炎 症VOL 5 No.2SPRING 1985 89 JAPANESE JOURNAL OF INFLAMMATION
review article
顆粒 球の機能 と代謝
-ス ー パ ー オ キ シ ドア ニ オ ソ の 生 成 お よ び そ の 調 節 機 構 に つ い
て-住 本英 樹 ・竹 重 公 一朗 ・水 上 茂樹*
Metabolism and function of granulocytes; Superoxide production and its regulation Phagocy-tosis or the interaction of certain agents with membrane receptors results in greatly enhanced rates of leucocytes oxygen metabolism (respiratory burst) and production of active oxygens such as superoxide (O-2) which rapidly dismutes to yield hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radicals (OH.). Active oxygens produced are used to generate powerful microbicidal agents such as hypochlorous acid (HOCl). The respiratory burst results from the activation of an enzyme (NADPH oxidase), dormant in resting cells, which catalyzes the following reaction: NADPH+2O-2•¨2O-2+NADP++H+. The oxidase is considered to be an FAD-requiring enzyme. Cytochrome b558 which is found uniquely in phagocytes is also proposed to be an electron carrier. The mechanism by which the oxidase is activated on stimulation of the cells is not clearly understood. Many informations, however, have been gathered concerning the activation event. Calcium ion is essential for the activation and protein phosphorylation by protein kinase C which is activated by diacylglycerol, produced through phosphatidylinositol turnover, appears to be involved in the activation reaction. Cyclic AMP and the products of arachidonic acid cascade regulate the superoxide production.
Hideki Sumimoto • Koichiro Takeshige • Shigeki Minakami * *The 2 nd Department of Biochemistry
, Kyushu University, School of Medicine key words: granulocyte, superoxide anion, NADPH oxidase
19世 紀末 にMetchinikoffが 食 作 用 の 考 え を 出す ま で は,白 血 球 は細 菌 増 殖 の 場 で あ り,細 菌 を全 身 に散 布す る も の で あ る とい うのが 病 理 学 の 常 識 で あ った.彼 は細 胞 内殺 菌 作 用 を 重 視 した の だ が,細 胞 内 水解 酵 素 や 殺 菌 性 物 質 の殺 菌能 が 低 い こ とな どか ら,半 世 紀 以上 にわ た り生 体 防 御 機 構 と して の 食 作 用 は二 次 的 な意 義 しか 与 え られ な か った.し か し,最 近10数 年 間 に 白血 球 の殺 菌 機 能 の重 要 性 が,慢 性 肉 芽 腫 症 の 研 究や 活性 酸 素 の研 究 に よ り認 識 され る よ うに な った.そ れ は,細 胞 内殺 菌 で重 要 な 役 割 を 果 た して い るの は 活 性酸 素 で あ る こ とが 明 ら か とな った か らで あ る. 本 総 説 では,白 血 球 特 に 顆 粒 球 に よる活 性 酸 素,特 に ス ーパ ー オキ シ ドア ニオ ン(OZ)の 生 成,お よび そ の 調 節 機 構 につ い て 最 近 の 知 見 を 中 心 に 紹 介 した い と 思 う.な お,成 書1,2),雑 誌 の特 集 号3),総 説4-6)な ど も併 せ て 参 照 され た い. 1.顆 粒 球 に お け る殺 菌 機 構 異 物 の組 織 内侵 入 に 対 して,生 体 は 多 くの 防御 機 構 を 備 えて い る.普 遍 的 に 存 在 す る 非 特 異 的 な 体 液 性 因子 (リ ゾチ ー ムな ど),異 物 侵 入 局 所 で 活性 化 され,あ る い は 産 生 され る非 特 異 的 防御 因 子(補 体 や イ ソタ ー フ ェ ロ ン),血 液 や 組 織 に存 在 す る食 細胞(顆 粒 球,単 球,お よび マ ク ロ フ ァ ージ)やNK細 胞 な どの 非 特 異 的 な 細
胞 性 因 子,primitive T cell response,お よ び ク ロー ン
的 免 疫 が そ れ で あ る7).こ の な か で 食 細 胞 は 微 生 物 を 細 胞 内 に 取 り込 み,こ れ を殺 菌 す る. 食 細 胞 が微 生物 な どの殺 菌 を行 う過 程 はつ ぎ の よ うな もの で あ る.ま ず 食 細 胞 は 化 学 因子 の 濃 度 勾 配 を 認 識 し,微 生物 の方 向へ 遊 走 す る (chemotaxis).つ ぎに 食 細 胞 は 微 生 物 を 細 胞 内 に取 り込 み,食 胞(phagosome) を 形成 す る(phagocytosis).食 胞 内 に取 り込 まれ た 微 生 物 は 殺菌 分解 され る のだ が,そ の 過 程 は2つ に 大 別 され る1)(表1).一 つ は 脱 顆 粒(degranulation)と よば れ る 系 で酸 素 に 依存 しない.食 胞 は 白血 球 内 に存 在 す る ア ズ ール顆 粒(ミ エ ロペ ル オ キ シ ダ ー ゼ,酸 性 ホス フ ァ タ ー ゼ ,β 一グル クロニダーゼ,数 種 の塩基 性蛋 白質な どを 含 む)お よび 特殊 顆 粒(ア ル カ リ性 ホ ス フ ァタ ーゼ,ラ ク トフ ェ リソ,リ ゾチ ー ム な どを 含 む)と 融 合 し,phago-lysosomeを 形 成 し,顆 粒 内容 物 が 放 出 され,微 生 物 は 殺 菌 分 解 さ れ る.ま た,脱 顆 粒 時 に 食 胞 内 のpHを 著 し く(約pH4ま で)低 下 す る.も う一 つ の 過 程 は, *九 州大 学 医学 部 生 化 学 第 二 教 室
90炎 症VOL.5 NO.2 SPRING 1985 休 止期 の 食 細胞 に はみ られ ない 活 性 酸 素(02,H202, OH・ な ど)の 生 成 であ る.こ の 過 程 の 重 要 性 は,活 性 酸 素 を生 成 で き ない 白血 球 を もつ 慢 性 肉 芽 腫 症(chronic granulomatous disease,CGD)患 者 で は,乳 幼 児 よ り重 篤 な感 染 症 を 繰 り返 す こ とか らも理 解 で き る. 酸 素 依存 性 の殺 菌 にお い て 強 力 な 殺 菌 能 を 有 す る と考 え られ る のは,次 亜 塩 素 酸(HOC1)と ヒ ドロキ シ ラ ジ カル(OH・)で あ り,そ れ らは02を 出 発 物 質 と して い る(図1).食 作 用 時 に は02生 成 酵 素(NADP H oxidase)が 活 性 化 され,酸 素 分 子 は1電 子 還 元 を 受 け 02が 生 成 す る.こ の と きNADPHが 消 費 され る.
