DNA

は、1%（w/v）アガロ

(8)

ースゲル電気泳動によって高分子量のスメアバンドとして、その程度に応じて観察される。培養細胞からのゲノム

DNA

は、

DNA

抽出精製キットを用いて抽出精製した結果、抽出精製過程で生じる可能性のある物理的な分解をほぼ受けていないインタクトなゲノム

DNA

を抽出精製可能であることが示唆された。来年度は、動物細胞にはない強固な細胞壁を有する食用植物（作物）からの抽出精製を行い、本法の有効性についてさらに評価を行っていく予定である。

CRISPR-Cas9

によるオフターゲットは

Cas9

濃度に依存して増加したため、その予測はヌクレアーゼ活性に依存すると考えられた。一方、オンターゲットが限られた

Cas9

濃度で出現したように、

オフターゲットリストが

Cas9

濃度の増加に応じた積み上げ式ではなく、濃度ポイントで候補が異なるランダム式で構築されたことは

Cas9

の特異性が非常にあいまいであることを示唆する。オフターゲットは基本的にガイド

RNA-DNA

間の相同性で決定されるものの、その部分的結合によって生じるバルジ（不一致性）をある程度許容するため、特定箇所を再現よく切断することは困難であり、また、候補部位が多ければ、それはより競合的となると考えられる。従って、SITE-seq による高度なオフターゲット予測は、反応に関わる

Cas9

濃度を高範囲に設定して実行されるべきである。

オフターゲット予測は、

in silico

解析だけでは不十分である。相同性データベース解析は高確率で生じるオフターゲットを予測するが、そのリ

ストは

SITE-seq

の予測を完全にカバーできず、

実際に起こったオフターゲットの切断を見落としたことを確認した。よって、ガイド

RNA

を設計する際は、まず

in silico

解析により最もユニークな配列を選抜した後、そのガイド

RNA

の潜在的なオフターゲットを

SITE-seq

法で生化学的に検証し、さらに培養細胞レベルでその切断の有無を確認することが推奨される。この一連の解析を確立することで、ゲノム編集作物の安全性評価に役立つことが期待され、また、Cas9 の特異性に関する情報集積とその制御に貢献できると考える。

ガイド

RNA

非存在下で

Cas9

による

DNA

の非特異的切断の有無を検証した結果、すべての切断候補配列において、その切断面は不規則であった。

この切断様式から、Cas9 は決まった配列に左右されない非特異的な切断を誘導されていた、また

は

Cas9

の活性以外によりゲノム

DNA

を物理的にせん断されていた可能性が示唆された。

本分担研究では、研究者が視覚的・直観的に

SITE-seq

で得られたデータを個々の研究に活用

できるように、データ解析プラットフォーム

Galaxy

（https://galaxyproject.org/）に実装さ

せた

SITE-seq

解析専用ワークフローを開発した

（図

15）。CUI

を使用した解析では、複数の公

開ソフトウェアを順序だてて実行し結果を得て、

またそれぞれのソフトウェアの動作を自由に条件指定出来ることが求められる。よって、研究者のさまざまな希望に沿う解析が実行可能であるが、パイプライン処理、スクリプト処理等の

CUI

に不慣れな研究者にとっては、設定が多すぎて敷居が高いと感じることが実情である。これらの処理を一つの市販ソフトウェア（ワークフローソフトウェア）を用いて行うことも可能であるが、高額であるとともに、使用するソフトウェアは実は無料のものばかりでるため、未だに一部の研究者が使用するのみの現状となっている。「Galaxy」

を利用することで、一連のソフトウェアの実行時に必要な細かな設定を文字列で入力するのでは無く、

Web

ブラウザ上で指定しコンピュータ間の

「データの編集し受け渡し」を行えるなど、解析手順も順序だてて処理せずにデータが得られるので、インターネット接続環境にある

PC

が有れば十分に解析が可能となる。

本研究では、オンターゲットとオフターゲットの両方を含む

DSB

の位置を推測できる

SITE-seq

解析用ワークフローを「Galaxy」に実装させた。

開発しているツールは、今後、外部サーバーを借りることで、ネットワークセキュリティーが許す範囲で一般に公開し、研究者が無料で利用できるような環境を整備する予定である。

