ｽﾗｲﾄﾞ ﾀｲﾄﾙなし

環境化学物質のリスク評価のためには、

環境化学物質のリスク評価のためには、

環境化学物質のリスク評価のためには、

現行遺伝毒性試験に何が欠けているか

現行遺伝毒性試験に何が欠けているか

現行遺伝毒性試験に何が欠けているか

国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子細胞医薬部 鈴木 孝昌 2003.11.25 JEMS/BMS研究会

ベニテングダケ タマゴタケ

変異原性試験は、これまでどれ

だけ化学物質等のヒトへのリス

クの評価に役に立ってきただろ

うか？

O _{C C} O H C O₂N O NH₂

Furylfuramide (AF-2)

かつてソーセージなどに防腐剤として使われた。 強い変異原性のために発がん性が再検討され、陽性結果が出たため 使用が中止となる。（昭和４９年） 高用量でマウス、ラットの前胃等に腫瘍を作る。

benzo[a ]pyrene (

,

Di

l

DBP)

PAH中最強の発がん性を示す。

Mutant Frequencies of lacZ and cII gene Induced by DBP and AF2 0 100 200 300 400 500 600 Live r Fore stom ach Colo n Splee n _ControlAF-2 DBP cII lacZ M u ta nt F re q u e ncy ( x 1 0 -6 )

cII

lacZ

6 mg/kg 120 mg/kg

AF2はマウスには突然変異を起こしにくい

Bacteria– specific mutagen？

ただし、TA1535,1538では陰性

（aflatoxin B1, B[a]P, DMBAも）

エームス試験による発ガン物質の陽性検出率（sensitivity)

Investigator Year Sensitivity (positive/ carcinogens) 89.7 McCann et al. 1975 % (157/175) 85.0 Nagao et al. 1978 % (136/160) 91.4 Purchase et al. 1978 % (53/58) 75.6 Bartsch et al. 1978 % (62/82) 71.6 Ishidate et al. 1988 % (78/109) さらに複数の試験を組み合わせることにより検出率は上がる

*毎日与え て 半分の動物に がん がで き る 量、 体重ｋ ｇ あ た り サルモ ネラ 菌に対する 変異原性（ 復帰コ ロ ニ ー数 /μg )

変異原性と 発がん性の強さ の比較

1 0 -2 1 1 0 1 0 ２ 0 . 1 1 0 1 0 ２ DMN DMH o -An isid in 2 AA F o -A A T Fo rm ald e h yd e DMBA A FB1 MNNG B[ a] P MMC 1 0 ３ 1 0 ４ 1 0 -1 1 0 -3 発 がん 性 の 強さ ： TD 5 0 *( m g )

*毎日与え て 半分の動物に がん がで き る 量、 体重ｋ ｇ あ た り サルモ ネラ 菌に対する 変異原性（ 復帰コ ロ ニ ー数 /μg )

変異原性と 発がん性の強さ の比較

1 0 -2 1 1 0 1 0 ２ 0 . 1 1 0 1 0 ２ DMN DMH o -An isid in 2 AA F o -A A T Fo rm ald e h yd e DMBA A αC Me AαC A FB1 MNNG B[ a] P MMC Ph IP Glu -P-2 Me IQ Me IQx Tr p -P-2 IQ Tr p -P-1 Glu -P-1 1 0 ３ 1 0 ４ 1 0 -1 1 0 -3 発 がん 性 の 強さ ： TD 5 0 *( m g )

*毎日与え て 半分の動物に がんがで き る 量、 体重ｋ ｇ あ た り サルモ ネ ラ 菌に対する 変異原性（ 復帰コ ロ ニ ー数 /μg )

変異原性と 発がん性の強さ の比較

発がん 性 の強 T D 50 * (m g ) 1 0 -2 1 1 0 1 0 ２ 0 . 1 1 0 1 0 ２ D MN DMH o -A n isid in d iB[ a , l] P 2 A A F o -A A T Fo rm a ld e h y d e D MBA A αC Me A αC A FB1 MN N G B[ a ] P MMC A F-2 Ph IP Glu -P-2 Me IQ Me IQx Tr p -P-2 IQ Tr p -P-1 Glu -P-1 1 0 ３ _{1 0} ４ 1 0 -1 1 0 -3