202十NADPH→ NADPH oxidase 202十NADP+十H+ (1) こ の 食 作 用 時 に み られ る 急 激 な02消 費 はrespiratory burstと 呼 ば れ て い る.生 じた02は 不 均 化 反 応 に よ り速 や か に02とH202を 生 成 す る8)(こ の 反 応 は ス ー パ ー オ キ シ ド ジ ス ム タ ー ゼ(supcroxide dismutasc,SO D)に よ り促 進 さ れ る). 202+2H+spontaneous→H2O2+02(2) こ の と き 同 時 に,02生 成 性NADPHoxidaseお よ び 細 胞 質 の グ ル タ チ オ ン 依 存 性H202解 毒 系 に よ り消 費 さ れ たNADPHの 再 生 の た め に,五 炭 糖 リ ン 酸 回 路 (hexose monophosphate shunt,HMP 回 路)に よ る グ ル コ ー ス ー6一リ ン 酸 の 酸 化 が 増 加 す る(図2). 殺 菌 へ の02自 身 の 関 与 は 否 定 的 で あ り,H202も そ れ だ け で は 殺 菌 能 は 小 さ い と 考 え ら れ て い る.し か し, H202は ミエ ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(MPO)の 作 用 に よ り ハ ロ ゲ ン イ オン を 酸 化 し,強 力 な 殺 菌 物 質 を 生 成 す る. ち な み に,こ の よ う な ペ ル オ キ シ ダ ー ゼH202系 の 殺 菌 作 用 の 先 駆 的 研 究 は,本 邦 に お い て1931年 に 報 告 さ れ て い る9).MPOに よ りH202とCl-か ら生 じる 強 力 な 酸 化 剤 は,次 亜 塩 素 酸(HOC1)で あ る こ と が わ か っ て い る. C1-十H202→MPO HOC1十 〇H-(3) HOC1は,そ れ 自 身 で 種々 の 生 物 分 子 を 攻 撃 す る ほ か に,低 分 子 ア ミン と反 応 し て 殺 菌 作 用 を 有 す る ク ロ ラ ミ ン 類 を 生 成 す る10). R-NH2十HOCl→R-NHC1十H20 こ の 好 中 球 や 単 球 に お け る も っ と も 強 力 な 殺 菌 系 と 考 え られ るMPO-H20一 ハ ロ ゲン イ オ ン(X-)系 は,MPO をFe2+に か え て も 強 力 な 殺 菌 能 を 有 す る こ と がcell-free 系 で 確 か め られ て お り,次 式 に 従 う も の と 考 え られ て い る. Fe2+ 〓 02とH202か ら生 じ る も う一 つ の 強 力 な 酸 化 剤 と考 表1白 血 球 の 殺 菌 機 構 図1活 性酸 素 の生 成機 構 図 中 の 番 号 は 本 文 中 の 反応 式 の 番 号 を示 す. え ら れ る の は ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル(OH・)で あ る.OH・ は,金 属 イ オ ン(特 にFe,ほ か にCu)の 共 存 下 で02と H202か ら 生 成 さ れ る(金 属 イ オ ン 触 媒 のHaber-Weiss 反 応). 〓も う一 つ のOH・ 生 成 系 と し て 次 式 が 提 出 さ れ て い る. HOCl十 〇2→OH・ 十〇2十Cl-(6)
HO・ がrespiratory burst時 に 実 際 に 生 成 さ れ て い る こ と は 電 子 ス ピ ン共 鳴 ス ペ ク トル(ESR)測 定 か ら強 く示 唆 さ れ て い る が,異 論 も あ る5). 活 性 酸 素 の 一 つ で あ る1重 項 酸 素(102)もrespira-tory burst時 に 生 成 さ れ る と 考 え ら れ た が,現 在 の と こ ろ 確 証 は 得 ら れ て い な い. II.respiratory burstの 測 定 respiratory burstの 定 量 は,一 般 に(1)02消 費,(2) cytochrome c還 元 に よ る02生 成,(3)化 学 発 光 な ど の 測 定 に よ り行 わ れ る(図3). (1)02消 費(oxygen consumption) 02消 費 測 定 に はWarburgマ ノ メ ー タ ー 法 と 酸 素 電 極 法 が あ り,respiratory burstの 測 定 に は 酸 素 電 極 法 が よ く用 い られ る2)。 末 梢 血 全 血 を 用 い て 白 血 球 のO2消 費 を 測 定 す る 微 量 測 定 法 も あ る11).
炎 症VOL.5 NO.2 SPRING 1985 91
図2殺 菌機 構 とそれ に伴 う代 謝 変 化
図3 respiratory burst の 測 定 CL: chemiluminescence
LDCL : luminol-dependent chomiluminescence
(2)O2生 成(generation of superoxide anion) 02生 成 は,cytochrome cが02に よ り 還 元 さ れ た と き の550nmの 吸 光 増 加 に よ り測 定 す る12). cytochrome c (Fe3+)十O2 →cytochrome c (Fe2+)十O2 こ の 還 元 がSODで 阻 害 さ れ れ ば,02に よ る も の と 考 え られ る わ け で あ る. 2波 長 分 光 光 度 計 を 用 い550-540nmの 吸 光 増 加 に よ り測 定 す れ ば,試 料 の 濁 りやferricytochrome cに よ る 吸 光 な ど の 影 響 が 少 な く微 量 の 試 料 で わ ず か な 変 化 を 測 定 で き る2,13).こ れ は 全 血10μlを 用 い た 高 感 度 で 簡 便 な CGD診 断 法 に も 応 用 さ れ て い る14).ま たcytochrome cの 代 わ り にacctylated cytochrome cを 用 い る と,自 動 酸 化 が 少 な く ま た 反 応 の 特 異 性 も 上 が る15). 02生 成 能 の 測 定 法 と して 臨 床 検 査 室 な ど で 用 い ら れ る 方 法 にnitrobluetetrazolium(NBT)還 元 能 を み る 方 法 が あ り,簡 便 法 な ども知 られ てい る2).し か し 反 応 の 特 異性 に 問 題 が あ り,注 意 を要 す る. (3)化 学 発光(chemiluminescence) 好 中球 は食 作 用 時 に微 弱 な発 光 が み られ るが,好 中 球 刺 激 時 の 可視 部 の総 化 学 発 光(CL)は,02の 測 定 値 との 時 間的 経 過 が パ ラ レル で あ る こ とか ら02生 成 を 反 映 して い る と考 え られ る5).し か し このCLは 微 弱 で あ るた め,luminolを 添 加 して の 測 定 が よ く用 い られ て い る(lumino1依 存 性 化 学 発 光,LDCL).こ のLDCL も一 般 にrcspiratory burstを 反 映 した もの と 考 え られ て い る.し か し,opsonized zymosan刺 激 時 のLDCL は,02消 去 剤 で あ るSODに よ り ほ とん ど 阻害 され ず(注;SODで 部 分 的 に 抑 制 され る とい う 報 告 が 多 い)MPO阻 害 剤 で あ るNaN3や 反 応 液 か らC1-を 除 去 す る こ とに よ り ほ ぼ 完 全 に 抑 制 され る こ と,MPO 欠 損 症 の 白血 球 で は 刺 激 時 にLDCLを 示 さな い こ とお よびHOClはluminolを 酸 化 し励 起 種 を 生 じる こ とな どか ら,LDCLは02よ りもMPO-H202-Cr系 に よ るHOCIの 生 成 を 反 映 して い る もの と考 え られ る5).
