の基軸となるのは 4 種の eif2αキナーゼ (HRI, PKR, または ) の活性化, eif2αのリン酸化及び転写因子 の発現誘導である ( 図 1). によってアミノ酸代謝やタンパク質の折りたたみ, レドックス代謝等に関わるストレス関連遺伝子の転写が促進され, それらの働きによって細胞はス

活 性 型 が ん 遺 伝 子 BRAF に よ る

ス ト レ ス 適 応 応 答 制 御 機 構 の 解 明 と 治 療 へ の 応 用

Regulation Mechanisms of Stress Response by Oncogenic BRAF

平 成 26 年 度 入 学 永 澤 生 久 子 (Nagasawa, Ikuko) 指 導 教 員 冨 田 章 弘 が ん の 発 生 は が ん 遺 伝 子 の 変 化 の 集 積 に 起 因 し ，活 性 型 が ん 遺 伝 子 に よ る 細 胞 増 殖 シ グ ナ ル の 異 常 な 活 性 化 は 現 在 の が ん 治 療 に お い て 重 要 な 治 療 標 的 で あ る ．一 方 で ，そ の 後 の が ん 細 胞 が 微 小 環 境 ス ト レ ス 下 で 増 殖 を 維 持 す る た め に は ，積 極 的 な ス ト レ ス 適 応 応 答 機 構 の 活 性 化 が 重 要 で あ る ．従 っ て ，が ん 細 胞 の ス ト レ ス 適 応 応 答 を 制 御 す る こ と は 有 用 な が ん 治 療 法 と し て 期 待 さ れ る が ，そ の 詳 細 な 分 子 機 序 は あ ま り 明 ら か に さ れ て い な い ．そ こ で 本 研 究 で は ，新 た な が ん 治 療 戦 略 の 分 子 基 盤 と し て ，が ん 遺 伝 子 に よ る ス ト レ ス 適 応 応 答 の 制 御 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 目 指 し ，治 療 標 的 と し て 重 要 な が ん 遺 伝 子 BRAF と 多 様 な ス ト レ ス に 応 答 す る Integrated stress response (ISR) を 結 ぶ 分

子 機 序 の 解 明 を 研 究 目 的 と し た ． ISR は 代 謝 ス ト レ ス や ウ ィ ル ス 感 染 及 び ヘ ム の 欠 乏 等 ， 様 々 な ス ト レ ス に 対 し 活 性 化 し ， 細 胞 の ス ト レ ス 適 応 に 寄 与 す る 重 要 な ス ト レ ス 適 応 応 答 経 路 で あ る ．1 ) _そ ATF4 eIF2α P GCN2P PERK P PKR P HRI P eIF2α kinases Stress Stress-related genes Adaptation to Stress Heme deficiency

Virus infection ER stress

Amino acid starvation

Protein folding Amino acid import and metabolism

Autophagy Redox/Detoxification

の 基 軸 と な る の は 4 種 の eIF2αキ ナ ー ゼ (HRI， PKR， PERK ま た は GCN2) の 活 性 化 ， eIF2αの リ ン 酸 化 及 び 転 写 因 子 ATF4 の 発 現 誘 導 で あ る (図 1)． ATF4 に よ っ て ア ミ ノ 酸 代 謝 や タ ン パ ク 質 の 折 り た た み ，レ ド ッ ク ス 代 謝 等 に 関 わ る ス ト レ ス 関 連 遺 伝 子 の 転 写 が 促 進 さ れ ， そ れ ら の 働 き に よ っ て 細 胞 は ス ト レ ス 適 応 を 果 た す ． 近 年 ， 活 性 変 異 型 BRAF の 選 択 的 阻 害 剤 で あ る vemurafenib が が ん 細 胞 に お い て ISR を 活 性 化 さ せ る こ と が 報 告 さ れ た ． 2 ) Vemurafenib は BRAF 変 異 型 メ ラ ノ ー マ 患 者 の 治 療 に お い て 奏 効 率 60-80%の 高 い 治 療 効 果 が 報 告 さ れ て い る が ， 完 全 に が ん 細 胞 を 死 滅 さ せ る こ と は で き ず ，が ん 細 胞 の 薬 剤 耐 性 化 が 課 題 と な っ て い る ． こ の こ と か ら vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 に も 注 目 が 集 ま り ，そ の 分 子 機 序 及 び 意 義 に つ い て 議 論 さ れ て い る ．そ こ で 本 研 究 で は ， BRAF に よ る ISR 制 御 機 構 の 解 明 に 向 け て ， は じ め に vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 機 序 の 解 析 を 行 っ た ． さ ら に ， vemurafenib に よ る ISR に 対 す る 選 択 的 阻 害 剤 の 探 索 を 行 い ， そ の 有 用 性 を 評 価 し た ．最 後 に ，活 性 変 異 型 BRAF の 新 た な 機 能 と し て ，ATF4 の 発 現 を 制 御 す る メ カ ニ ズ ム に つ い て 解 析 し た ． 1. BRAF 変 異 型 が ん 細 胞 は GCN2 を 介 し た ISR を 活 性 化 さ せ る こ と で vemurafenib の 作 用 か ら 細 胞 を 防 御 す る

