PLD4 欠損マウス脳の組織学的解析

論文 内 容の 要旨

ヒ ト の 脳 は ，神 経 細 胞 と ほ ぼ 同 数 の グ リ ア 細 胞 で 構 成 さ れ て お り ，中 枢 神 経 系 の グ リ ア 細 胞 に は ， ア ス ト ロ サ イ ト ， オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 及 び ミ ク ロ グ リ ア が あ る ． グ リ ア 細 胞 の 中 で 大 部 分 を 占 め る ア ス ト ロ サ イ ト は 放 射 状 の 突 起 を 持 ち ， 中 枢 神 経 内 微 小 環 境 の 複 雑 な 調 整 を 行 う こ と が 知 ら れ て い る ． オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト は 膜 の 多 重 層 構 造 で あ る ミ エ リ ン (髄 鞘 ) を 神 経 細 胞 の 軸 索 上 に 一 定 の 間 隔 で 形 成 し ， 跳 躍 伝 導 に 加 え 様 々 な 神 経 細 胞 の 活 動 に 関 与 し て い る ． ミ ク ロ グ リ ア は 脳 の 免 疫 担 当 細 胞 と し て 殺 菌 ・ 細 胞 傷 害 性 を 示 し ， 異 物 や 残 骸 の 除 去 を 行 う と 考 え ら れ て い る ． 特 に ， ミ ク ロ グ リ ア は 様 々 な 神 経 系 の 病 態 に 関 与 す る こ と か ら ， 中 枢 神 経 疾 患 の 治 療 の タ ー ゲ ッ ト と し て 注 目 さ れ て い る ． 通 常 は 静 止 期 ミ ク ロ グ リ ア あ る い は ラ ミ フ ァ イ ド ミ ク ロ グ リ ア と 呼 ば れ ， 脳 内 に 均 等 に 分 布 し ， 分 岐 し た 細 く 長 い 突 起 を 持 ち ， 周 囲 の 環 境 を 監 視 す る よ う に 突 起 を 動 か し て い る ． 脳 組 織 で 発 生 し た 異 常 を 感 知 す る と 突 起 を 退 縮 さ せ ， 細 胞 体 が 大 き く 丸 く 変 化 し 活 性 化 状 態 へ と 変 化 す る ． 活 性 化 さ れ た ミ ク ロ グ リ ア は 分 裂 ・ 増 殖 し ， さ ら に 遊 走 性 を 獲 得 す る ． こ の 状 態 の ミ ク ロ グ リ ア は ア メ ボ イ ド ミ ク ロ グ リ ア と 呼 ば れ ， 病 変 部 へ 遊 走 し 貪 食 作 用 を 発 揮 す る (Fig. 1)． Phospholipase D (PLD) は ， 細 胞 膜 構 成 主 要 リ ン 脂 質 の ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン を ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸 と コ リ ン に 加 水 分 解 す る 酵 素 で あ る ．こ の PLD は 一 次 配 列 の 相 同 性 か ら フ ァ ミ リ ー を 形 成 し て い る ．古 典 的 な タ イ プ の PLD1 及 び PLD2 は 白 ち ば て る ま さ 氏 名 （ 本 籍 ） 千 葉 輝 正 （ 東 京 都 ） 学 位 の 種 類 博 士 （ 薬 学 ） 学 位 記 番 号 博 第 274 号 学位授与の日付 平 成 28 年 7 月 20 日 学位授与の要件 学 位 規 則 第 4 条 第 1 項 該 当 学 位 論 文 題 目 PLD4 欠 損 マ ウ ス 脳 の 組 織 学 的 解 析

Fig. 1 The three states of microglia.