またxanthine oxidase系 に よ る02生 成 時 お よびNaF
刺 激 に よ る 脱 顆 粒(し た が ってMPO遊 離)を 伴 わ な い 顆 粒 球 の02-生 成 時 に はCLは ほ とん どみ られ な い こ とが 報 告 され て い る.い ず れ に せ よLDCLに よ る測 定 は02生 成 を 直 接 反 映 して い な い の で 注 意 を要 す る. 以 上 の ほ か に も よ く用 い られ るH202の 測定 法 につ い て は 他 の 文 献2)を 参 照 され た い. III.02生 成系 の活 性 化機 構 食 作 用 時 の 呼 吸増 大(respiratory burst)は1933年 に
92炎 症VOL.5 NO.2 SPRING 1985 発 見 さ れ た16)が,こ れ は シ アン に よ り阻 害 さ れ な い(シ ア ン 耐 性 呼 吸)の で ミ トコン ド リア の 呼 吸 と 異 な り, ま た こ の と きHMP回 路 が 活 性 化 さ れ る こ と17)が わ か る ま で 四 半 世 紀 を 要 し た.そ し てrespiratory burst時 にH202が 生 成 さ れ る こ と が 示 さ れ 殺 菌 と 結 び つ け ら れ た の は1961年 の こ と で あ っ た18). 最 初 に 食 作 用 時 に02が 生 成 さ れ る の が 示 さ れ た の は 顆 粒 球12)で あ った が,そ の 後 単 球,マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 好 酸 球 で も02生 成 が 起 こ る こ とが 報 告 さ れ た. 本 章 で は 主 と し て 顆 粒 球 に よ るOZ生 成 系 の 活 性 化 機 構 に つ い て 述 べ る.な お,顆 粒 球 と は 好 中 球,好 酸 球 お よ び 好 塩 基 球 の 総 称 で あ る が,特 に 断 わ ら な い 限 り は 好 中 球 が 大 部 分 を 占 め て い る の で(普 通95%以 上),好 中 球 と 同 義 語 と し て 用 い て い る.ま た 多 形 核 白 血 球 も 同 様 に 考 え て 頂 き た い. 顆 粒 球 は 細 菌 な ど の 食 作 用 時 ば か りで な く,種々 の 刺 激 剤 に よ り活 性 化 さ れ02を 生 成 す る.こ の 活 性 化 に は 複 数 の 経 路 が 存 在 す る が19),最 終 的 に は 共 通 の 経 路 を 経 て20),同 一 の02生 成 酵 素(NADPH oxidase)が 活 性 化 さ れ る21)と 考 え ら れ て い る.ま た02生 成 系 の 活 性 化 機 構 に は 次 の よ う な 特 徴 が あ る こ と が 知 られ て い る.(i)可 逆 性.NaF22),ア ラ キ ド ン 酸23),conca-navalin (Con-A)A24)刺 激 時 の02生 成 で 可 逆 性 が 示 さ れ て い る.た だ し,Con-A再 刺 激 時 の02-生 成 で は そ のCa2+要 求 性 な ど が 変 化 す る24).(ii)エ ネ ル ギ ー を 必 要 と す る25).(iii)食 作 用 に 依 存 し な い.可 溶 性 の 刺 激 剤 は 食 作 用 を 伴 わ な いOZ生 成 を 引 き 起 こ す.ま た サ イ トカ ラ シ ンB(Cyt-B)で 食 作 用 を 抑 制 し て もOZ生 成 は 抑 制 さ れ な い.(iv)脱 顆 粒(リ ソ ゾ ー ム 酵 素 の 放 出)を 必 要 と し な い.NaF刺 激 に よ る02 生 成 は 脱 顆 粒 を 伴 わ な い22).Cytoplast(後 述)を 刺 激 す る と02生 成 は 起 こ る が 脱 顆 粒 は み られ な い26). 陰 イ オ ン チ ャ ン ネ ル 阻 害 剤 に よ り脱 顆 粒 は 阻 害 さ れ る が 02生 成 は 抑 制 さ れ な い27).一 方p-diazobenzene-sulfonic acidは02生 成 は 阻 害 す る が 脱 顆 粒 は 抑 え な い28).(v)凝 集 を 必 要 と し な い.た と え ばlipoxin A29), endotoxin30)は02生 成 を 誘 導 す る が,顆 粒 球 の 凝 集 は 引 き 起 こ さ な い.走 化 性 ペ プ チ ドN-formyl-methionyl-1eucyl-phcnylalaninc (FMLP)はMg2+非 存 在 下 で も02生 成 を 誘 導 す る が,凝 集 はMg2+に 依 存 す る.PMAはCa2+,Mg2+非 存 在 下 で も02生 成 を 引 き起 こす が,PMA刺 激 に よ る 凝 集 はCa2+とMg2+ の 両 方 に 依 存 す る31).(vi)adhesionに よ る 増 強.ペ ト リ皿(pctri dish)や ミ リポ ア フ ィ ル タ ー に 接 着 す る だ け で 顆 粒 球 は02を 生 成 す る.endotoxinを 顆 粒 球 浮 遊 液 中 に 添 加 し て も02生 成 は み ら れ な い が,ペ ト リ 皿 上 で 顆 粒 球 とincubateす る と02生 成 が 誘 導 さ れ る30).顆 粒 球 浮 遊 液 にFMLPを 添 加 す る と 短 時 間 (2.5分)の02生 成 が 起 こ る が,ペ ト リ皿 上 の 顆 粒 球 をFMLPで 刺 激 す る とOZ生 成 は60分 間 継 続 す る32). (vii)priming効 果.た と えば 顆 粒 球 を 走 化 性N一 ホ ル ミル ペ プ チ ド(FM:LPな ど)でprcincubateし た と き に は,:NaF,PMA,オ プ ソ ニ ン 化 ザ イ モ ザ ン,Con-A, wheat germ agglutinin (WGA)刺 激 時 の02生 成 が 増 強 さ れ る33).同 様 の 効 果 は 他 の 走 化 性 因 子(casein, C5a),PMA,Con-A,WGA,Ca2+一 イ オ ノ フ ォ アA 23187でpreincubatcし た と き に も み ら れ る33,34). (viii)dcsensitization.priming効 果 は 異 な る 刺 激 間 で み ら れ る が,同 一 の 刺 激 剤 を 間 隔 を お い て 用 い る と 二 度 目 の 刺 激 に よ る 顆 粒 球 の02生 成 は 逆 に 抑 制 さ れ る.こ の 現 象 は,FMLP,C5a,PMA,A23187,ロ イ コ ト リエ ンB4(LTB4),血 小 板 活 性 化 因 子(platelet activating factor,PAF)な ど に よ る 刺 激 時 に 観 察 さ れ て い る20,35), respiratory burstは 一 般 に 一 過 性 の 現 象 で 長 く て も 30∼60分 間 し か 続 か な い.長 時 間02を 生 成 した 後 で は 顆 粒 球 の02生 成 系 は 損 傷 さ れ 不 可 逆 的 に02生 成 能 を 失 う と 考 え ら れ て お り,実 際 に20mMNaFで60 分 間incubateす る とCGDの 顆 粒 球 と 類 似 の 顆 粒 球 (食 作 用,脱 顆 粒 は 起 こ す が02を 生 成 し な い)が で き る と い う36),こ の 過 程 に は,一 部 はMPOが 関 与 し て い る と考 え られ て い る. 顆 粒 球 の02生 成 系 の 活 性 化 は ど の よ うに し て 行 わ れ る の だ ろ う か.PMA刺 激 時 の02生 成 は,all-or-noneの 現 象 とす る も の と,gradedで あ る と す る も の が あ る.ま た ど の よ う な 過 程 が 関 与 して い る の か. 残 念 な が ら 現 在 の と こ ろ 決 定 的 な こ と は わ か っ て い な い が,多 く の 過 程 の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る. (1)受 容 体 02生 成 を 誘 導 す る 物 質 の 一 部 は 受 容 体 を 介 して 作 用 す る と 考 え られ て い る.