Vemurafenib は 活 性 変 異 型 BRAF (V600E) に 高 い 選 択 性 を 有 す る こ と か ら ，vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 と BRAF 変 異 と の 関 係 を 検 討 し た ． BRAF 変 異 型 メ ラ ノ ー マ 細 胞 株 に お い て ， vemurafenib は eIF2αの リ ン 酸 化 及 び ATF4 発 現 を 誘 導 し た が ， BRAF 野 生 型 メ ラ ノ ー マ 細 胞 株 で は vemurafenib に よ る そ れ ら の 誘 導 は 弱 か っ た ． こ の こ と か ら vemurafenib は BRAF 変 異 型 細 胞

選 択 的 に ISR 活 性 化 を 誘 導 す る こ と が 示 さ れ た ． さ ら に ， vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 は ， vemurafenib の 主 要 な 作 用 機 序 と 考 え ら れ て い る MEK-ERK シ グ ナ ル 阻 害 と は 独 立 し て 誘 導 さ れ る こ と を 見 出 し た ． 次 に ，4 種 の eIF2αキ ナ ー ゼ を そ れ ぞ れ siRNA を 用 い て ノ ッ ク ダ ウ ン し た 結 果 ，vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 は GCN2 の ノ ッ ク ダ ウ ン に よ っ て 阻 害 さ れ る こ と を 見 出 し た ( 図 2A) ． ま た ， vemurafenib 処 理 に よ っ て GCN2 活 性 化 の 指 標 と な る Thr899 の リ ン 酸 化 が 誘 導 さ れ る こ と を 確 認 し た (図 2B)． さ ら に ， GCN2 が 細 胞 内 の ア ミ ノ 酸 の 枯 渇 を 感 知 す る ス ト レ ス セ ン サ ー 分 子 で あ る こ と に 一 致 し て ，vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 の 下 流 で は セ リ ン の 生 合 成 及 び 代 謝 の 応 答 が 上 昇 す る こ と を 見 出 し た ．な お ，先 行 研 究 で は 小 胞 体 ス ト レ ス を 感 知 す る PERK が vemurafenib に よ る ISR に 関 与 す る こ と が 提 唱 さ れ て い た が ， 本 研 究 に お い て siRNA 及 び 阻 害 剤 を 用 い て 検 討 し た 条 件 で は vemurafenib に よ る PERK の 活 性 化 は 認 め ら れ な か っ た ． Vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 が 細 胞 増 殖 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た 結 果 ，ATF4 の ノ ッ ク ダ ウ ン に よ っ て vemurafenib の 細 胞 増 殖 阻 害 効 果 が 増 強 さ れ る こ と を 見 出 し た (図 2C) ． こ の こ と か ら ，GCN2 を 介 し た ATF4 発 現 の 誘 導 は vemurafenib

A

ATF4 p-eIF2α (S51) GCN2 RPL7 eIF2α siRNA

-VEM Cont.

A375 (BRAFV600E₎

ATF4 eIF2α p-GCN2 (T899) GCN2 p-eIF2α (S51) Time (h)

-

_{1 4 8 16 24}

-RPL7 VEM

B

A375 (BRAFV600E₎

C

Cont. VEM siC ont . siAT F4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 siC on tro l siAT F4 siC on tro l siAT F4

ControlsiC VEM

ont . siAT F4 Cont. Col on y a re a (rel ati ve to co ntr ol )

A375 (BRAFV600E₎

siC ont . siAT F4 VEM 図2. VemurafenibによるGCN2を介した ISR活性化とATF4ノックダウンによる vemurafenibの細胞増殖阻害効果の増強 VEM: Vemurafenib