参考文献：

1) Hsu, P. D., et al., Nature Biotechnology, 31, 827-832, 2013

2) Burkard C, et al., PLOS Pathogens 13, e1006206, 2017

3) Bae S, et al., Bioinformatics 30, 1473-1475, 2014

4) Naito Y, et al., Bioinformatics 31, 1120-1123, 2015

5) Kim D, et al., Nature Methods 12, 237-243, 2015

(9)

6) Tsai SQ, et al., Nature Biotechnology 33, 187-197, 2015

7) Frock RL, et al., Nature Biotechnology 33, 179-186, 2015

8) Tsai SQ, et al., Nature Methods 14, 607-614, 2017

9) Cameron P, et al., Nature Methods 14, 600-606, 2017

E. 結論

ゲノム編集食品の安全性評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅的に推定する

SITE-seq

法の再現性について確認した。オフタ

ーゲット予測は、各種オンラインオフターゲット予測ツールを使った

in silico

解析だけでは不十分であることが示唆された。相同性データベース解析は高確率で生じるオフターゲットを予測するが、そのリストは

SITE-seq

の予測を完全にカバーできず、実際に起こったオフターゲットの切断を見落としたことを確認した。SITE-seq 法を再現性良く容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。今後は、ゲノム編集食品として最も開発の進んでいる植物を解析可能な汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールを併せて開発を行う予定である。

F. 業績 1.

論文発表

1) Kawaguchi, N., Tomita, C., Naradate, R., Higami, T., Nakamura, K., Date, K., Aikawa, K., Ogawa, H. A novel protocol for the preparation of active recombinant human pancreatic lipase from Escherichia coli, Journal of

Biochemistry, 2018

doi:10.1093/jb/mvy067

2) Takabatake, R., Kagiya, Y., Minegishi, Y., Futo, S., Soga, K., Nakamura, K., Kondo, K., Mano, J., Kitta, K. Rapid screening detection of genetically modified crops by loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow dipstick. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66, 7839-7845, 2018.

3) Soga, K., Nakamura, K., Kishine, M., Takashima, Y., Miyahara, T., Kimata, S., Mano, J., Takabatake, R., Ozeki, Y., Kitta, K., Kondo, K. Studies on the detection of maize genomic DNAs in cornflakes using real-time PCR. Bulletin of National Institute of Health Sciences, 136, 31-39, 2018

邦文（リアルタイム

PCR

を用いたコーンフレーク中のトウモロコシゲノム

DNA

検出について：曽我慶介、中村公亮、岸根雅宏、

高嶋康晴、宮原平、木俣真弥、真野潤一、

高畠令王奈、小関良宏、橘田和美、近藤一成）

4) Nakanishi, K., Fujii, U., Nakamura, K., Ohtsuki, T., Kimata, S., Soga, K., Kishine, M., Mano, J., Takabatake, R., Kitta, K., Kawakami, H., Akiyama, H., Ikeda, M., Kondo, K. Effect of sodium carboxymethyl cellulose in processed rice foods on detection of genetically modified rice-derived DNA. Japanese Journal of Food Chemistry and Safety, 25, 77-85, 2018

5) Nakamura, K., Ishigaki, T., Kobayashi, T., Kimata, S., Fujii, U., Soga, K., Kishine, M., Takabatake, R., Mano, J., Kitta, K., Kawakami, H., Nishimaki-Mogami, T., Kondo, K. Identification of chickpea (Cicer arietinum) in foods using a novel real-time polymerase chain reaction detection method. Journal of Food Composition and Analysis, 71, 8-16, 2018

6) Kishine, M., Noguchi, A., Mano, J., Takabatake, R., Nakamura, K., Kondo, K., Kitta, K. Detection of DNA in highly processed foods. Food Hygiene and Safety Science, 59, 151-156, 2018

邦文（高度加工食品からの原材料農産物

DNA

検出の検討：岸根雅宏、野口秋雄、真野潤

一、高畠令王奈、中村公亮、近藤一成、橘

田和美）

(10)