顆 粒 球 に はFc一 受 容 体,C3b -受 容 体,C5a-受 容 体 の ほ か にFMLP,LTB4,PAFに 対 す る 受 容 体 が 存 在 す る こ と が 知 ら れ て い る.さ ら に FMLP38)お よ びLTB439)に 対 す る 受 容 体 に は そ れ ぞ れ 親 和 性 の 異 な る2種 類 の 受 容 体 が 存 在 す る と 考 え ら れ る. 凝 集IgG,抗 原 抗 体 複 合 物 な ど は,Fc一 受 容 体 を 介 し て40),オ プ ソ ニ ン化 ザ イ モ ザ ン お よ びC567はC3b一 受 容 体 を 介 し て41)作 用 しOZ生 成 を 誘 導 す る と 考え られ て い る.Con-A,WGA,phytohemagglutin(PHA)な ど の レ ク チ ン は 細 胞 膜 の 糖 蛋 白 質 の 糖 鎖 部 分 に 作 用 す る も の と 考 え られ る24)(Con-Aは マ ソ ノ ー ス 残 基 に24,28), WGAは グ ル コ サ ミ ソ 残 基 に42)作 用 し て02生 成 を 誘 導 す る).PMA刺 激 時 のOZ生 成 も 受 容 体 を 介 す る と 考 え ら れ た がPMA受 容 体 と 考 え ら れ た の はprotein kinascC(PK-C,後 述)ら し い. 誘 導 さ れ たOZ生 成 が 持 続 す る た め に は 刺 激 剤 と 受 容 体 の 結 合 が 持 続 す る こ とが 必 要 で あ る24,43)(脱 顆 粒 に
炎 症VOL.5 No.2 SPRING 1985 93 は 持 続 的 な 結 合 は 必 要 で は な い).ま た,すば や く添 加 した と き に はOZ生 成 を 起 こす の に 十 分 な 濃 度 の 走 化 性 ペ プ チ ドを 長 時 間 か け て 添 加 す る と02生 成 は 低 下 す る.02生 成 の 程 度 は,刺 激 剤 と受 容 体 の 結 合 が 閾 値 に 達 す る 速 度 に 依 存 し て お り,最 終 的 な 結 合 量 に は 依 存 し な い(こ の よ う な 現 象 はPMAで は み ら れ な い).さ ら に,結 合 速 度 が 遅 い と き に はuncoupling(イ ノ シ ト ー ル リ ン 脂 質 代 謝 の 促 進(後 述)が 起 こ ら な く な る)が 生 じ る44). 先 に 述 べ たpriming効 果 お よ びdesensitizationの 少 な く と も 一 部 は 受 容 体 レ ベ ル で 起 こ っ て い る.priming 効 果 に はup regulationが 関 与 し て い る と 考 え ら れ る. PMA刺 激 に よ り 細 胞 膜 上 のFMLP受 容 体 数 が 増 加 し,FMLP刺 激 でC3b-受 容 体 数 が 増 す こ と が 知 られ て い る45)(こ の 増 加 分 は 細 胞 内 の 受 容 体 プ ー ル に 由 来 す る).ま た 細 胞 外 液 中 のNa+を 除 去 す る とFMLP受 容 体 数 が 増 加 す る.一 方,descnsitizationに は つ ぎ の よ う な 過 程 の 関 与 が 考 え られ る.(i)adaptation(高 親 和 性 受 容 体 の 低 親 和 性 受 容 体 へ の 変 換 あ る い は 受 容 体 間 の 負 の 協 同 作 用)46).(ii)down regulation (internaliza-tion.リ ガ ン ド と 結 合 し た 受 容 体 は 細 胞 内 へendocytosis さ れ る).FMLP8),C3b,tuftsinに 対 す る 受 容 体 で down regulationが 報 告 さ れ て い る46).血 小 板 第4因 子 はFMLPのinternalizationを 阻 害 す る と い う.ま た 食 作 用 に よ りFMLP受 容 体 の 数 お よ びFMLPに 対 す る 親 和 性 が 低 下 す る と い う. FMLPはMPO-H202-halide系 に よ り酸 化 を 受 け, 受 容 体 と の 結 合 能 が 低 下 す る.こ れ もFMLPに よ る02 生 成 の 持 続 が 短 い こ と に 関 与 し て い る と 思 わ れ る47). (2)カ ル シ ウ ム イ オ ン(Ca2+) Ca2+のmessengerと し て の 役 割 は 多 くの 細 胞 で 認 め られ て い る.顆 粒 球 の02生 成 に お い て もCa2+が 重 要 な 役 割 を も つ と 考 え られ る の は つ ぎ の よ う な 理 由 か らで あ る.(i)Ca2+-イ オ ノ フ ォ ア で あ るA23187,X537 A,ionomycinに よ りrespiratory burstが 起 こ る48,49). (ii)A23187,FM:LP,NaF,Con-A,digitonin,抗 原 抗 体 複 合 物,オ プ ソ ニ ン 化 ザ イ モ ザ ン,ロ イ コ ト リ エ ン B4(LTB4)に よ る02生 成 は 細 胞 外Ca2+濃 度 に 依 存 す る22,25,49,50).(iii)45Caを 用 い た 実 験 に よれ ば,FMLP, C5a,ア ラ キ ド ン酸,LTB4,Con-A,抗 原 抗 体 複 合 体, PMAな ど は 顆 粒 球 内 へ のCa2+流 入 を 引 き 起 こ す .こ のCa2+流 入 は02生 成 に 先 立 つ51) .(iv)Ca2+チ ャ ン ネ ル 阻 害 剤 で あ るverapami1お よ びLa3+は,FMLP お よ び オ プ ソ ニ ン化 ザ イ モ ザ ン に よ る02生 成 を 阻 害 す る.以 上 の よ う に 細 胞 内 に 流 入 したCa2+が02生 成 を 引 き 起 こ すtriggerと して 働 い て い る と 考 え られ る (digitonin刺 激 で は02生 成 が 始 ま っ た 後 でCa2+を 除 い て も02生 成 が 継 続 す る25)) .(v)も う一 つ の 機 序 と し て 顆 粒 球 の 膜 結 合 性 のCa2+が 種 々 の 刺 激 に 応 じ て 細 胞 内 へ 放 出 さ れ る と 考 え られ て い る52).サ イ トカ ラ シ ン D(Cyt-D)に よ る 膜 結 合 性Ca2+の 遊 離 と02生 成 は よ く 相 関 し52),ほ か にCon-A,オ プ ソ ニ ン 化 ザ イ モ ザ ソ,FMLP,C5a,PMA,Ca2+-イ オ ノ フ ォ ア,LTB4, 血 小 板 由 来 成 長 因 子(PDGF)な ど の 刺 激 時 に 膜 結 合 性 Ca2+の 遊 離 が み ら れ る .(vi)細 胞 内Ca2+阻 害 剤8 -(N,N-diethylamino)-Octyl-3,4,5-trimethoxybenzoate (TMB-8)はA2318749),Cyt-D52),FMLP50),PMA50) な ど に よ る02生 成 を 阻 害 す る が,TMB-8に よ るO 2生 成 阻 害 と膜 結 合 性Ca2+遊 離 の 阻 害 の 程 度 は よ く 相 関 す る52). 以 上 の 知 見 は,細 胞 内Ca2+濃 度([Ca2+]i)の 上 昇 が02生 成 に 関 与 す る こ と を 示 唆 す る.実 際 に,FMLP, LTB4,C5a,Con-A,凝 集IgG,ア ラ キ ド ン 酸 な ど に よ り顆 粒 球 の[Ca2+]iが 上 昇 す る こ とが 示 さ れ て い る48 ,53-55)([Ca2+]iは 徐 々 に 静 止 時 レ ベ ル(0.1∼0.2μM) に 戻 る が,こ れ に は 細 胞 膜 のCa2+ポ ン プ(Ca2+-ATP ase)が 関 与 し て い る も の と考 え られ て い る).し か し, [Ca2+]iの 上 昇 と02生 成 は 必 ず し も 相 関 し な い.強 力 な 刺 激 剤 で あ るPMAは[Ca2+]iの 上 昇 を 引 き起 こ さ な い し(PMAは 顆 粒 球 のCa2+ポ ン プ を 活 性 化 す る56)), ま たFMLP53-55)お よ びionomycin54)刺 激 時 の02生 成 に お い て[Ca2+]iの 上 昇 は 十 分 条 件 で は な い. Kakiuchiら に よ り発 見 さ れ たCa2+依 存 性 の 調 節 蛋 白 質 で あ るcalmodulinも02生 成 系 の 活 性 化 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る57,58).(i)顆 粒 球 に もcalmodulin が 存 在 す る.(ii)calmodulin阻 害 剤 に よ り02生 成 が 阻 害 さ れ る.(iii)02生 成 酵 素(NADPH oxidase)を 含 む 膜 分 画 の 活 性 はcalmodulinに よ り増 強 さ れ,cal-modulin阻 害 剤 で 抑 制 さ れ る.し か し な が ら,最