(modified from Neuroglia pp.86, 1995)

A 論 文 審 査 委 員 E

血 球 の 走 化 性 や 食 作 用 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る ． 一 方 ， 新 し い 膜 貫 通 タ イ プ と し て PLD3 と PLD4 な ど が 存 在 す る ．PLD3 は ，遅 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 と の 関 連 が 示 唆 さ れ て い る ． PLD4 は ， 生 後 初 期 の 発 達 段 階 に お い て ， 脳 白 質 で 活 性 化 す る ミ ク ロ グ リ ア に 選 択 的 に 発 現 し ， 増 殖 お よ び 貪 食 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る ． ま た ， ミ エ リ ン が 崩 壊 す る 脱 髄 病 態 時 に 病 巣 近 傍 で 活 性 化 す る ミ ク ロ グ リ ア で も 発 現 の 増 加 が 明 ら か に さ れ て い る (Otani et al., PLoS One, 2011). し か し な が ら ，PLD4 は ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン を ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸 へ と 加 水 分 解 す る 古 典 的 タ イ プ が 持 つ 酵 素 活 性 を 示 さ な い た め ， そ の 機 能 は 未 だ 不 明 で ， 発 達 過 程 及 び 病 態 時 の 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア に お け る 役 割 に つ い て も 明 ら か に さ れ て い な い ． そ こ で 本 研 究 で は 脳 発 達 期 や 白 質 病 変 時 の PLD4 の 機 能 を 明 ら か に す る た め ，PLD4 欠 損 マ ウ ス を 用 い て 小 脳 を 中 心 に 組 織 学 的 な 解 析 を 行 っ た ． PLD4 欠 損 マ ウ ス に お け る 発 達 期 小 脳 の 解 析 PLD4 欠 損 マ ウ ス は ，PLD4 遺 伝 子 の 翻 訳 開 始 コ ド ン の 前 に STOP 配 列 が 挿 入 さ れ て い る た め ， ホ モ 接 合 体 (Ho) で PLD4 を 発 現 し な い マ ウ ス で あ る (Fig. 2)． 生 後 7 日 齢 の 脳 の ヘ マ ト キ シ リ ン − エ オ ジ ン (HE) 染 色 で は ， 脳 全 体 の 構 造 や 小 脳 の 層 構 造 に お い て PLD4 欠 損 に よ る 影 響 は 観 察 さ れ な か っ た ． そ こ で 発 達 過 程 の 小 脳 白 質 で PLD4 を 特 異 的 に 発 現 す る ミ ク ロ グ リ ア の 状 態 を 観 察 す る た め ， 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア の 指 標 と な る Iba1 に 対 す る 抗 体 を 用 い て ， 生 後 5 日 (P5) お よ び 7 日 (P7) の 小 脳 で ，発 達 時 期 が 早 い 深 部 白 質 と そ れ よ り も 遅 れ て 発 達 す る 小 葉 先 端 部 白 質 を そ れ ぞ れ 比 較 し た ．そ の 結 果 ，野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス 共 に P5 と 比 較 し て P7 に お い て ， 深 部 白 質 よ り も 小 葉 先 端 部 白 質 で ア メ ボ イ ド 状 の Iba1 陽 性 細 胞 数 が 増 加 し て い た ．特 に ， P5 お よ び P7 の 深 部 白 質 に お け る 個 々 の 細 胞 の Iba1 陽 性 強 度 を 定 量 的 に 比 較 し た と こ ろ ，野 生 型 よ り PLD4 欠 損 マ ウ ス に お い て Iba1 陽 性 強 度 が 有 意 に 高 い こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 3)．

Fig. 1 The three states Fig. 2 Genome structure of

Iba1 陽 性 ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 は ， 主 に 炎 症 促 進 性 の M1 ミ ク ロ グ リ ア と 抗 炎 症 性 の M2 ミ ク ロ グ リ ア の 2 タ イ プ に 分 け ら れ る ． そ こ で PLD4 を 欠 損 し た 小 脳 白 質 に 存 在 す る 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア の 表 現 型 が 野 生 型 と 異 な る か ど う か を 調 べ る た め ，M1 タ イ プ の マ ー カ ー で あ る CD68 と M2 タ イ プ の マ ー カ ー で あ る arginase 1 に 対 す る 抗 体 を 用 い ，そ れ ぞ れ Iba1 抗 体 と の 免 疫 二 重 染 色 を 行 っ た ．そ の 結 果 ， 深 部 白 質 に 局 在 す る 全 て の Iba1 陽 性 細 胞 は CD68 陽 性 で あ り ，各 々 の CD68 陽 性 細 胞 の 輝 度 は ，野 生 型 に 比 べ て PLD4 欠 損 マ ウ ス で 有 意 に 減 少 し て い た (Fig. 4)． arginase 1 に 関 し て は ， 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス 共 に 陽 性 シ グ ナ ル は 認 め ら れ な か っ た ． 以 上 の こ と か ら ， 発 達 過 程 の 小 脳 に 存 在 す る ア メ ボ イ ド 状 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は CD68 陽 性 の M1 タ イ プ の 性 質 を 持 つ が ，PLD4 欠 損 に よ り CD68 の 発