2. 学会発表

1) Kondo, K., Kato, R., Sakata, K., Nakamura, K. Mitochondria-resident non-releasable AIF mutant may regulate gene expressions related to cell differentiation and proliferation, 2018 ASCB EMBO Meeting, San Diego, CA, USA, 2018

年

12

月

2) Nakamura, K., Kimata, S., Soga, K., Ohmori, K., Kishine, M., Mano, J., Takabatake, R., Kitta, K., Kondo, K. Effect of food additives in processed foods on endogenous gene detection, 132nd AOAC Annual Meeting & Exposition, Toronto, Canada, 2018

年

8

月

3)

中村公亮、木俣真弥、秋本智、志波優、曽我慶介、田中さやか、権藤崇裕、明石良、近藤一成：SITE-seq 法とオンラインツールを用いたゲノム編集におけるオフターゲット効果の解析結果の比較と評価、日本薬学会第

139

年会、千葉、2019 年

3

月

4)

曽我慶介、中村公亮、石垣拓実、木俣真弥、

大森清美、岸根雅宏、真野潤一、高畠令王奈、

橘田和美、名古屋博之、近藤一成：未承認遺伝子組換えサケ検知法の開発、日本薬学会第

139

年会、千葉、2019 年

3

月

5)

木俣真弥、中村公亮、石垣拓実、曽我慶介、

岸根雅宏、高畠令王奈、橘田和美、近藤一成：

遺伝子組換えバレイショ

Y9

系統と

X17

系統を対象とした検知試験法の開発、第

54

回全国衛生化学技術協議会年会、神奈川、2018 年

11

月

6)

曽我慶介、中村公亮、岸根雅宏、高嶋康晴、

宮原平、木俣真弥、真野潤一、高畠令王奈、

小関良宏、橘田和美、近藤一成：リアルタイ

ム

PCR を用いたコーンフレーク中のトウモ

ロコシゲノム

DNA 検出法の検討、第54

回全国衛生化学技術協議会年会、神奈川、2018 年

11

月

7)

菅野陽平、青塚圭二、坂田こずえ、中村公亮、

鈴木智宏、近藤一成：LAMP 法を用いた有毒

キノコ迅速判別法の構築-ツキヨタケとクサウラベニタケの同時検出に関する検討-、日本食品化学学会第

24

回総会・学術大会、

東京、2018 年

5

月

8)

木俣真弥、中村公亮、石垣拓実、曽我慶介、

岸根雅宏、高畠令王奈、橘田和美、近藤一成：

ダイズにおけるゲノム

DNA

の位置に依存した

DNA

分解度の違い、日本食品化学学会第

24

回総会・学術大会、東京、2018 年

5

月

G. 知的財産権の出願・登録状況 1. 特許取得

中村公亮、小林友子、近藤一成：遺伝子組換え植物の判定法、特許第

6371949

号、登録日：2018 年

7

月

27

日

2. 実用新案登録

なし

3. その他

なし

(11)

「表１」本研究で使用したオリゴ一覧使用目的オリゴ名配列（5’ to 3’）

gRNA

鋳型

DNA Template

DNA-AAVS1-forward

CGATGTAATACGACTCACTATAGGGGGGCCACTAGGGACAGGATG TTTTAGAGCTATGCTGAAA

Template

DNA-AAVS1-reverse

AAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGC CTTATTTTAACTTGCTATGCTTTTCAGCATAGCTCTAAAACA Template

DNA-FANCF-forward

CGATGTAATACGACTCACTATAGGGGAATCCCTTCTGCAGCACCG TTTTAGAGCTATGCTGAAA

Template

DNA-FANCF-reverse

AAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGC CTTATTTTAACTTGCTATGCTTTTCAGCATAGCTCTAAAACG Template-SL26-F CGATGTAATACGACTCACTATAGGGAATCGGCTAAGCCCACTGTG

TTTTAGAGCTATGCTGAAA

Template-SL26-R

「Template DNA-AAVS1-reverse」と同配列

Template-SL28-F CGATGTAATACGACTCACTATAGGCCCATGCCATGAAGAGGGTAG

TTTTAGAGCTATGCTGAAA

Template-SL28-R AAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGC CTTATTTTAACTTGCTATGCTTTTCAGCATAGCTCTAAAACT Template-CD163-exon7-F CGATGTAATACGACTCACTATAGGCCAGTAGCACCCCGCCCTGAG