の 作 用 に 対 し て 細 胞 防 御 に 働 く こ と が 示 さ れ た ．3 ) 2. Vemurafenib に よ る ISR に 対 す る 選 択 的 阻 害 剤 の 探 索 次 に vemurafenib に よ る ISR を 選 択 的 に 阻 害 す る 低 分 子 化 合 物 の 探 索 を 行 っ た ． 具 体 的 に は ， vemurafenib 処 理 に よ っ て 誘 導 さ れ る ATF4 を 蛍 光 免 疫 染 色 法 に よ り 検 出 す る こ と で ，355 種 の キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 ラ イ ブ ラ リ ー か ら vemurafenib に よ る ATF4 発 現 誘 導 を 抑 制 す る 阻 害 剤 の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た ．そ の 結 果 ，強 い ATF4 発 現 抑 制 作 用 を 示 し た 複 数 の キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 中 で ， 阻 害 剤 A が 他 の ス ト レ ッ サ ー 処 理 に よ る ATF4 発 現 に は 影 響 を 与 え ず ， vemurafenib 処 理 に よ る ATF4 発 現 誘 導 の み を 選 択 的 に 阻 害 す る こ と を 見 出 し た (図 3A)．阻 害 剤 A に よ る ATF4 発 現 抑 制 作 用 は 未 だ 同 定 さ れ て い な い 新 た な 作 用 機 序 に よ っ て 発 揮 さ れ る も の と 考 え ら れ た ． 遺 伝 子 発 現 解 析 よ り ， 阻 害 剤 A は vemurafenib で 誘 導 さ れ る 細 胞 内 の ア ミ ノ 酸 代 謝 の 恒 常 性 を 維 持 す る た め の 応 答 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た ．そ れ に 加 え て ，vemurafenib と 阻 害 剤 A の 共 処 理 は ，そ れ ぞ れ の 単 独 処 理 に 比 べ て 相 乗 的 に ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と で ，強 い 細 胞 増 殖 阻 害 効 果 を 示 し た (図 3B-3C)．以 上 よ り ， 阻 害 剤 A は vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 及 び そ の 下 流 で 機 能 す る ア ミ ノ 酸 代 謝 の 応 答 を 抑 制 し ， vemurafenib と 併 用 す る こ と に よ っ て 相 乗 的 な 細 胞 死 を 導 く こ と を 明 ら か と し た ． Inhibitor A Cont. VEM 2DG

-

+ TM HIS 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 Cont. 1 3 10 Ca sp as e 3/ 7 ac tiv ity (re la tiv e to con tr ol ) VEM (µM) Cont. 1 3 10 ATF4 eIF2α p-GCN2 (T899) GCN2 p-eIF2α (S51) RPL7 PERK

-

+

-

+

-

+

-

+ Inhibitor A 0 (nM) 10 30 100 VEM (µM) Inhi bi to r A

A

B

C

A375 (BRAFV600E₎

A375 (BRAFV600E₎

A375 (BRAFV600E₎

図3. 阻害剤Aはvemurafenibによる ISRを選択的に阻害し， vemurafenibとの併用により 相乗的にアポトーシスを誘導 する． ケミカルストレッサー

3. 活 性 変 異 型 BRAF は mTOR シ グ ナ ル の 活 性 制 御 を 介 し て ATF4 発 現 誘 導 を 制 御 す る こ れ ま で の 結 果 よ り ，vemurafenib の 処 理 か ら 4 時 間 後 に GCN2 を 介 し た ATF4 の 発 現 が 誘 導 さ れ る が ， 24 時 間 後 に は ATF4 の 発 現 誘 導 が 抑 え ら れ る こ と を 見 出 し た (図 2B)． そ こ で 次 に ， ノ ッ ク ダ ウ ン に よ る BRAF の 機 能 阻 害 が ISR に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た ． そ の 結 果 ，BRAF 変 異 型 細 胞 株 で は ， BRAF ノ ッ ク ダ ウ ン に よ っ て GCN2 を 介 し た ATF4 発 現 が 強 く 抑 制 さ れ た (図 4A)． 一 方 で ，PERK を 介 し た ATF4 発 現 は 部 分 的 に 抑 制 さ れ た ．ま た ，BRAF 野 生 型 細 胞 株 で は い ず れ の ス ト レ ス 条 件 下 に お い て も BRAF ノ ッ ク ダ ウ ン に よ る ATF4 発 現 へ の 影 響 は 認 め ら れ な か っ た (図 4A)． 次 に ， 我 々 は BRAF 変 異 型 細 胞 株 に お い て ， vemurafenib を 24 時 間 処 理 ま た は BRAF を ノ ッ ク ダ ウ ン す る と mTOR シ グ ナ ル 及 び そ の 下 流 で 働 く 翻 訳 開 始 因 子 の 活 性 が 低 下 す る こ と を 見 出 し た ．こ れ と 合 致 し て mTOR 阻 害 剤 処 理 に よ っ て GCN2 を 介 し た ATF4 発 現 誘 導 が 強 く 抑 制 さ れ た (図 4B)． さ ら に タ ン パ ク 質 の 免 疫 沈 降 に よ る 検 討 よ り ， BRAF と mTOR 複 合 体 1 及 び GCN2 間 で は コ ン プ レ ッ ク ス が 形 成 さ れ ， BRAF-mTOR 間 の 相 互 作 用 は GCN2 が 活 性 化 す る ス ト レ ス 条 件 下 に お い

