食品安全行政における世界的傾向としては、国 民の健康保護が最も重要であるとし、科学に基づ く判断、後始末より未然防止に重点を置くように なってきている。食品の安全性を向上させ、消費 者の食に対する信頼をさらに高めるためには農場 から食卓までの安全確保のリスク管理措置を講じ ることが重要である。生産現場は衛生管理をより 一層向上させ、悪影響の起きる可能性の低減をつ うじて安全な食品を作ることが基本であるとされ ている。 そのような傾向の中、東京都では、動物由来感 染症監視体制整備事業（食の安全・消費者の信頼 安心確保対策推進交付金）において腸管出血性大 腸菌 O157 を毎年継続検査してきた。近年、O26、 O111 等 O157 以外の血清型による集団食中毒の発 生があり、O157 を含む日本における主要 7 血清 型についても検査の必要性が問われている。しか し、複数種類の血清型を検査するには時間・労力・ 経費が非常にかかる。そこでリアルタイム PCR を 活用した複数種類の血清型の腸管出血性大腸菌検 査の検討を行った。 材料と検査方法 材料は腸管出血性大腸菌 O157 株（VT1/VT2 株、 VT1 株、VT2 株）、O26 株、O103 株、O111 株、O121 株、 O145 株、O165 株（日本における腸管出血性大腸 菌主要７血清型）を用いた。
検査方法は糞便を材料とした遺伝子抽出方法 について熱抽出法・簡易遺伝子抽出法（タカラ SimplePrep reagent for DNA） ・インスタジー
８ リアルタイム PCR を活用した腸管出血性大腸菌検査
○吉崎 浩
要 約
東京都では腸管出血性大腸菌 O157 を毎年継続検査してきたが、近年、O157 以外の O26、O111 等の集 団食中毒の発生があり、他の血清型についても検査の必要性が問われてきている。しかし、複数種類の 血清型を検査するには時間・労力・経費が非常にかかると思われた。そこでリアルタイムＰＣＲを活用 した複数種類の血清型の腸管出血性大腸菌検査の検討を行った。 材料は日本における腸管出血性大腸菌主要７血清型株を用いた。まず糞便からの遺伝子抽出方法につ いて検討を行い、一次スクリーニングはリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎﾌﾟﾛｰﾌﾞ法）を用いた VT1/VT2/ eae 遺伝子による 3 種同時スクリーニングの検討を行った。二次スクリーニングは血清型を調べるリア ルタイム PCR、マルチプレックス PCR によるスクリーニングを検討した。スクリーニング選定後の菌の 分離については複数の選択培地を使用し、分離培養方法を比較検討した。 菌株により VT 遺伝子の保有・非保有、eae 遺伝子の保有・非保有の状況が異なるため、VT1/VT2/eae の 3 種類の遺伝子を使用したスクリーニングを行うことが必要と思われた。ﾘｱﾙﾀｲﾑ PCR を活用した VT1/VT2/eae のスクリーニング及び血清型のﾘｱﾙﾀｲﾑ PCR・ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ PCR のスクリーニングでは遺伝子を 特異的に検出することができた。スクリーニング後の選択培地での分離培養で、効率的に主要 7 血清型 の腸管出血性大腸菌の分離が可能になるのではないかと思われた。分離個体・農場を把握することで腸 管出血性大腸菌における対策が進むと思われた。
ンマトリックス法（BioRad 社 インスタジーン DNA 精製マトリクス ) ・アルカリ熱抽出法で実施 した。糞便培養液（ノボビオシン加 mEC 培地１夜 培養）の液量および使用抽出 DNA 量を変え 16 種 類についてリアルタイムＰＣＲを用い、ＶＴ１遺 伝子の C ｔ値で比較検討を行った。リアルタイム PCR の機器は Applied Biosystems® 7500 リアル タイム PCR システムを使用した。 スクリーニング遺伝子の決定については腸管出 血性大腸菌野外株の VT1/VT2/eae 遺伝子の保有 状況をコンベンショナル PCR により実施し、スク リーニンング遺伝子を決定した。 リアルタイムＰＣＲはサイバーグリーン法と TaqMan プローブ法があるが今回は特異性、安定 性、正確性、マルチプレックスリアルタイムＰＣ Ｒの可否等から TaqMan プローブ法で実施するこ ととした（表１）。 