TTTTAGAGCTATGCTGAAA

Template-CD163-exon7-R

「Template-SL28-R」と同配列ライブラリー：

アダプター付加

Adapter 1-Forward [BioON]GTTGACATGCTGGATTGAGACTTCCTACACTCTTTCCC TACACGACGCTCTTCCGATCT

Adapter 1-Reverase GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGGAAGTCTCAAT CCAGCATGTCAAC

Adapter 2 N7 Forward [PHO]GTCGTATTAGTAGTANNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACG TCTGAACTCC

Adapter 2 N6 Forward [PHO]GTCGTATTAGTAGTANNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGT CTGAACTCC

Adapter 2 N5 Forward [PHO]GTCGTATTAGTAGTANNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCC

Adapter 2 Reverse ACTACTAATACGACT

ライブラリー：

リカバリーPCR

Recovery PCR Forward GGAGTTCAGACGTGTGCTC Recovery PCR Reverse GTTGACATGCTGGATTGAGACTTC

ライブラリー：

インデックス付加

^*

Index-UDI0001-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCGCTAGACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0001-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCGCGGTTGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0002-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGATATCGAACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0002-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATTATAACCGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0003-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCAGACGACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0003-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGACTTGGGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0004-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGAGTAACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0004-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAAGTCCAAGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0005-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGTGCGTACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0005-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAATCCACTGGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0006-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACATACACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0006-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTCAGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

(12)

ライブラリー：

インデックス付加

^*

（続き）

Index-UDI0007-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACATAGCGACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0007-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGCTAGGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0008-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTGCGATAACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0008-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATGGATCGAGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0009-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCAACAGAACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI0009-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGTTCAGGGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI0009-R2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTTCAGGGTGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

Index-UDI00010-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGGTGAGACACTCTT TCCCTACACGACG

Index-UDI00010-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGACCTGAAGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTC

切断領域の増幅

AAVS1-F (on) TATATTCCCAGGGCCGGTTA AAVS1-R ACAGGAGGTGGGGGTTAGAC Chr1_232239348-F (off) CACAGACATGGCCTCTGTG

Chr1_232239348-R TGAGCCAGGTTACATTGAGAC Chr6_83570674-F (off) CTCATCACAGACCTGGAGGT Chr6_83570674-R TCCCAAACCTCAATTCTTAG Chr6_40393238-F (off) CAGGCAGGCAACAGGAATA Chr6_40393238-R TCCTCGGTCTCTGACACATC

FANCF-F (on) TGAAAGCGGAAGTAGGGC

FANCF-R CTCTTGCCTCCACTGGTTG Chr7_102590385-F (off) TGTTGGCTAACTTGATGAGG Chr7_102590385-R AGGTCACTCTAGGTCTCCCAT Chr17_67743554-F (off) CACATGCTACAACAGGATGA Chr17_67743554-R CCCAGACTGAACCCATTA Chr10_42914583-F (off) TGACAGAAGGCAGCCAAG Chr10_42914583-R ACCTCTGACCTCCACAACTG SL26_On_F TCCCAGAATTGTCTCCAGG SL26_On_R CATGCCTCTTGGTTTTTCTG SL26_Off_CD38_F TTTCTGGATGACTTCAAAAC SL26_Off_CD38_R GTTGCTATGAGGAACAAATAT SL26_Off_C5orf34_F AGATAGCATGTACTTTGTCATC SL26_Off_C5orf34_R GGTTCCTGGGATAAATGA SL26Off_SLC2A2_F ACGTTAAAAACTCTTAGAATCC SL26Off_SLC2A2_R GTAACACTCTCACAACAATA SL26_Off_MUL1_F GCCTTAAGATGTGGATATGG SL26_Off_MUL1_R CTTCAGGAGCACAAGATG SL28_On_F AAGTGAGACCCAGGGAATG SL28_On_R CCAAGCGGATTTGTGTGTAT SL28_Off_miRNA_F TTTCTTCCATTCTTGTCCAC SL28_Off_miRNA_R CTGATTATGCTGCCTCGT SL28_Off_SRFBP1_F ACCAAAGACGAGCACAAC