近cal-modulin阻 害 剤 は 同 時 にprotein kinaseCを 阻 害 す る こ と が わ か り,calmodulinの 関 与 に つ い て は 現 在 の 段 階 で は は っ き り し な い. (3)蛋 白 質 リン 酸 化 とprotein kinaseC(PK-C) 02生 成 を 誘 導 す る 種々 の 刺 激 剤 に よ り 顆 粒 球 蛋 白 質 の リン 酸 化 が 起 こ る59-63).同 定 さ れ て い る リ ン酸 化 蛋 白 質 と し て は,ミ オ シ ン 軽 鎖,ア ク チ ン,lipomodulin,お よ びvimentinな ど が あ る.蛋 白 質 の リ ン 酸 化 は 蛋 白 質 リン 酸 化 酵 素(protein kinase,PK)の 活 性 化 に よ り引 き 起 こ さ れ る が,PKに はcAMP,cGMPお よ びCa2+ に 依 存 す る も の が あ り,Ca2+依 存 性 のPKと し て は, calmodulinに よ っ て 活 性 化 さ れ るCa2+/calmodulin de-pendent protein kinase64)と,Nishizukaら に よ り発 見 さ れ たprotein kinase C(PK-C)65)が 知 ら れ て い る. 先 に 述 べ た よ う に 顆 粒 球 の02生 成 はCa2+に よ り影 響 を 受 け る が,さ ら にPMAが 直 接PK-Cを 活 性 化 す る こ と,顆 粒 球 に もPK-Cが 存 在 す る こ と が わ か り,O2
94炎 症VOL.5 No.2 SPRING 1985 生 成 系 の 活 性 化 にPK-Cの 関 与 が 考 え られ る.こ の1年 間 にPK-Cの02生 成 系 の 関 与 を 示 唆 す る 報 告 が つ ぎ つ ぎ に 現 わ れ た.(i)PK-CはCa2+とdiacylglycerol (DG)に よ り協 同 的 に 活 性 化 さ れ る が,細 胞 膜 を 通 過 可 能 なDGで あ る1-oleoyl-2-acetyl-glyccrol(OAG)に よ り02生 成 が 誘 導 さ れ る66).ま た,OAGはPMAと 同 様 の 蛋 白 質 リン 酸 を 引 き 起 こ し,こ の と き[Ca2+]iの 上 昇 を 伴 わ な い66).(ii)OAG,PMA,FMLPな ど に よ る02生 成 はPK-Cの 阻 害 剤retinalで 抑 制 さ れ る66). ま た02生 成 を 阻 害 す るcalmodulin阻 害 剤,局 所 麻 酔 剤 な ど は,PK-Cを 阻 害 す る こ と が わ か っ て い る.(iii) PMAはCa2+と 協 同 的(synergetic)にPK-Cを 活 性 化 す る が,02生 成 に お い て もPMAと[Ca2+]iの 上 昇 は 協 同 的 に 作 用 す る67).さ らに,PMAとCa2+-イ オ ノ フ ォ ァA2318768),OAGとA23187,0AGと FM:LPは そ れ ぞ れ 協 同 的 に02生 成 を 誘 導 す る.(iv) 強 力 な02-生 成 誘 導 剤 で あ る ア ラ キ ド ン 酸 な ど の シ ス 不 飽 和 脂 肪 酸23)も 直 接 顆 粒 球 のPK-Cを 活 性 化 す る69). (v)顆 粒 球 にphospholipascCを 添 加 す る と[Ca2+]i の 上 昇 を 伴 わ な い02生 成 が 起 こ る が,こ の と きDG が 生 成 さ れ て い る70).ま た,FMLP,A23187,お よ び オ プ ソ ニ ン化 ザ イ モ ザ ン に よ り イ ノ シ トー ル リ ン 脂 質 代 謝 回 転(inositolturnover)が 促 進 さ れ る こ と が 知 られ て い る71).こ の と き 生 じたDGとCa2+に よ りPK-C が 活 性 化 され る と 考え ら れ る.Ca2+涸 渇 顆 粒 球 をFM LPで 刺 激 後2分 以 上 し て か らCa2+を 添 加 し て も02 生 成 は 起 き な い53).こ れ は 生 成 さ れ たDGが 速 や か に phosphatidateに 変 換 さ れ る こ と を 反 映 し て い る と 思 わ れ る.(Vi)発 癌 プ ロ モ ー タ ー で あ るteleosidin,meze-reinもPK-Cを 活 性 化 す る が,両 者 と も 顆 粒 球 の02 生 成 を 誘 導 す る72).ま た 数 種 のphorbol esterのPK-C を 活 性 化 す る 程 度 とOZ生 成 を 引 き 起 こ す 程 度56,72)は 相 関 し て い る. 最 近 で は,ホ ル モン な ど の 刺 激 時 のinositol turnover の 促 進 に お い て 重 要 な 基 質 はphosphatidylinositolよ り も む し ろphosphatidylinositol4,5-bisphosphate(PI-4, 5P2)と 考え られ て い る73).PI-4,5P2のphospholipase Cに よ る 分 解 産 物 で あ るDGとinositol 1,4,5-tripho-sphate(IP3)が2ndmesscngerと し て 重 要 な 役 割 を 果 た す.IP3は 細 胞 内 貯 蔵 部 位 か ら のCa2+遊 離 を 引 き 起 こす こ と が 顆 粒 球 で も 知 ら れ て い る74).FMLP刺 激 時 に はPI-4,5P2の 分 解 が 促 進 さ れ る.生 成 さ れ たIP3 は[Ca2+]iを 上 昇 さ せ てDGと 協 同 し てPK-Cを 活 性 し,02生 成 系 の 活 性 化 に 至 る も の と 考 え ら れ る. (4)サ イ ク リ ッ クAMPとG蛋 白 質 サ イ ク リ ッ クAMP(cAMP)は 顆 粒 球 の02生 成 に 関 し て は 抑 制 的 に 働 く.サ イ トカ ラ シ ンE(Cyt-E)13),