IP: IgG mTOR

ATF4 p-GCN2 (T899) GCN2 RPS3 PERK BRAF siBRAF siCont. Cont. - + -+ - + -+ - + -+ HIS TG Cont. - + -+ - + -+ - + -+ HIS TG

A375 (BRAFV600E_{) SK-MEL-2 (BRAF}WT₎

ATF4 p-GCN2 (T899) GCN2 RPS3 PERK GCN2 活性化 PERK 活性化 -- -Cont. HIS TG

A375 (BRAFV600E₎

mTOR inhibitor

A

B

Input IP BRAF mTOR mTOR ATF4 p-GCN2 (T899) GCN2 RPS3 PERK BRAF FLAG FLAG-BRAFV600E A375

C

図4. 活性変異型BRAFはmTORシグナルを介して ATF4発現誘導を制御する．

て 増 加 す る こ と を 見 出 し た(図 4C)． 以 上 よ り ， 活 性 変 異 型 BRAF に よ る ISR 制 御 機 構 の 一 つ と し て ， 活 性 変 異 型 BRAF は mTOR シ グ ナ ル の 制 御 を 介 し て ，GCN2 を 介 し た ATF4 発 現 誘 導 を 制 御 す る こ と を 明 ら か と し た ．

総 括

こ れ ま で に 活 性 変 異 型 BRAF は 増 殖 及 び 生 存 シ グ ナ ル に お け る 役 割 に つ い て 中 心 的 に 解 析 さ れ て き た が ， 本 研 究 は 活 性 変 異 型 BRAF が mTOR シ グ ナ ル の 制 御 を 介 し て ， ISR に お け る ATF4 発 現 誘 導 を 正 に 制 御 し ，ア ミ ノ 酸 の 不 足 等 の 代 謝 ス ト レ ス に 対 す る 適 応 応 答 に も 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と を 見 出 し た ． 興 味 深 い こ と に ， BRAF に 対 す る キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 で あ る vemurafenib は ，処 理 後 4 時 間 の 時 点 で は BRAF の 増 殖 シ グ ナ ル と ス ト レ ス 適 応 応 答 の 二 面 性 の 機 能 を 完 全 に 阻 害 す る こ と は で き ず ， か え っ て ISR 活 性 化 を 誘 発 す る と 考 え ら れ る ．こ の よ う な BRAF の 二 面 性 の 機 能 は ，が ん 治 療 の 効 果 に 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ り ， 実 際 に 我 々 は ISR の 活 性 化 が vemurafenib の 作 用 に 対 し 細 胞 防 御 に 働 く こ と を 示 し た ． そ の 解 決 策 の 一 つ と し て ， vemurafenib と 阻 害 剤 A の 併 用 療 法 は BRAF の 増 殖 シ グ ナ ル 及 び ス ト レ ス 適 応 応 答 の 両 機 能 を 抑 制 す る こ と に よ っ て 合 成 致 死 に 導 く 新 し い が ん 治 療 法 と し て 期 待 で き る ． 参 考 文 献

1) Harding H. P., Zhang Y., Zeng H., Novoa I., Lu P. D., Calfon M., Sadri N., Yun C., Popko B., Paules R., Stojdl D. F., Bell J. C.,

Hettmann T., Leiden J. M., Ron D., Mol. Cell, 11 , 619-633 (2003).

2) Ma X. H., Piao S. F., Dey S., McAfee Q., Karakousis G., Villanueva J., Hart L. S., Levi S., Hu J., Zhang G., Lazova R., Klump V., Pawelek J. M., Xu X., Xu W., Schuchter L. M., Davies M. A., Herlyn M.,

Winkler J., Koumenis C., Amaravadi R. K., J. Clin. Invest., 1 24,

1406-1417 (2014).

3) Nagasawa I., Kunimasa K., Tsukahara S., Tomida A., Biochem.