SL28_Off_SRFBP1_R CA AAA TGT AGG CTG AGA GGA CD163-Exon7_On_F AAGGAAGTGGACAGATCTGG CD163-Exon7_On_R CTGCTGTGGCTACATGTCC CD163-Exon7_Off_SKA2_F AGGAGGATTGGCTGCTATAC CD163-Exon7_Off_SKA2_R CACCAATCGGAAGCTCTT

*太文字はインデックス配列

(13)

「表

2」使用したガイドRNA

生物種標的ガイド

RNA

の配列（5’ to 3’）引用

Homo sapiens (ヒト) AAVS1 GGGGCCACTAGGGACAGGAT 5

FANCF GGAATCCCTTCTGCAGCACC 5

Sus scrofa (ブタ) SL26 GAATCGGCTAAGCCCACTGT 7

SL28 CCCATGCCATGAAGAGGGTA 7

CD163-Exon7 CCAGTAGCACCCCGCCCTGA

本研究

(14)

「表

3」SITE-Seq

で予測された

AAVS1

のエクソン内オフターゲット候補

AAVS1

ガイド

RNA

と

64 nM Cas9

で

HEK293T

ゲノムを切断した時に生じるエクソン内オフターゲットを列

挙した。その配列とガイド

RNA

配列との相同性はアスタリスクで示した。赤三角は切断部位、緑枠は

PAM

配列を示す。ここに列挙したオフターゲット候補は、

2

回の独立した解析で共通して見出されたものであ

る。各候補について、CasOFFinder によるオフターゲット予測の可否も表示した。

(15)

（表

3

の続き）

(16)

「表

4」SITE-Seq

で予測された

FANCF

のエクソン内オフターゲット候補

FANCF

ガイド

RNA

と

64 nM Cas9

で

HEK293T

ゲノムを切断した時に生じるエクソン内オフターゲットを列挙した。その配列とガイド

RNA

配列との相同性はアスタリスクで示した。赤三角は切断部位、緑枠は

PAM

配列を示す。ここに列挙したオフターゲット候補は、

2

回の独立した解析で共通して見出されたものである。各候補について、CasOFFinder によるオフターゲット予測の可否も表示した。

「表

5」ブタゲノムのCD163

遺伝子を編集するガイド

RNA

のエクソン内オフターゲット候補

(17)

「図１」SITE-Seq 法のワークフローの概略

SITE-Seq

法の概略は、その原著論文

Cameron P., et al (2017) Nature Methods 14(6): 600-609.より

一部改変し引用した。

シーケンスに使用される

DNA

ライブラリーは、

CRISPR-Cas9

システムで切断された

DNA

断片から選択的に生成される。

①高分子量のゲノムDNA

②gRNPでゲノムを切断

③切断面（3’側）をアデニル化

④ビオチンアダプターを付加

A A

A

T AT

⑤低分子量DNAに断片化 A T

⑥切断面をアデニル化 A

T A A

⑦アダプターを付加 A

T A A

T T

⑧ビオチン付DNAの精製 A T TA

⑨両端にインデックスを付加 A

A T

T P5

P7

⑩シーケンシング & マッピング切断部分リファレンス解読した配列

gRNP=Cas9-ガイドRNA複合体

(18)

「図２」Cas9 切断部位を含む

DNA

断片から作成される

DNA

ライブラリーの構造

SITE-Seq

法で最終的に作成されるライブラリー構造を示した。Cas9 由来の切断面側に

P5

アダプター、

断片化した際に生じるランダムな切断面には

P7

アダプターがそれぞれ付加される。P5 配列および

P7

配列は、フローセルに結合する領域である。８塩基（N）からなる

index

配列は複数のサンプルを識別するバーコードであり、UD Index が使用される（Illumina Adapter Sequences 参照）。Index 配列と目的の