一次スクリーニング検査はリアルタイムＰＣＲ （TaqMan プローブ法）を用いて VT1/VT2/eae の３ 種遺伝子の同時スクリーニング方法を検討した。 試薬は QuantiTect Multiplex PCR Kit（QIAGEN） を用い、試薬のプロトコールに従い液量・条件 を設定した。VT1/VT2/eae の３種遺伝子のプライ マー及びプライマープローブを使用し1)2) 、VT1 遺伝子のプローブの蛍光色素は FAM を、VT ２遺 伝子については VIC を用い蛍光強度の違いによ りマルチプレックスリアルタイム PCR を行った。 eae 遺伝子はプレート位置を一つ下に下げ、蛍光 色素 FAM を用い増幅を行い、3 種遺伝子同時スク リーニングを実施した。蛍光色素は機械のフィル ター設定状況に応じ蛍光強度の強いものから選定 し FAM と VIC の２種類を使用した。 二次スクリーニング検査はマルチプレックスリ アルタイムＰＣＲとマルチプレックスコンベン ショナルＰＣＲを用いた２方法の各種血清型のス クリーニング検査を検討した。 マルチプレックスリアルタイムＰＣＲでは各種 血清型の遺伝子特有のプライマー及びプローブを 用い2 ～ 4) 一次スクリーニングと同じ試薬、条件 の設定で６種血清型の同時スクリーニング検査を 実施した。 また、マルチプレックス ― コンベンショナ ル PCR の試薬は Multiplex PCR Assay Kit（タ カラ）を用い、試薬のプロトコールに従い液 量、条件を設定した。血清型特有の遺伝子のプ ライマーを使用し2)｡5 ～ 10) 、増幅断片サイズの違 い に よ り O157(88bp)、H7(625bp)、O26(152bp)、 O145(132bp) 及 び O165(640Bp)、O111(406bp)、 O103(280bp) 及び O121(318bp) を組み合わせて 8 種類同時に検査を実施した。 スクリーニング後の選択分離培養方法の比較に ついては 7 種類の血清型菌株を CtSmac（OXOID）、 クロモアガー O157（関東化学）、クロモアガー O26・O157（関東化学）、クロモアガー STEC（関 東化学） の 4 種類の培地に接種し比較検討を 行った。 腸管出血性大腸菌抑制試験としてミュラーヒン トン寒天培地に腸管出血性大腸菌を接種後、乳酸 菌飲料（市販物）を 100 ㎕滴下及び血液寒天培地 に腸管出血性大腸菌を接種後、Bacillus subtilis （枯草菌）を線状に接種して培養し、腸管出血性 大腸菌各種血清型の抑制現象を確認した。 結 果 糞便培養液からの遺伝子抽出方法の比較につい ては、リアルタイムＰＣＲを用い、ＶＴ１遺伝子 ｲﾝﾀｰｶﾚｰﾀ法 TaqMan ﾌﾟﾛｰﾌﾞ法 実験立ち上げの 簡便性 特 異 性 安定性、正確性 マルチプレックス 融解曲線解析 デザインの簡便性 特 徴 必要な種類 ﾌﾟﾗｲﾏｰ ﾌﾟﾗｲﾏｰ ＆ ﾌﾟﾛｰﾌﾞ ○ ○ ○ ○ ○ ○ △ △ △ ○ × × 特異性が高い ﾌﾟﾗｲﾏｰﾀﾞｲﾏｰに弱い （SYBR Green法） 表１ インターカレーター法とTaqManプローブ法の比較
の C ｔ値で比較検討を行ったところ、16 種類の うちインスタジーンマトリックス法（糞便培養液 400 ㎕、DNA5 ㎕） による抽出方法が他の抽出方 法よりも遺伝子を効率よく抽出していた。アルカ リ熱抽出法で使用培養液量が多い事例では PCR 阻 害が確認された（図１）。 腸管出血性大腸菌野外株の VT1/VT2/eae 保有 状況は菌株により VT １/VT2/eae 遺伝子の保有・ 非保有の状況が異なっていた（図２）。 一次スクリーニングとして、まず、VT1/VT2/ eae の遺伝子保有状況を検査するため、マルチプ レックスリアルタイムＰＣＲをＶＴ１（ＦＡＭ）・ ＶＴ２（ＶＩＣ）eae（ＦＡＭ）で 3 種同時スクリー ニングを検討した。図３は VT1/VT2/eae の３種 遺伝子を保有している株、図４は VT2/eae の２ 遺伝子を保有している株、図５は遺伝子を保有し ていない株の検出状況で、それぞれの遺伝子を保 有している場合には各種遺伝子を同時に特異的に 検出することができた。 0.2 ml 0.4 ml 0.2 ml 熱抽出法 DNA簡易抽出ｷｯﾄ法 ｲﾝｽﾀｼﾞｰﾝ法 ｱﾙｶﾘ熱抽出法 0.2 ml 0.4 ml 0.1 ml 0.4 ml 1.0 ml DNA:5 μｌ DNA:2 μｌ （培養液） C ｔ 40 30 20 図１ DNA抽出方法の比較：16種類（糞便増菌培養） VT1 VT2 eae