現 は 抑 制 さ れ る こ と が 分 か っ た ． _{Fig. 3 Microglial activation}

in the cerebella of

PLD4-deficient mice at P7. Iba1-positive microglia in deep white matter (A, B) or folial white matter (C, D) of the cerebella obtained from wild type (WT; A, C) and PLD4-deficent (Ho; B, D) mice. Bar: 100 µm (D), 10 µm (in the white squares in D).

(E) Intensities of Iba1

immunoreactivity in

individual cells of the deep cerebellar white matter at P7. Graph indicates the mean ± SEM. **P<0.01 by student t test.

Fig. 3 Microglial activation

in the cerebella of

PLD4-deficient mice at P7. Iba1-positive microglia in deep white matter (A, B) or folial white matter (C, D) of the cerebella obtained from wild type (WT; A, C) and PLD4-deficent (Ho; B, D) mice. Bar: 100 µm (D), 10 µm (in the white squares in D).

(E) Intensities of Iba1

immunoreactivity in

individual cells of the deep cerebellar white matter at P7. Graph indicates the mean ± SEM. **P<0.01 by student t test. Fig. 4 CD68 immunoreactivity of cerebellar microglia in PLD4-deficient mice. Double-labeling of cells by

anti-Iba1 and anti-CD68

antibodies in the deep

一 方 ， 小 脳 の 発 達 過 程 で 活 性 化 す る ア ス ト ロ サ イ ト の 状 態 お よ び 小 脳 皮 質 か ら の 唯 一 の 出 力 系 で あ る プ ル キ ン エ 細 胞 の 発 達 に 対 し て も PLD4 欠 損 の 影 響 に つ い て 調 べ た ． そ の 結 果 ， ア ス ト ロ サ イ ト の 活 性 化 指 標 マ ー カ ー で あ る GFAP の 陽 性 像 お よ び プ ル キ ン エ 細 胞 特 異 的 マ ー カ ー で あ る calbindin の 陽 性 像 に PLD4 欠 損 は 影 響 し な い こ と が 示 さ れ た ． ミ エ リ ン 形 成 に 対 す る PLD4 欠 損 ミ ク ロ グ リ ア の 影 響 抗 Iba1 抗 体 と ミ エ リ ン マ ー カ ー の MBP に 対 す る 抗 体 を 用 い た 野 生 型 で の P7 小 脳 の 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 像 か ら ， ミ エ リ ン 形 成 直 前 の オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 近 く に 活 性 化 し た ア メ ボ イ ド 状 ミ ク ロ グ リ ア が 多 数 局 在 し て い る こ と が 示 さ れ た ． こ の ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 と ミ エ リ ン 形 成 開 始 の タ イ ミ ン グ か ら PLD4 欠 損 に よ る ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 状 態 の 変 化 が ， ミ エ リ ン 形 成 に 影 響 し て い る と 考 え ら れ た ． そ こ で ，P5, 7 お よ び 10 の 小 脳 の 凍 結 切 片 を 用 い て 抗 MBP 抗 体 に よ る 免 疫 組 織 染 色 を 行 っ た (Fig. 5)． そ の 結 果 ， P5 の 野 生 型 で は MBP 陽 性 有 髄 線 維 が 深 部 白 質 に 見 ら れ た の に 対 し(Fig. 5A’白 矢 印 )， PLD4 欠 損 マ ウ ス で は MBP 陽 性 ミ エ リ ン は ほ と ん ど 認 め ら れ ず ，細 胞 体 が MBP 陽 性 を 示 す ミ エ リ ン 形 成 前 の オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト が 多 く 観 察 さ れ た(Fig. 5B’白 矢 頭 )． P7 の 小 葉 部 に お い て も 同 様 の 変 化 が 観 察 さ れ た (Fig. 5C’白 矢 印 , 5D’白 矢 頭 )． P10 で は 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス の 小 脳 で ，こ の よ う な 差 異 は 認 め ら れ な か っ た ．以 上 の 結 果 か ら ，PLD4 欠 損 マ ウ ス で は 野 生 型 と 比 べ て ミ エ リ ン 形 成 が 遅 延 す る が ， P10 で は 野 生 型 に 近 づ く 可 能 性 が 示 さ れ た ． 次 に ，PLD4 欠 損 マ ウ ス の ミ エ リ ン 形 成 の 遅 延 と オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 分 化 と の 関 連 を 調 べ る た め に 代 表 的 な 分 化 マ ー カ ー を 用 い て 解 析 し た ． オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 数 の 小 脳 に お け る 変 化 を オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 系 譜 細 胞 を 染 め る 抗 Olig2 抗 体 を 用 い て 調 べ た と こ ろ ，P5 と P7 共 に 深 部 白 質 に お け る Olig2 陽 性 細 胞 数 に 違 い は 見 ら れ な か っ た ．幼 若 な オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト マ ー カ ー で あ る 抗 NG2 抗 体 A B A B Fig. 5 Influence of PLD4 deficiency on cerebellar myelination. Comparison of MBP immunoreactivity in