Cyt-D8),FMLP75,76)に よ るO2生 成 はdibutyryl-cAMP に よ り 抑 制 さ れ,そ の 抑 制 効 果 はtheophyllineな ど の phosphodicstcrase阻 害 剤 に よ り増 強 さ れ る.プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ンE1(PGE1)75),PGE275),pGI27s),isoprotere-nolな ど の β一刺 激 剤75),お よ びhistamineはFMLPに よ る02生 成 を 阻 害 す る が,こ れ はcAMPを 介 し て い る も の と考 え られ て い る.一 方,PMA,NaF,OAG, オ レ イ ン酸 に よ る02生 成 はdibutyryl-CAMPに よ り阻 害 さ れ な い66,67).cAMPの 作 用 機 序 と して は,(i)Ca2+ 流 入 の 阻 害(た だ し,貯 蔵 部 位 あ る い は 膜 結 合 性Ca2+ の 遊 離 は 阻 害 し な い),(ii)inositolturnoverの 阻 害 が 考 え ら れ て い る が,02生 成 の 抑 制 に は(ii)の 機 序 が 重 要 と 思 わ れ る77).cAMPの 作 用 発 現 はcAMP-depcndcnt protein kinaseを 介 す る と考え られ て い る61).cGMPは 顆 粒 球 の02生 成 に は 影 響 を 与え な い13,66). 細 胞 膜adcnylate cyclase系 は,受 容 体,GTP結 合 蛋 白 質(G蛋 白 質 ま た はN蛋 白 質 と い う),触 媒 部(ATP か らcAMPを 生 成 す る)か ら な り,さ ら にG蛋 白 質 に は,触 媒 部 に 促 進 的 に 作 用 す るGsと 抑 制 的 に 作 用 す る Giが 存 在 す る78).顆 粒 球 に もGsお よ びGiが 存 在 す る.Giを 百 日 咳.菌 毒 素 でADP一 リ ボ シ ル 化 す る とGiは 抑 制 さ れ る が,こ の よ うな 処 理 に よ りお そ ら くCa2+流 入が 阻 害 さ れ る た め にFMLPに よ る02生 成 が 抑 制 さ れ る79).さ ら に 顆 粒 球 の β一受 容 体,FMLP受 容 体 の 高 親 和 性 と 低 親 和 性 受 容 体 の 相 互 変 換 に はG蛋 白 質 が 関 与 し て い る と考え られ て い る38). (5)ア ラ キ ド ン 酸 カ ス ケ ー ド と02生 成 系(図4参 照) 顆 粒 球 を,オ ブ ソ ニ ン 化 ザ イ モ ザ ン80),Ca2+-イ オ ノ フ ォ ァ71・8c),FMLP71)な ど で 刺 激 す る と ア ラ キ ド ン 酸 の 遊 離 が 起 こ る(PMA刺 激 で は ア ラ キ ド ン酸 の 遊 離 は み られ な い80)).ア ラ キ ド ン酸 は 種 々 の リ ン脂 質 か ら遊 離 さ れ る が,そ の な か の1-〇-alkyl-2-arachidony1-sn-glycero - 3-phosphocholine(1-〇-alkyl-2-arachidonyl-GPC)は ア ラ キ ド ン 酸 と 一血 小 板 活 性 化 因 子(platclet activating factor,PAF)の 共 通 の 供 給 源 と 考 え られ て い る.ア ラ キ ド ン 酸23)もPAF81)も 顆 粒 球 の02生 成 を 誘 導 す る が, 低 濃 度 の ア ラ キ ド ン 酸 はFMLPやNaFに よ る02生 成 を 抑 制 す る82).ア ラ キ ド ン酸 はcyclooxygcnascお よ び1ipoxygcnasc(LOX)に よ り 代 謝 さ れ る が,顆 粒 球 で はLOX系 に よ る 代 謝 が 中 心 と考 え られ て い る. 5-LOX系 に よ りleukotricncBq(LTB4),C4,D4,E4 な どが 生 成 さ れ る83).LTB4は 顆 粒 球 の02生 成 を 誘 導 す る50).LTB4は 細 胞 内 へ のCa2+流 入 を 引 き 起 こす が, PI-4,5-P2(前 述)の 分 解 は 起 こ さ な い .ま たLTB4は FMLPに よ る02生 成 を 増 強 す る と い う.LTB4は 顆 粒 球 に 特 異 的 なNADPH依 存 性 の ω一水 酸 化 を 受 け る84) が,そ の 産 物 で あ る20-OH-LTB4も 顆 粒 球 の 化 学 発 光 を 誘 導 す る85).5-LOXと12-LOXに よ るdouble
炎 症VOL.5 No.2 SPRING 1985 95
図4ア ラ キ ドン 酸 カ ス ケ ー ド と02生 成 #印 は 顆 粒 球 のO-2生 成 を 誘 導 す る 物 質 1-•Z-alkyl-2-arachidonyl-GPC : 1-•Z-alkyl-2-arachidonyl-sn-glycerol-3-phosphocholine, PAF: platelet activating factor,
HPETE : hydroperoxyeicosatetraenoic acid, HETE : hydroxyeicosatetraenoic acid, DHETE : dihydroxyeicosatetraenoic acid,
LT: leukotriene, PG: prostaglandin, TX: thromboxane, LX-A: lipoxin A.
oxygenationの 産 物 で あ る5S,12S-dihydroxycicosatc-traenoic acid(5S,12S-DHETE)86),15-LOX系 に よ り 生 成 さ れ る14,15-DHETE87)は と も にLTB4に よ るO -2生 成 を 抑 制 す る.15-LOXと5-LOX両 者 の 作 用 で 生 じ るlipoxin-A(LX-A)も 顆 粒 球 の02生 成 を 誘 導 す る29).ま たcyclooxygenascに よ る 産 物prostaglandin E2(PGE2),E1,12な ど は,FMLP,オ プ ソ ニ ン 化 ザ イ モ ザ ン に よ るOZ生 成 を 阻 害 す る が,PGF2α の 阻 害 効 果 は 弱 い75,76).一 方,PMAや ア ラ キ ド ン 酸 に よ る02 生 成 はPGで 阻 害 さ れ な い76). LTは,OH・,MPO-H202-halide系 に よ り不 活 化 さ れ る(LTC9,D4,E4は,MPO-H202-halide系 に よ り6-trans-LTB4お よ び 相 当 す るsulfbxide誘 導 体 に 変 換 さ れ る88).し た が っ て,顆 粒 球 の02生 成 はLTの 不 活 化 に も 関 与 し て い る と 考 え ら れ る.一 方,CGD患 者 の 顆 粒 球 でLT89)お よ びthromboxancB2(TXB2) の 生 成 能 低 下 は 認 め ら れ な い の で,LTお よ びTXの 生 成 に02の 関 与 は な い と 考 え ら れ る. ア ラ キ ド ン酸 お よ び そ の 代 謝 産 物 が02生 成 の2nd messengerと し て 働 い て い る 可 能 性 に つ い て は,(i)細 胞 外Ca2+非 存 在 下 で もFMLPに よ るO-2生 成 は(Ca2+ 存 在 下 よ り弱 い が)起 こ る53)が,ア ラ キ ドン 酸 の 遊 離 は 起 こ ら な い71)こ と,(ii)ア ラ キ ド ン 酸 に よ る0-2生 成 は LOX阻 害 剤 な ど で 抑 制 さ れ な い こ と な ど か ら否 定 的 で あ る. (6)膜 電 位 変 化 顆 粒 球 の0-2生 成 を 誘 導 す る 刺 激 剤 に よ り膜 電 位 変 化 が 起 こ る こ と が 知 られ て い る90).刺 激 後 に 出 現 す る 脱 分 極 は,(i)O-2生 成 と 相 関 す る,(ii)0-2生 成 に 先 立 つ,(iii)CGDの 顆 粒 球 で は み られ な い な ど の 理 由 か ら,0-2生 成 系 の 活 性 化 に 関 与 す る も の と解 釈 さ れ た. さ ら にHL-60細 胞(ヒ ト前 骨 髄 球 性 白 血 病 のcell line) を 分 化 さ せ た と き のO-2生 成 能 と脱 分 極 能 の 出 現 は 相 関 す る こ と が 知 られ て い る91).し か し,脱 分 極 と0-2生 成 が 相 関 し な い 例 も 多 く 知 ら れ て い る56,92).た と え ば, gramicidin(Na+お よ びK+に 対 す る イ オ ノ フ ォ ア) やouabain(Na+,K+ポ ン プ の 阻 害 剤)に よ り脱 分 極 は 起 こ る がO-2生 成 は 起 こ ら な い56)し,細 胞 外Na+濃 度 を 下 げ る とPMAやFMLPに よ る 脱 分 極 は 抑 え ら れ る が02生 成 は 抑 制 さ れ な い(FMLPに よ る0-2生 成 は む し ろ 増 強 さ れ る)56).膜 電 位 変 化 と02生 成 は 直 接 に はcouplingし て い な い と み る ほ う が 妥 当 か と 思 わ れ る. (7)そ の 他 の 因 子 顆 粒 球 の02生 成 が 種 々 のserine proteaseの 阻 害 剤 で 抑 え られ る こ と か ら,02生 成 系 の 活 性 化 にserine proteaseの 関 与 が 示 唆 さ れ て い る.し か し,そ の 根 拠 は 阻 害 剤 の 効 果 だ け で あ り,ま た 阻 害 剤 の 特 異 性,純 度 な ど の 点 か ら疑 問 が 出 さ れ て い る58,93).一 般 に プ ロ テ ア ー ゼ(protcase)に よ る 細 胞 機 能 調 節 は 少 な く と も 短 期 的 に は 不 可 逆 と考 え ら れ る が,前 述 の よ う に0-2生 成 系 の 活 性 化 は 可 逆 的 な 現 象 で あ り,scrine protcase の 関 与 は 考 え に く い の で は な か ろ うか. cytochalasinB(Cyt-B)は,そ れ だ け で は02生 成 を 誘 導 し な い が,FMLP,A23187,Con-A,PHA,WGA LTB4,PAFな ど 多 くの 刺 激 剤 に よ るO-2生 成 を 促 進 す