O26 O103 O121 O145 O157 陰性
NON 図２ ｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ遺伝子の検討 VT １ VT ２ eae VT １ VT ２ eae VT 1 VT ２ eae VT １ VT ２ eae VT1 /VT2 保有株 VT1 保有株 VT2 保有株 陰性 eae VT 2 VT 1 eae FAM FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾀｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 図３ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC） VT １ VT ２ eae VT １ VT ２ eae VT １ VT ２ eae VT １ VT ２ eae VT1 /VT2 保有株 VT1 保有株 VT2 保有株 陰性 VT 2 eae FAM FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾀｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 図４ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC) VT ２ VT 1 eae VT ２ VT 1 eae VT ２ VT 1 eae VT ２ VT 1 eae VT1 /VT2 保有株 VT1 保有株 VT2 保有株 陰性 eae FAM FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾗｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 図５ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC）
二次スクリーニングの血清型を決定するスク リーニングではマルチプレックスリアルタイムＰ ＣＲの実施例であり複数の血清型を同時に検査す ることができた（図６）。また、各種血清型事例 の O157、O145 においても特異的に検出できた（図 ７、図８）。 マルチプレックス PCR を用いた検査では各種遺 伝子を特異的に同時に検査ができた（図９）。 以 上 の よ う に リ ア ル タ イ ム PCR を 活 用 し た VT1/VT2/eae のスクリーニング及び血清型のリア ルタイム PCR、マルチプレックス PCR のスクリー ニングでは遺伝子を特異的に同時に検出すること ができた。 スクリーニング選定後の分離培養方法を複数 の培地を用いて検討したところ、クロモアガー O157 培地、CtSMac 培地による分離状況が比較的 よかった（表２）。 腸管出血性大腸菌スクリーニング分離培養後の 対策の検討として乳酸菌、枯草菌による菌抑制試 験を実施した。乳酸菌飲料による大腸菌抑制試験 では、主要 7 血清型腸管出血性大腸菌すべてを抑 制する現象が確認された（図 10）。 Bacillus subtilis（枯草菌）による大腸菌抑制 試験では、主要 7 血清型腸管出血性大腸菌すべて を抑制する現象が確認された（図 11）。 まとめ及び考察 腸管出血性大腸菌 O157 の検査を行う場合、図 12 のようにさまざまな手順を踏んで実施してい O 145 O 26 O 121 O 103 O 157 O 111 O 103 O 157 O 103 O 157 O 145 O 111 O 145 O 111 O 26 O 121 O 26 O 121 FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾗｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 FAM VIC 図６ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC） O 