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 MMC DEN Dibenzo[a,l]pyrene DMBA Melphalan DMN OchratoxinA DES STZ PhIP Cyclophosphamide AAT AF-2 STO 0

発がん性の強さと変異原性の強さの相関

（TGﾏｳｽ 試験） 発 が ん 性 の 強 さ T D 50 値 (mg ) TGﾏｳｽ 試験での変異原性の強さ (fold-increase / mg/kg ) 我々の結果 IQ B[a]P 2AAF Tamoxifen TDBP 2,4-DAT o-Anisidine MMS Urethane d-Limonene 4-C-o-PDA 2-N-p-PDA MeIQ N-OH-2AAF AflatoxinB1 MNU 論文データ PCZ

従来の変異原性試験の問題点

典型的な発がん物質でさえ、既存の変異原

性試験法で正しく評価できない可能性がある

危険度の低い化合物を、既存の変異原性

試験では大変危険であると評価してしまう

可能性がある

エームス試験による発ガン物質の陽性検出率（sensitivity)

Investigator Year Sensitivity (positive/ carcinogens) McCann et al. 1975 89.7 % (157/175) Nagao et al. 1978 85.0 % (136/160) Purchase et al. 1978 91.4 % (53/58) Bartsch et al. 1978 75.6 % (62/82) Ishidate et al. 1988 71.6 % (78/109) Kim & Margolin 1999 47.3 % (26/55)

本当に発ガン物質??

半分しか検出できない?

他の試験法と組み合わせて陽性率上げる 新しい試験法の開発、高感度化

Food Additives Tested in NTP Rodent Bioassay and Their Results of the Ames Test Carcinogenicity Mutagenicity Carcinogens 47% Non-carcinogens 48% Incomplete 5% 27 28 3 Positive 10% Negative 90% 47 5

from “How Many Food Additives Are Rodent Carcinogens?”

Gavage 25% Feed 61% Other 14% 16 Gavage 59% Feed 4% Other 37% 7 17 4 16 1 10

Effect of Administration Route on Rodent Carcinogenicity

発ガン実験の結果への一致を

目指すのではなく、変異原性の

結果に合わせて、発ガン性試験

の結果を見直す必要がある。

変異原研究における「発がん」以外の事象の重要性 非発ガン性変異原物質 非変異原性発ガン物質 発がん性 毒性一般 変異原性

変異原研究における「発がん」以外の事象の重要性 非発ガン性変異原物質 非変異原性発ガン物質 発がん性 毒性一般 変異原性 遺伝的毒性 老化 心臓病

TRENDS in Pharmacological Sciences Vol. 22 No.6 June 2001

Key challemges for toxicologists

in the 21st century

Lewis L. Smith

Syngenta CTL, Alderley Park, Macclesfield,

Much of the safety evaluation of drugs and

chemicals involves administration of a large

dose of the compound to a small number of

animals to characterize the effect,

followed by the extrapolation of this to a

large number of people exposed to a small

dose of the compound.

少数の動物への大量投与により、少量が曝露される 多数の人間への毒性を評価している

Safety factor

Safety factor 10 for interindividual variation (SNPs)

Safety factor 10 for human might be more sensitive

Safety factor 10 for safety reason in some cases

At least 100 and sometimes 1000 is applied

日常ヒトが摂取する量が1000倍になっても、毒性を現す化 合物は少ないのではないか？

DDT

2,2-bis(p-chlorophenyl) -1,1,1-trichloroethane

DDT had saved ~50 million lives and averted more than 1 billion illness

It was found, at high doses, to increase liver tumors in mice Public concerns over the environmental effects were

enhanced by the publication of Silent Spring in 1962. 使用中止；Sweden 1970, USA 1972, Japan 1972  使用制限；WHO 1979

1996 South Africa 使用中止

方向性の修正

発ガン実験の結果は絶対的答えではない！

検出すべき発ガン物質を選べば、陽性率は高い

発ガン試験の結果を、変異原性の結果から見直す必要有り。

化学物質と食品のリスクの考え方の違い （新規）化学物質 食品 合成 天然 新たに暴露 すでに長期に摂取 未知 既知 危ない 安全 安全性の確認が必須 天然物であれば安全 避けられるリスク 避けられないリスク