96炎 症VOL.5 No.2 SPRING 1985
る(PMAに よ る0-2生 成 は 影 響 さ れ な い) .Cyt-B は,Ca2+の 移 動 に 影 響 す る51,55)ほ か,inositol turnover の 促 進 を 増 強 す る こ と が 知 ら れ て い る . 微 小 管(microtuble)の 重 合 を 促 進 す る 作 用 を もつ 重 水(D20)は0-2生 成 を 誘 導 す る94).一 方,微 小 管 の 重 合 を 阻 害 す るcolchicineな ど の 薬 剤 は そ れ 自 身 で は02 生 成 を 誘 導 しな い が,Cyt-D,走 化 性 ペ プ チ ド な ど の 02生 成 を 増 強 す る95).微 小 管 と02生 成 系 の 関 係 は 現 在 の と こ ろ わ か っ て い な い. 生 理 的 な 物 質 と し て は,adenosine,ビ タ ミ ンKな ど がOZ生 成 を 抑 制 す る こ とが 知 られ て い る . (8)cytoplast 顆 粒 球 のcytoplast(Cyt-B処 理 に よ り核 や 顆 粒 成 分 を 除 い た も の)は,種 々 の 刺 激 剤 に よ りrespiratoryburst を 起 こ し,intactな 細 胞 と 同 程 度 のO-2を 生 成 す る26). した が っ て02生 成 系 お よ び そ の 活 性 化 経 路 は 保 た れ た 状 態 で 他 の 成 分 が 若 干 除 か れ た も の(O-2生 成 系 の 部 分 精 製)と 考 え られ,02生 成 酵 素96)お よ び 活 性 化 経 路97) の 解 析 に 用 い ら れ て い る. (9)無 細 胞 系(cell-freesystem)に お け る 活 性 化 02生 成 酵 素 の 活 性 化 はintactな 細 胞 あ る い はcyto-plastで し か 起 こ し え な い と考 え られ て い た が,最 近 顆 粒 球98)お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ99)の ホ モ ジ ネ ー トを 用 い て 0-2生 成 酵 素(NADPH oxidase)の 活 性 化 に 成 功 した と の 報 告 が な さ れ た.活 性 化 は,オ レ イ ン 酸,ア ラ キ ド ン 酸 な ど の シ ス 脂 肪 酸 に よ り な さ れ る が,膜 分 画 (NADPH oxidaseが 存 在 す る)の ほ か に 細 胞 質 成 分 が 必 要 と い う.こ の 系 はO-2生 成 系 の 活 性 化 機 構 の 解 析 に 有 用 と な る 可 能 性 が あ る. (10)分 化 に 伴 う0-2生 成 能 の 出 現 ヒ ト骨 髄 細 胞 を 用 い た 実 験 に よ れ ばPMAお よ び NaF刺 激 時 にNBTの 還 元 を 引 き 起 こ す の は 後 骨 髄 球 (metamyclocyte)以 後 で あ る の で,後 骨 髄 球 以 後 の 白 血 球 が02生 成 能 を 有 す る と 考 え られ て い る.ま た ヒ ト前 骨 髄 球 性 白 血 病 のcelllineで あ るHL-60細 胞 は 02生 成 能 を も た な い が,dimcthylsulfbxide(DMSO), dimcthylformamide(DMF)な ど に よ り 顆 粒 球 系 の 細 胞 に 分 化 す る と刺 激 時 に02を 生 成 す る よ う に な る91, 100) 02生 成 能 の 増 強(第2の 意 味 で の “0-2生 成 系 の 活 性 化 ”)に つ い て は マ ク ロ フ ァ ー ジ(Mφ)を 用 い た 研 究 が な さ れ て い る.ヒ ト単 球 を 数 日 以 上 培 養 す る とMφ に 分 化 す る(単 球 由 来Mφ)が,そ のO-2生 成 能 は 極 端 に 低 下 し て お り,こ れ は 組 織 のresidcnt Mφ の 機 能 を 示 す も の と 考 え られ る101).一 方,単 球 由 来Mφ をintcr-feron-γ)な ど のlymphokineと 培 養 す る と 刺 激 時 の02 生 成 能 は 増 強 す る102).こ の よ う な “活 性 化 ” に は,0-2 生 成 酵 素(NADPH oxidase)のNADPHに 対 す る 親 和 性 の 増 大(Kmの 低 下)が 関 与 す る も の と 考 え ら れ て い る103)
IV.O-2生 成 酵 素(NADPH oxidase)
0-2生 成 酵 素(NADPH oxidase)の 本 態 は 精 製 さ れ て い な い 現 在 不 明 で あ る が,つ ぎ の よ うな 性 質 が 知 られ て い る.(i)細 胞 膜 に 存 在 す る104).(ii)電 子 供 与 体 と し てNADPHを 必 要 とす る105).試 験 管 内 の 反 応 で は NADHも 電 子 供 与 体 と な り う る が,NADPHに 対 す る 親 和 性 の ほ う が ず っ と 高 い(NADPHに 対 す る ミ カ エ リス 定 数[Km]は0.025∼0.05mM,NADHに 対 す る Kmは0.5∼1mM)104,106) .1分 子 のNADPHか ら2 分 子 の0-2が 生 成 す る(I.式1参 照)104,106,107).HA-DPH結 合 部 位 は 細 胞 膜 の 細 胞 質 側,02結 合 部 位 は そ の 反 対 側 に 存 在 す る108).02に 対 す るKmは 約0.03mM で あ る109).(iii)0-2生 成 反 応 の 至 適pHは 中 性 付 近 (pH7前 後)で あ る104,107).(iv)0-2生 成 活 性 はMg2+に よ り増 加 す る. NADPH oxidaseは 顆 粒 球 の ほ か に,ヒ ト単 球110),ヒ ト初 乳 マ ク ロ フ ァ ー ジ110),マ ウ ス お よ び モ ル モ ッ ト腹 腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ103),ウ サ ギ 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ に も 存 在 す る こ と が 確 か め ら れ て い る.一 方,CGD患 者 の 顆 粒 球 はNADPH oxidaseを 欠 く.あ る 種 のCGD で は,NADPH oxidaseのNADPHに 対 す る 親 和 性 が 低 い(Kmが1/5∼1/10)こ と が そ の 原 因 で あ る と考 え られ て い る111).
NADPH oxidascに は,フ ラ ビ ン蛋 白 質(flavoprotein), b型 チ ト ク ロ ー ム(b-typecy tochrome),ユ ビ キ ノ ン (ubiquinonc)の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る.