103 O 157 O 103 O 157 O 145 O 111 O 145 O 111 O 26 O 121 O 26 O 121 FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾗｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 FAM VIC O 157 図７ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC） O 103 O 157 O 103 O 157 O 145 O 111 O 145 O 111 O 26 O 121 O 26 O 121 FAM VIC ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽ ﾘｱﾙﾗｲﾑＰＣＲ 蛍光色素 ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 FAM VIC O 26 図８ マルチプレックスリアルタイムPCRの設定（FAM・VIC） 0145 0103 0121 0111 026 0157 0165 0145:132 bp 0103: 280 bp 0111: 406 bp 0165: 640 bp 0121: 318 bp 026 : 152 bp 0157 : 88 bp 0157 H7 : 625 bp H7 H-図９ ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽＰＣＲ（腸管出血性大腸菌 8種遺伝子）
るが、時間、労力、経費が非常にかかっていた。 これを７種類の血清型について調べるとなるとさ らに時間、労力、経費がかかることになる。さら に各種血清型を判別するには表３のように非常に 判定が難しく手間がかかるものとなっている。 そこでリアルタイム PCR を活用した腸管出血 性大腸菌のスクリーニング検査を検討すること としたが、まず、腸管出血性大腸菌のスクリー ニング遺伝子は、各血清型及び株の種類によっ て VT1/VT2/eae 遺伝子の保有状況が異なるため VT1/VT2/eae の 3 種類の遺伝子について同時にス クリーニングを行うことが必要と思われた。 また、畜産現場における腸管出血性大腸菌の 検査対象は糞便である。今回の糞便培養液からの DNA 抽出法の比較では、多検体処理が可能な抽出 方法を検討するため、比較的、手間と時間のかか らない熱抽出法、簡易遺伝子抽出法、インスタジー ンマトリックス法およびアルカリ熱抽出法につい て比較検討を行った。ＤＮＡ抽出キットも各社か ら販売されているが、多検体処理でのＤＮＡ抽出 に手間と時間がかかるとスクリーニングとして適 さなくなると考えられる。そのため、手間がかか らず短時間で処理できる方法が必要と思われた。 今回の結果では糞便を検査材料とした場合、イ ンスタジーンマトリックス法（糞便培養液４００ ㎕・DNA5 ㎕）による DNA 抽出がよいと思われた。
O26 O103 O111 O121 O145 O157 O165
ｸﾛﾓｱｶﾞｰO26/157 ｸﾛﾓｱｶﾞｰSTEC CT－Smac ｸﾛﾓｱｶﾞｰO157 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ○ ○ △ ○ ◎ ◎ ◎ ○ ○ － △ ○ ◎ ◎ △ △ － △ ○ ◎ ◎ 表２ 各種選択培地での血清型による分離比較 乳酸菌飲料 E.coli (腸管出血性大腸菌) 図10 乳酸菌飲料によるE.coli (大腸菌) 抑制現象 Bacillus subtilis（枯草菌） E.co 大腸菌)
図11 Bacillus subtilis (枯草菌） によるE.coli (大腸菌) 抑制現象
ﾉﾎﾞﾋﾞｵｼﾝ加mECブイヨン（糞便） 42℃ 18-24Ｈ増菌培養 クロモアガーＯ１５７ ＣＴＳｍａｃ （単離できるように） 特徴的なコロニーを釣菌 35℃ 18-24Ｈ増菌培養 セルビオース添加ＬＩＧ培地 ＬＩＭ 増菌培養 35℃ 18-24Ｈ増菌培養 蛍光発色の有無 生化学性状確認 O157免疫血清で凝集反応 試験管凝集反応 VT1/VT2/eae:PCR 35℃ 18-24Ｈ増菌培養×3回 H７抗原の有無 ｸﾚｰｷﾞｰ管接種 増菌培養 35℃ 18-24Ｈ増菌培養 図12 ＥＨＥＣの分離方法（O１５７の場合） a) インドール b) β -グルクロニダーゼ c) 48時間培養での成績、SOR:ソルビトール、RHAM:ラムノース d) 10mM塩化カルシウム加洗浄羊赤血球寒天培地での溶血活性 e) +;陽性、(+);殆どの株は陽性、-;陰性、(-);殆どの株は陰性、d;株によって異なる f) ラクトース陰性株であっても培養中にラクトース陽性株を生じる