残留農薬 防かび剤

Natural mutagen

Ames 語録-1

•毎日コップ一杯のビールを飲んで子供に先天異常を引き起こす 危険性は、「1ppmのダイオキシンに汚染された泥を毎日１キロ グラム食べる」のに匹敵する。 •食品に含まれるDDTとPCBの平均残留量と水に含まれるEDB は、一日一杯コーヒーを飲むより安全で、危険性は毎日ピーナ ツバターサンドイッチを食べるのに比べてわずか１０分の１で ある。 •「われわれは一杯のコーヒーで一日に摂取するすべての残留農薬 よりも多くの発がん物質を取り入れている」

Ames 語録-2

•「人々の目はみな」人工化学物質ががんを多く発生させるという 方向に向いているが、「科学」は実際には「まったく違った見方」 をしている •人間は人工の有毒物質の一万倍もの量の天然有毒物質を接種して おり、生物学的影響はいずれの場合も最大許容量をもとに推測し た動物実験によって誇張されている。 •環境中の汚染物質が１０億分の１レベルでも一般の健康に影響 があるかどうか定かでないだけに、米国が公害の減少と抑制に 年間800億ドルも費やしているのが、果たして賢明なことであろ うか？

Ames 語録-3

•少数の人に対する小さいリスクよりも、多数の人に対する大き なリスクを問題にすべきだ。 •もし政府がまじめに効率よくがんを減らしたいので有れば、喫煙 を減らす努力を大いにしなければならない。タバコの恐ろしさの前 では、がんの危険はほとんど影が薄くなってしまう。 •何よりも重要なことだが、ほとんどの発がん物質におそらくこ れ以下なら実際に安全という被爆の閾値があるのではないか。

COOH NO₂ R O O R O O N C O R O O NH C O AAI ;R=H AAII;R=OCH₃ R O O HN C O R O O HN C O O NH N N N N O O O NH N N O N H N O O 1 2 3

4 (dA-N6-AA) 5 (dG-N2-AA)

COOH NO2

R O

O

Structure of aristolochic acid I (AAI ;R=OCH3)

and aristolochic acid II (AAII;R=H).

広防已 (Aristolochia fangchi)

関木通 細辛

Aristolochic acid

Chinese herb nephropathy Chinese herb nephropathy

Aristrochic acid による臓器特異的な突然変異の誘発

コントロール (lacZ)

Aristolochic acid (lacZ)

コントロール (cII)

Aristolochic acid (cII)

変異頻度  (x 10 -6 ) 前胃 _{腎臓 膀胱 大腸 腺胃 肺 肝臓 骨髄 脾臓 精巣} 1500 1000 500 0 C O O H N O2 R O O Aristolochic acid

Environmental Pollution, Pesticides, and the Prevention of Cancer: Misconceptions

BRUCE N. AMES AND LOIS SWIRSKY GOLD

FASEB J. Vol 11, 1041-1052 (1997) 誤解#1： がんの発生率は上昇している 誤解#2： 環境中の合成化学物質はヒトのがん発生の重要な          要因である。 誤解#3： 農薬を減らすことは、食物由来のがん発生を押さえ       るための効果的手段である。 誤解#4： ヒトが曝露される発がん物質等の有害物質は、主       に合成された化学物質である。

誤解#5： ヒトへの発がんリスクは、標準的な高用量動物試験       により評価できる。 誤解#6： 合成化学物質は天然化学物質よりも大きな発がん          リスクを持つ。 誤解#7： 合成化学物質の毒性は、天然化学物質のそれとは          異なる。 誤解#8： 農薬や他の合成化学物質はヒトのホルモン作用を       攪乱している。 誤解#9： 低用量で仮定されるリスクを規制することは、公衆       衛生の向上につながる。

Ames博士の教え

合成化学物質を怖がりすぎ

リスク評価の考え方の転換

ゼロリスク _{許容リスク}

Hazard Identification Risk assessment

定性的評価 定量的評価

従来型試験法 新しい試験法

動物、細胞実験 ヒト試料の使用

調査結果の概要 (1) 一日摂取量調査（トータルダイエットスタディ）  食品からのダイオキシンの一日摂取量は、 2.25pg/kgbw/日（1.19∼7.01pgTEQ/kgbw/日) と推定された 厚生労働省「平成１１年度食品からのダイオキシン一日摂取量調査等の調査結果」より ４ｐｇ−ＴＥＱ／ｋｇ／日