DNA

配列（DNA insert）は、シーケンスプライマー結合部位より解読される。

「図３」DNA ライブラリーのサイズ分布の例

MiSeq

でシーケンスする前に、Agilent BioAnalyzer で解析した典型的な

DNA

ライブラリーのサイズ分布を示す。SITE-Seq 法では、300~2000 bp の

DNA

を含むライブラリーが調製され、その平均サイズはおよそ

650 bp

となる。

150~200 bp

の

DNA

はプライマーダイマーに相当し、シーケンスの質を低下させるため、

完全に除去する必要がある。同様に、1000 bp を超える

DNA

の含量も最小限とする。

(19)

「図４」シーケンスデータから

Cas9

切断部位を特定・可視化するまでのシステム概略

(20)

「図５」IGV ソフトウェア上で表示される

AAVS1

のオンターゲット切断部位

AAVS1

のオンターゲット切断を赤矢印で示す。下方向に積み重ねられている棒は、リファレンスゲノム（ヒト）

に張り付けられたリードを指す。

「図６」IGV ソフトウェア上で表示される

FANCF

のオンターゲット切断部位

FANCF

のオンターゲット切断を赤矢印で示す。下方向に積み重ねられている棒は、リファレンスゲノム（ヒト）

に張り付けられたリードを指す。

(21)

「図７」AAVS1-ガイド

RNA

におけるオフターゲット切断の出現推移

Cas9

濃度に依存したオフターゲット切断の増加を示した。AAVS1 を標的とするガイド

RNA

を用いて、HEK293T ゲノムを処理した。この処理は異なる

2

人の実験者（A と

B）により独立して行われた。折れ線グラフはオフ

ターゲットの総数（左縦軸）、棒グラフはその内のエクソン内切断数（右縦軸）を示す。

「図８」FANCF-ガイド

RNA

におけるオフターゲット切断の出現推移

Cas9

濃度に依存したオフターゲット切断の増加を示した。FANCF を標的とするガイド

RNA

を用いて、HEK293T

ゲノムを処理した。この処理は異なる

2

人の実験者（A と

B）により独立して行われた。折れ線グラフはオフ

ターゲットの総数（左縦軸）、棒グラフはその内のエクソン内切断数（右縦軸）を示す。

(22)

「図９」SITE-Seq が示すオフターゲット予測の妥当性（AAVS1）

AAVS1

を標的とするガイド

RNA

と

64 nM Cas9

で処理した

HEK293T

ゲノム

DNA

または未処理の同細胞由来の

DNA

を鋳型として、オンターゲットまたはオフターゲット切断領域を含む

DNA

断片をリアルタイム

PCR

で増幅した。

処理

DNA

と未処理

DNA

の

Ct

値差より、標的の切断を評価した。

「図１０」SITE-Seq が示すオフターゲット予測の妥当性（FANCF）

FANCF

を標的とするガイド

RNA

と

64 nM Cas9

で処理した

HEK293T

ゲノム

DNA

または未処理の同細胞由来の

DNA

を鋳型として、オンターゲットまたはオフターゲット切断領域を含む

DNA

断片をリアルタイム

PCR

で増幅した。

処理

DNA

と未処理

DNA

の

Ct

値差より、標的の切断を評価した。

(23)

「図１１」SL26-または

SL28-ガイドRNA

におけるオフターゲット切断の出現推移

Cas9

濃度に依存したオフターゲット切断の増加を示した。

CD163

遺伝子のイントロン領域を標的とする

SL26-

または

SL28-ガイドRNA

を用いて、LLC-PK1 ゲノム（ブタ）を処理した。折れ線グラフはオフターゲットの総

数（左縦軸）、棒グラフはその内のエクソン内切断数（右縦軸）を示す（各

n=1）

。

(24)

(25)

「図

1４」SITE-Seq

が示すオフターゲット予測の妥当性（CD163 遺伝子の第７エクソン）

64nM Cas9

で処理したブタ細胞

LLC-PK1

ゲノム

DNA

または未処理の同細胞由来の

DNA

を鋳型として、オンター

ゲットまたはオフターゲット切断領域を含む

DNA

断片をリアルタイム

PCR

で増幅した。

(26)

「図

1５」開発したSITE-Seq

人工ヌクレアーゼの特異性を調べるアッセイツールの開発 研究分担者

厚生労働科学研究費補助金（食品の安全確保推進研究事業）

「新たなバイオテクノロジーを用いて得られた食品の安全性確保と リスクコミュニケーションのための研究」

分担研究報告書

人工ヌクレアーゼの特異性を調べる in vitro アッセイツールの開発

研究分担者 中村公亮（国立医薬品食品衛生研究所）

研究要旨:

本研究では、ゲノム編集食品の安全性評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅的に推定する

法の有用性について検証を行った。本法を評価するため、近年、イギリスで開発された豚繁殖・

呼吸障害症候群ウィルス（porcine reproductive and respiratory syndrome virus [PRRSV]）抵抗性 ゲノム編集ブタの事例を取り上げた。本研究結果より、オフターゲット予測は、各種オンラインオフタ ーゲット予測ツールを使った

解析だけでは不十分であることが示唆された。相同性データベ ース解析は高確率で生じるオフターゲットを予測するが、そのリストは

の予測を完全にカバ ーできず、実際に起こったオフターゲットの切断を見落としたことを確認した。よって、ガイド

を 設計する際には、まず

解析により最もユニークな配列を選抜した後、そのガイド

の潜在 的なオフターゲットを

の特異性に関する情報集積とそ の制御に貢献できると考える。また、本研究では、ゲノム編集食品を開発する研究者が

法を 容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。

協力研究者 木俣真弥 国立医薬品食品衛生研究所 協力研究者 秋本 智 国立医薬品食品衛生研究所

システムは、RNA-DNA 相互作用を 利用したゲノム編集ツールの一つで、ゲノム編集 の標的ゲノム

に相同な

塩基のガイド

と

ヌクレアーゼとを複合体化して、DNA の 二本鎖切断を誘導することができる。ガイド

と

間の完全な配列の一致は、狙い通りの

切断（オンターゲット）を誘導する一方、その相 互作用の誤認識は意図せぬ

切断 （オフターゲ ット）とそれによる重大な形質変化を招きかねな い。そこで本研究では、ゲノム編集食品の安全性 評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅 的に推定する

法の特異性と再現性につ いて検証を行った。近年、イギリスで開発された 豚 繁 殖 ・ 呼 吸 障 害 症 候 群 ウ ィ ル ス （

げ、本法の有効性について評価した。また、ゲノ ム編集食品を開発する研究者が

法を再 現性良く容易に利用できるよう、 汎用プロトコル とバイオインフォマティックス解析ツールの開 発を行った。

１．培養細胞

ヒト胎児腎由来

細胞とブタ腎臓由来

細胞は、それぞれ

と

リン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液を 含む

培地と

と

レプトマイシン-L-グルタミン溶液を含む

培地を用いて、37℃、

の条件下で培養した。

培養容器は、

スケールのフラスコを用いた。

各細胞の継代は、

日ごとに（50～70%コンフ

ルエント維持）行った。

２．ゲノム

の抽出と精製

または

培養細胞（75 cm

フラ スコ

個分）は、0.5%トリプシン-5.3 mM EDTA 溶液で剥離し、冷却

緩衝液で

回洗浄した。

細胞は

の冷却

で再懸濁し、細胞濃度は 約 2×10

～1×10

とした。

各培養細胞からのゲノム

の抽出と精製は、

カラムとその緩衝液 セット（C1、QBT、G2、GC および

緩衝液）を 用いて行った。細胞懸濁液

に、冷却

緩 衝液

と冷却滅菌水

を添加し、数回の 転倒混和後、氷中で

分間インキュベートした。

1,300×

、4℃, 15 分間の遠心条件で細胞を沈殿 させ、上清を破棄した。冷却

緩衝液

と冷 却滅菌水

を加え、細胞を再懸濁し、上記と 同様の遠心条件により細胞ペレットを得た。G2 緩衝液

と

µL を添加し、

秒間の緩やかな懸濁後、37℃

で

分間インキュベートした。ゲノム

がせ ん断されるため、混和の際は、ボルテックスミキ サーは使用しない（以後、同様） 。さらに、

溶液を 200 µL 添加し、50℃で

人工ヌクレアーゼの特異性を調べるアッセイツールの開発研究分担者

「新たなバイオテクノロジーを用いて得られた食品の安全性確保とリスクコミュニケーションのための研究」

研究分担者中村公亮（国立医薬品食品衛生研究所）

呼吸障害症候群ウィルス（porcine reproductive and respiratory syndrome virus [PRRSV]）抵抗性ゲノム編集ブタの事例を取り上げた。本研究結果より、オフターゲット予測は、各種オンラインオフターゲット予測ツールを使った