(1)フ ラ ビ ン 蛋 白 質(flavoprotein)
フ ラ ビ ン蛋 白 質 の 関 与 は つ ぎ の よ うな 根 拠 か ら主 張 さ れ て い る.(i)flavin adcnine dinucletide (FAD)は 可 溶 化 さ れ たNADPH oxidaseの 粗 精 製 標 品 の0-2生 成 活 性 を 上 昇 さ せ る106,107).た だ し,FADは 無 効 と の 報 告 も あ る.(ii)FADの ア ナ ロ グ106)やquinacrine (flavinの ア ナ ロ グ)112)が 可 溶 化 標 品 の0-2生 成 活 性 を 阻 害 す る.(iii)CGDの 顆 粒 球 に はNADPHoxidase 分 画 にFADが 欠 損 し て い る も の が あ る113). 一方,細 胞 膜 分 画 を 可 溶 化 した 後 ゲ ル 濾 過 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に て 得 たNADPH oxidaase分 画 のFAD含 量 が 少 な い(こ の 分 画 のb型 チ ト ク ロ ー ム の 含 量 は 多 い)こ と か ら,フ ラ ビ ン 蛋 白 質 の 関 与 に 疑 問 を もつ 報 告 も あ る114). (2)b型 チ トク ロ ー ム(b-type cytochrome) 顆 粒 球 に 特 徴 的 なb型 の チ ト ク ロ ー ム は 本 邦 に お い て 発 見 さ れ,酸 化 還 元 差 ス ペ ク ト ラ ム で558nmに 吸 収 を も つ こ とか らcytochrome b558(cyt.b558)と 命 名 さ れ た115).1978年 英 国 で 再 発 見 さ れ,そ の 後NADPH
炎 症VOL.5 No.2 SPRING 1985 97 oxidascと の 関 連 か ら の 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る . NADPHoxidaseに お け るcyt.b558の 関 与 は 以 下 の 根 拠 か ら 主 張 さ れ て い る.(i)cyt.b558の 酸 化 還 元 電 位 (Em,7.0)は 一245mVで あ り(こ の こ とか らcyto-chromeb-245と も呼 ば れ る),こ れ は02を0-2に 還 元 す る の に 十 分 な 低 さ で あ る(02/0-2のEm,7.0は 一160 mV) .(ii)cyt.b558は 細 胞 膜 に 存 在 し116),食 作 用 時 に は 食 胞 に 移 行 す る.cyt.b558の 一 部 は 特 殊 顆 粒 に 存 在 す る と さ れ る116)が,90%以 上 が 特 殊 顆 粒 に 存 在 し刺 激 時 に は 細 胞 膜 に 移 行 す る と い う も の117),主 と し て 第3顆 粒 に 存 在 す る と い う も の118)も い る.(iii)嫌 気 的 条 件 下 に お い て 顆 粒 球 をPMAで 刺 激 す る とcyt.b558の 還 元 が 起 こ り,酸 素 添 加 に よ りcyt.b558は 速 や か に 酸 化 さ れ る.(iv)嫌 気 的 条 件 下 で,刺 激 後 の 顆 粒 球 よ り 得 た 膜 分 画(NADPHoxidase活 性 を 含 む)にNADPHを 添 加 す る とcyt.b558の 還 元 が 起 こ る119,120).酸 素119)あ る い はNADP+120)の 添 加 に よ りcyt.b558は.酸 化 さ れ る.こ のNADPH依 存 性 のcyt.b558の 還 元 は02生 成 能 と 相 関 し,刺 激 し て い な い 顆 粒 球 か ら得 た 膜 分 画 のcyt . b558で はNADPHに よ る 還 元 は 著 し く遅 い119).(v) cyt.b558は0-2生 成 能 を 有 す る 細 胞,す な わ ち 好 中 球,好 酸 球,お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ に は 存 在 す る が,他 の 細 胞 で は み ら れ な い.(vi)HL-60細 胞 の 分 化 に よ る 02生 成 能 の 出 現 とcyt.b558の 出 現 は 相 関 す る100). (vii)CGDの 顆 粒 球 に はcyt.b558が 存 在 しな い か,存 在 して もNADPH依 存 性 の 還 元 を 受 け な い121).(viii) NADPH依 存 性 の 還 元 を 受 け な いcyt.b558を も つ CGDの 単 球 とcyt.b556(一)のCGDの 単 球 を 融 合 さ せ る と,NBT還 元 能 を 有 す る よ う に な る122).(ix) NADPH oxidaseの 粗 精 製 過 程 で02生 成 活1生 とcyt. b558はco-purifyさ れ る114).な おcyt.b558は 一 酸 化 炭 素 と 結 合 す る が,そ の 結 合 は 光 に よ り解 離 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る119). 一 方,嫌 気 的 条 件 下 で のNADPH依 存 性 のcyt.b558 の 還 元 速 度 はOZ生 成 速 度 に 比 し て 著 し く遅 い の で, cyt.b558のNADPH oxidascへ の 関 与 に 対 し て 疑 問 視 す る 向 き も あ る120)が,好 気 的 条 件 下 で はcyt.b558の 還 元 速 度 と02生 成 速 度 は 一 致 す る と の 報 告 が 最 近 な さ れ た123).
(3)電 子 伝 達 系(electron transport system)説 NADPH oxidaseは,フ ラ ビン 蛋 白 質 とcyt.b558か ら な る 複 合 体 で あ る とい う可 能 性 が 考 え られ て い る.つ ま り,NADPHか ら フ ラ ビ ン 蛋 白 質 を 経 てcyt.b558に 伝 達 さ れ た 電 子 が 最 終 的 に02に 渡 さ れ02が 生 じ る と い う も の で あ る.〓 こ の 根 拠 と さ れ る の は 以 下 の よ う な も の で あ る.(i) 02生 成 活 性 を 有 す る 分 画 にFADとcyt.b558が1:1∼ 1:2(FAD:cyt.b558)の 割 合 で 存 在 す る96,117,120,124). (ii)CGDの 顆 粒 球 に はFADかcyt.b558の ど ち ら か 一 方 を 欠 く型,異 常 なcyt.b558を も つ 型 な ど が あ る113). FADを 欠 くCGDの 顆 粒 球 で は,NADPH依 存 性 の cyt.b558の 還 元 が 起 こ ら な い113) .(iii)NADPH oxidase は2,6-dichlorophenol-indophenol (DCIP)還 元 活 性 を 有 す る と 考え られ る112)が,こ のDCIPの 還 元 は フ ラ ビ ン 蛋 白 質 か ら電 子 を 直 接 受 け 取 る も の と考 え られ る112). つ ま りP-chlormcrcuribenzate (PCMB)に よ り02生 成 お よ びcyt.b558の 還 元 は 阻 害 さ れ る119)が,DCIP 還 元 は 阻 害 さ れ な い112).た だ し,DCIP還 元 活 性 は02 を 介 して い る とす る 意 見 も あ る125).(iv)FADを 伴 わ な いcyt.b558はNADPH依 存 性 の 還 元 を 受 け ず126),ま た 02生 成 能 を 有 し な い126-128).逆 にcyt.b558を 伴 わ な い フ ラ ビ ン 蛋 白 質 はNADPH依 存 性 の 還 元 を 受 け る が, 02生 成 能 は な い126).し か し,NADPH oxidase粗 精 製 標 品 に ご く少 量 のFADし か 含 ま れ な か った(cyt . b558:FAD〓19:1)こ と か ら フ ラ ビ ン 蛋 白 質 の 関 与 に 疑 問 が 出 さ れ て い る114). 電 子 伝 達 系 の 一 部 と して ユ ビキ ノ ン(ubiquinone)の 関 与 も考え られ て い る118,129)が,NADPHoxidase分 画130)お よ びcytoplast96)に ユ ビ キ ノ ソ が 検 出 さ れ な い こ と か ら そ のO2-生 成 へ の 関 与 は 否 定 的 で あ る. お わ り に 顆 粒 球 の 殺 菌 機 構 の 一 つ と し て 重 要 なOZ生 成 系 に つ い て 最 近 の 知 見 を 中 心 に 紹 介 し た.02生 成 系 の 活 性 化 機 構 お よ び02生 成 酵 素(NADPH oxidasc)の 分 子 レ ベ ル で の 解 明 は 始 め ら れ た ば か り と い っ て も過 言 で は な く,こ れ か ら の 研 究 の 発 展 が 待 た れ る.し た が っ て 今 後 cell-free系 に お け るNADPH oxidaseの 活 性 化 と そ の 精 製 が 研 究 の 大 き な2つ の 目標 と な る で あ ろ う. な お,本 稿 に お い て は02生 成 と そ の 制 御 機 構 に 焦 点 を 絞 っ て 紹 介 した た め,生 成 した 活 性 酸 素 が ど の よ うに し て 侵 入 した 細 菌 な ど の 異 物 を 無 毒 化(殺 菌)す る の か, そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て は ま っ た く省 略 した.ま た 活 性 酸 素 は,殺 菌 や 炎 症 ば か りで は な く,adult rcspiratory distress syndrome (ARDS, shock lung)や 発 癌 に も
関 与 し て い る と い う報 告 も あ る が,こ れ ら の 詳 細 は ほ か6,131)に譲 る.
文
献
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