環境変異原研究における９つの誤解   鈴木 孝昌 「環境変異原研究の光と陰：これから進むべき道」 環境変異原研究 24 179-184 (2002) 誤解#1： 変異原性試験は発がん性の短期スクリーニング試  験である． 誤解#2： 発がん実験の答えは絶対的である． 誤解#3： いわゆるnon-genotoxic carcinogenも検出したい． 誤解#4： 新規の変異原性物質がまだたくさん存在する．

誤解#5： 生殖細胞での変異原性は体細胞を使って評価できる 誤解#6： 感度が高くより多くの発がん物質を検出できる試験  が望ましい 誤解#7： 変異原性が陽性ならば危険なので開発をストップ  する 誤解#8： ネガティブを保証することが重要である 誤解#9： トランスジェニックマウスを用いる変異原性試験は  感度が低い

エンドポイントの持つ意義の重要性

bacteria ＜ yeast ＜ mammalian ＜ human

(単細胞生物 ＜ 多細胞生物） in vito ＜ in vivo 重要度 DNA損傷 ＜ 染色体異常 ＜ 突然変異 ＜ 前がん病変 ＜ がん 遺伝子発現 _vs タンパク発現 (コメット＜アダクト）（構造異常＜転座） （transgene＜endogene） 高（好）感度

微生物を用いる変異原性試験に対する提言

•なるべく正常な状態に近い（ただしNR欠損）感度の低い株を

•できれば、ヒトの代謝酵素が導入された株を

•スクリーニング系としては、ハイスループット化を

培養細胞を用いる染色体異常試験に対する提言 •傷のタイプはメカニズムの評価につかえるのか？ •将来的には小核試験に代替されるのでは •できれば、ヒトの代謝酵素が導入された株を •ヒト細胞を用いて転座を調べる •Positive rate を下げる工夫を（細胞毒性による擬陽性の排除）

小核試験に対する提言

•ヒトの末梢血で評価できないか？

•多臓器での評価

•フローサイトメーターの利用

Top 10 micronucleus-inducing chemicals in 100 IARC carcinogens (Groups 1, 2A and 2B)

Evaluation of the rodent micronucleus assay in the screening of IARC carcinogens (groups 1, 2A and 2B) The summary report of the 6th

collaborative study by CSGMT/JEMS•MMS. Mutation Res. 389, 3-122. (1997)

Data from

Rank

Rank ChemicalsChemicals Max MNMax MN GroupsGroups AntineoplasticAntineoplastic

1 1 DiepoxybutaneDiepoxybutane 5.345.34 22BB 2 2 CisplatinCisplatin 5.205.20 22AA

_*

_*

3 3 MelphalanMelphalan 4.244.24 11

_*

_*

4 4 DacarbazineDacarbazine 4.044.04 22BB

_*

_*

5

5 NN--methylmethyl--NN--nitrosoureanitrosourea 3.823.82 22AA 6 6 DaunomycinDaunomycin 3.653.65 22BB

_*

_*

7 7 44--AminobiphenylAminobiphenyl 3.203.20 11 8 8 ChlorambucilChlorambucil 2.982.98 11

_*

_*

9 9 22--MethylaziridineMethylaziridine 2.882.88 22BB 10

10 1,31,3--Propane Propane sultonesultone 1.921.92 22BB Dose (mg/kg) Dose (mg/kg) 108 108 3 3 20 20 225 225 38 38 10 10 100 100 16 16 40 40 72 72

その他の変異原性試験に関する提言

•トランスジェニックマウス試験の重要性

•コメットアッセイは何を評価しているのか？

•DNAアダクトの解析はヒトのモニタリングに有用

•遺伝的影響を評価できるよい試験系を

•Genomics, Proteomics, Metabonomicsを活用した新しい 領域の開拓

これから進むべき道

•定性的評価から定量的評価へ

Hazard Identification から Risk Evaluationへ

•メカニズムに基づいた研究

個人レベルでのリスク評価をめざして

•新しい研究領域の開拓

SNPs，Mutagenomics, Mutaproteomics, Mutametabolomics, IT

•ヒトサンプルを用いた遺伝毒性試験

臨床試験，populationモニタリング，分子疫学

•Germ Cell Mutagenesisの重要性

変異原性試験は、これまでハザ

ード（危険性）の検出には役立っ

てきたが、ヒトへのリスクの評価

にはあまり役に立っていない。

•定量性

•ヒトでの評価