解析だけでは不十分であることが示唆された。相同性データベース解析は高確率で生じるオフターゲットを予測するが、そのリストは

の予測を完全にカバーできず、実際に起こったオフターゲットの切断を見落としたことを確認した。よって、ガイド

を設計する際には、まず

の潜在的なオフターゲットを

の特異性に関する情報集積とその制御に貢献できると考える。また、本研究では、ゲノム編集食品を開発する研究者が

法を容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。

協力研究者木俣真弥国立医薬品食品衛生研究所協力研究者秋本智国立医薬品食品衛生研究所

システムは、RNA-DNA 相互作用を利用したゲノム編集ツールの一つで、ゲノム編集の標的ゲノム

ヌクレアーゼとを複合体化して、DNA の二本鎖切断を誘導することができる。ガイド

切断（オンターゲット）を誘導する一方、その相互作用の誤認識は意図せぬ

切断（オフターゲット）とそれによる重大な形質変化を招きかねない。そこで本研究では、ゲノム編集食品の安全性評価法の一つとしてオフターゲット部位を網羅的に推定する

法の特異性と再現性について検証を行った。近年、イギリスで開発された豚繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（

げ、本法の有効性について評価した。また、ゲノム編集食品を開発する研究者が

法を再現性良く容易に利用できるよう、汎用プロトコルとバイオインフォマティックス解析ツールの開発を行った。

リン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液を含む

フラスコ

で再懸濁し、細胞濃度は約 2×10

カラムとその緩衝液セット（C1、QBT、G2、GC および

緩衝液）を用いて行った。細胞懸濁液

緩衝液

を添加し、数回の転倒混和後、氷中で

、4℃, 15 分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、上清を破棄した。冷却

と冷却滅菌水

を加え、細胞を再懸濁し、上記と同様の遠心条件により細胞ペレットを得た。G2 緩衝液

がせん断されるため、混和の際は、ボルテックスミキサーは使用しない（以後、同様）。さらに、

で平衡化した

に対して、10.5 mL のイソプロパノールを添加し、

が凝集するまで転倒混和した。13,000×

を洗浄し、遠心後、上清を破棄した。溶液は完全に取り除き、

が乾燥する前に、合計 100 µL の滅菌水で

を溶解させた。白濁の沈殿物は溶解しないため、遠心分離で除去した。

分間インキュベートした。

溶液は室温まで冷却し、その濃度を

滅菌水を用いて、375 ng/µL（HEK293T）または 250 ng/µL（LLC-PK1）に再調製し、使用するまで 4℃に保存した（長期保存はせず、数日以内に使用）。

の品質は、1%（w/v）アガロースゲル電気泳動で評価した。

ガイド

の合成と精製には、

を用いた。付属プロトコルに従い、本検討では、長鎖型の

を合成した。まず、ガイド

合成の鋳型となる二本鎖

を作成するため、次のプライマーを合成した。Primer-Forward: 5’-CG ATG TAA TAC GAC TCA

塩基；「X」

と「Y」は相補塩基とする；下線はオーバーラップする領域）。「表

（4 µL）、

µL）、10 µM primer-reverse （5 µL）、Herculase

（1 µL）、DW （28 µL）。この反応液を 95℃で

分間、最後に 72℃で

製し、吸光度測定結果をもとに、1 µM に再調製した。

を合成するために、次の反応液（20 µL/反応）を調製した：DPEC water（7.5 µL）、5x

（5 µL）、

（1 µL）、

（1 µL）、rGTP（1 µL）、rUTP（1 µL）、0.75 M DTT

（1 µL）、

（0.5 µL）、

、T7 RNA polymerase（1 µL）。この反応液に 1 µM 鋳型

時間インキュベートした。

分間インキュベートした。十分量のガイド

を得るため（50 µM 以上）、一種類のガイド

あたり、4 反応分（100 µL）調製し、キット付属のプロトコルに従い精製した。ただし、次の工程を改良した：