血清群 TSI寒天培地 LIM培地 糖分解C） CT加平板 EHEC
Hemolysind) での発育 斜面 高層H2S ｶﾞｽ ﾘｼﾞﾝ INDa)運動性 GUD SOR RHAM
b) O157 +e) + - + + + (+) - - - + + O26 + + - + + + (+) + + - + + O111 + + - + - + (-) + + + + + O103 + + - + + + + + + d d + O121 (+)f) + - + + + (+) + + + + + O145 + + - + + + (-) + + + + + O165 + + + () + (+) -表３ 主なEHECの鑑別性状
リアルタイムＰＣＲにおいては一部アルカリ熱抽 出法を推奨している事例もあるが、アルカリ熱抽 出法で糞便培養液から DNA 抽出を実際に行ったと ころ材料の培養液量が多くなるに従い、ＰＣＲ阻 害を強く起こすようになった（使用 DNA 量を２㎕ と少なくした場合にはＰＣＲ阻害が起こりにくく なった）。これは糞便に含まれる PCR 阻害物質の 影響と考えられた。 今回、インスタジーンマトリックス法によるＤ ＮＡ抽出効率が他の方法に比較してよかったが、 試薬に含まれているキレート樹脂のキレート作用 により二価イオン ( Ｍｇイオン、Ｃａイオン ) が 除去され、ＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートを調製 したためと考えられた。 Taq Man プローブ法の特徴として、遺伝子を特 異的に検出できるとともに蛍光色素の強度の違い で同時に複数種類の遺伝子をマルチプレックスリ アルタイムＰＣＲで調べることができることがあ げられる。今回のマルチプレックスリアルタイム PCR では検出を確実に行うため蛍光強度の強い色 素（FAM と VIC）のみを使用しマルチプレックス リアルタイム PCR を実施した。蛍光強度の比較的 弱い色素のＣＹ５でも実施してみたが、思うよう な結果が出なかったため、リアルタイムＰＣＲ機 器の付属フィルターの中で蛍光強度の強い２種を 組み合わせて行うとよいと思われた。リアルタイ ム PCR で使われる蛍光色素は蛍光スペクトルが近 く物理的に分離するのが難しいため、クロストー クの影響が避けられない。しかし機器に設定され ているアルゴリズム解析で検出をおこなうことで 影響を受けずに精度の高いマルチプレックスリア ルタイム PCR を実施することが可能となった。 マルチプレックスリアルタイムＰＣＲを用いる ことで同時に検査できる検体数が増やせるととも に手間・経費も半減するので非常に有用と思われ る。今回使用した蛍光色素の種類は当所所有機器 の付属フィルターに合わせてプライマープローブ の蛍光色素の FAM と VIC を選定し、プライマー プローブを作成したが、他の機器においてフィル ターの種類が異なっていてもフィルターに合わせ て蛍光色素を組み合わせたプライマープローブを 使用することで対応することが可能と思われた。 血清型検査のスクリーニングをマルチプレック スリアルタイム PCR、マルチプレックスコンベン ショナル PCR で実施したが、各血清型遺伝子を 特異的に同時に検出できた。マルチプレックスコ ンベンショナル PCR では増幅断片サイズの違い により、プライマーを複数組み合わせて実施した が、主要７血清型以外に H ７抗原遺伝子のプラ イマーを加え、H ７抗原遺伝子も調べるように設 定した。培養法では３回以上クレーギー管を使用 して運動性のある菌を培養後、試験管凝集反応で 調べていた H7 抗原を PCR では短時間で調べるこ とができ、大幅な日程の短縮になった。手間がか からず短時間で処理できるため非常に有用な方法 と思われた。 