the P5 cerebellar deep white matter tracts (WT, A; Ho, B) or the

P7 cerebellar folial

で 比 較 し て も 違 い は 見 ら れ な か っ た ． 一 方 ， 成 熟 オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 出 現 を CC1 抗 体 を 用 い て 比 較 し た と こ ろ ，CC1 陽 性 細 胞 は 野 生 型 で は 深 部 白 質 か ら 小 葉 先 端 部 ま で 広 く 存 在 し て い た の に 対 し て PLD4 欠 損 マ ウ ス で は 深 部 白 質 を 中 心 に 存 在 し 小 葉 内 で は 少 な か っ た ． こ れ ら の 結 果 か ら ，PLD4 欠 損 マ ウ ス で は オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 系 譜 細 胞 の 総 数 お よ び 幼 若 な オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 数 に は 大 き な 違 い は な く ， オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 成 熟 が 遅 れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た ． ク プ リ ゾ ン 投 与 後 の PLD4 欠 損 マ ウ ス の 解 析 さ ら に 脱 髄 病 態 に お け る PLD4 欠 損 の 影 響 を 調 べ る た め に ，成 熟 し た マ ウ ス に 5 週 間 0.2%ク プ リ ゾ ン 含 有 飼 料 を 与 え ， 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス 脳 梁 の 組 織 染 色 に よ り 脱 髄 状 態 を 比 較 し た ．そ の 結 果 ，ク プ リ ゾ ン 投 与 後 5 週 目 に お い て PLD4 の 欠 損 に よ り 見 か け 上 の 脱 髄 が 軽 減 さ れ る こ と を 明 ら か に し た ．抗 Iba1 抗 体 と 抗 MBP 抗 体 を 用 い た 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 の 結 果 か ら ，ク プ リ ゾ ン 投 与 後 に お い て ， 野 生 型 と は 異 な り PLD4 欠 損 マ ウ ス で は MBP 染 色 像 が よ り 残 っ て お り ， 太 く 丸 い 活 性 化 し た ア メ ボ イ ド 状 の ミ ク ロ グ リ ア が 多 数 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． 総 括 以 上 ，本 研 究 の 結 果 か ら ，PLD4 欠 損 は プ ル キ ン エ 細 胞 や ア ス ト ロ サ イ ト に は 明 ら か な 影 響 は 与 え な い も の の ， ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 状 態 に 影 響 し ， ミ エ リ ン 形 成 や 脱 髄 に 変 化 を 生 じ さ せ る こ と が 示 さ れ た ． 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は ミ エ リ ン 形 成 開 始 時 期 の 決 定 や 脱 髄 病 態 と 密 接 に 関 連 し ， こ の 過 程 に PLD4 が 関 与 す る こ と を 明 ら か に し た ． 【 研 究 成 果 の 掲 載 誌 】