以上のように複数の血清型を検査する場合に は、リアルタイム PCR を活用したスクリーニング 検査で労力・時間・経費が大幅に軽減することが できると思われた。VT1・VT2・eae 遺伝子のスク リーニングにおいて主要７血清型以外の血清型の 腸管出血性大腸菌も検出される可能性があるが、 今回は主要 7 血清型の腸管出血性大腸菌に絞った 検査を行うこととした。 スクリーニング選定後の分離培養方法について 複数種類の選択培地を用いて主要７種類の菌株を 接種して検討したところクロモアガー O157 培地、 CtSmac が比較的よく分離された。しかし、菌株 によっては培地による分離状況が異なる可能性も あるので、クロモアガー O157・CTSmac を中心に もう 1 種類くらいの選択培地を加えて 3 種類を組 み合わせて培養することで効率的に主要 7 血清型 の腸管出血性大腸菌の分離が可能になるのではな いかと思われた。また、分離培養前には血清型が 分かっているので必要に応じて免疫磁気ビーズを 使用した分離も可能となる（図 13）。
以上のように、大量の糞便検体からでも腸管出 血性大腸菌を効率的に検出し、血清型まで把握し たうえ分離培養を行うことで、時間、労力、費用 が大幅に軽減できると思われた。 乳酸菌および枯草菌を使用した簡易試験で腸管 出血性大腸菌主要 7 血清型株の菌抑制現象が確認 された。手洗いの励行、隔離飼育等の対策以外に も腸管出血性大腸菌保有牛・農場を把握し、乳酸 菌、枯草菌等を活用することで対策が進むのでは ないかと思われた。乳酸菌、枯草菌等については、 株によって有効な株、無効な株があると考えられ る。また、乳酸菌等を含む生菌剤は、新しい生菌 剤を使用することが大切で、長期間放置した生菌 製剤については投与しても効果が得られない可能 性も考えられる。枯草菌については、環境条件に よっては芽胞を生成するので長期間の使用が可能 であると思われた。 また、粗飼料（乾草）の給与によって腸管出血 性大腸菌が分離されなくなったという報告10,11) があるが、粗飼料（乾草）そのものの効果ではな く、粗飼料（乾草）に付着していた大腸菌を抑制 するような枯草菌が含まれていたからではないか と推察した。 腸管出血性大腸菌を保有している個体・農場を 把握し、乳酸菌や枯草菌等給与による大腸菌抑制 現象を活用することで、腸管出血性大腸菌 O157 を含む主要 7 血清型大腸菌の対策が進み、ふれあ い牧場や出荷時の安心、安全に寄与できるのでは ないかと考えられた。 また、糞便からの DNA 抽出方法、リアルタイム PCR によるスクリーニング検査は、他の菌種等で も応用可能であり、今後、さまざまな菌種で実施 していくことができると思われた。 Taq Man プローブ法によるマルチプレックスリ アルタイムＰＣＲでは複数種類の遺伝子を同時に 検出でき、一度、方法、機械を設定してしまえば、 手技、操作が簡単なため、誰にでも使用可能であ る。リアルタイム PCR の機種が異なってもフィル ターの選定、色素、条件設定により同じように使 用できるため全国で応用可能と思われた。 引用文献
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VT1：FAM VT2：VIC eae：FAM （ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽPCR） 一次スクリーニング ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ解析 ﾘｱﾙﾀｲﾑPCR （TaqMan ﾌﾟﾛｰﾌﾞ法） 二次スクリーニング ﾘｱﾙﾀｲﾑPCR （TaqMan ﾌﾟﾛｰﾌﾞ法） 同時も可 選択培地による分離培養 確認検査（凝集反応・生化学・遺伝子検査） ｸﾛﾓｱｶﾞｰO157 CT-Smac 他1種 （免疫磁気ﾋﾞｰｽﾞ法） 分離培養
ﾏﾙﾁﾌﾟﾚｯｸｽPCR O26 / O103 / O111 / O145 / O157 / O121 / O165 / H7 (8種遺伝子）
対 策 手洗い励行・ふれあい活動自粛
乳酸菌・枯草菌等で対策
大腸菌DNA抽出（ｲﾝｽﾀｼﾞｰﾝ・ｱﾙｶﾘ熱抽出） 増菌培養（NmEC)
O157 / O145 / O26 ：FAM O103/O121/O111：VIC
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