Doctoral Thesis

(1)

学位論文

Doctoral Thesis

婦人科悪性腫瘍における

PICT-1

の役割

( N o v e l r o l e o f P I C T - 1 i n g y n e c o l o g i c a l m a l i g n a n t t u m o r )

吉本賢史

Masafumi Yoshimoto

指導教員

栁沼裕二教授

熊本大学大学院生命科学研究部 (保健学系) 構造機能解析学

２０１８年３月

(2)

学位論文

Doctoral Thesis

論文題名：婦人科悪性腫瘍におけるPICT-1の役割

( N o v e l r o l e o f P I C T - 1 i n g y n e c o l o g i c a l m a l i g n a n t t u m o r )

著者名：吉本賢史 Masafumi Yoshimoto

指導教員名：熊本大学大学院生命科学研究部(保健学系)構造機能解析学栁沼裕二教授

審査委員名：主査検査技術科学分野担当教授畑裕之

副査検査技術科学分野担当教授栁沼裕二

副査検査技術科学分野担当教授大森久光

２０１８年３月

(3)

1. 要旨……….. 1

2. 関連論文………..5

3. 謝辞……….………..7

4. 略語一覧……….……….8

5. 研究の背景と目的……….………..11

5-1. 一般的な発癌機序

………...

11

5-2. 子宮頚癌の発癌機序

………....

12

5-3. 子宮体癌の発癌機序

………....

17

5-4. 卵巣癌の発癌機序

………... ..

18

5-5. PICT-1について

………..

21

5-6. 本研究の目的

………...

23

6. 実験方法……….………24

6-1. 細胞株と患者検体

………... ..

24

6-2. RNA抽出、RT-PCR、single-strand conformation polymorphism (SSCP)、 PICT-1 増幅産物のクローニング

……….. .. ...

25

6-3. DNA抽出とgenomic DNAのSSCP解析

………...

26

6-4. 半定量的RT-PCR

……….

26

6-5. USP7 ノックダウン

………...

27

6-6. Plasmid作製とtransfection

………...

27

6-7. Western blot法

………... ..

28

6-8. 免疫組織染色

……….….

29

(4)

7. 実験結果

……….… …..

32

7-1. PICT-1の発現にp53が関与する

……….. ..

32

7-2. USP7はPICT-1タンパク質を安定化する

……….…….…..

34

7-3. 一部の婦人科癌ではPICT-1の遺伝子変異が生じている

………

37

7-4. PICT-1 codon 389の遺伝子多型 (rs1804994)は婦人科癌のリスク因子である39 7-5. PICT-1 codon 389の遺伝子多型 (rs1804994)はPICT-1のp53安定化機能を阻害する

……… ……

40

7-6. 子宮頚癌ではPICT-1は前癌病変の段階から減少している

……….…

43

7-7. 高リスク型HPV E6, E7はPICT-1タンパク質を減少させる

………....

45

7-8. 子宮体癌ではPICT-1は前癌病変の段階から減少している

…………...

47

7-9. 卵巣癌ではPICT-1・USP7ともに前癌病変の段階から減少している

………

50

7-10. 卵巣癌においてPICT-1とUSP7の発現量は相関する

………....

54

7-11. 角化した癌細胞の細胞質にPICT-1は過剰発現している

………....

54

8. 考察……….………58

9. 結語……….………65

10. 参考文献………...67

(5)

1.

要旨

【目的】現在、日本人の2人に1人が癌に罹患し、3人に1人が癌によって死亡する。

医学の発展に伴い手術療法・化学療法・放射線療法は進歩したが、婦人科癌 (子宮頚癌、

子宮体癌、卵巣癌)の罹患率・死亡率は改善されていないのが現状である。この現状を打破するためには、詳細な発癌機序の解明とその理解に基づいた新たな早期診断技術や治療薬の開発が必要不可欠である。

最近、癌抑制遺伝子 p53 の新たな制御分子として protein interacting with carboxyl

terminus-1 (PICT-1)が報告された。本研究では、婦人科癌の発癌機序の解明を目的に、PICT-1

の制御機構と、婦人科癌の発癌過程におけるPICT-1の役割を解析した。

【方法】 PICT-1 の制御機構の解析では、p53 および USP7 を強制発現した際の PICT-1

量を検討した。次に、婦人科癌の細胞株と患者検体を対象に、PICT-1 coding領域の遺伝子

変異をPCR-SSCP法とDNAシーケンスで解析した。また、PICT-1 codon 389の遺伝子多型

(rs1804994)の頻度を癌患者群と健常群で比較し、さらに、野生型および rs1804994 PICT-1

を強制発現させた際の p53 発現動態を解析した。加えて、婦人科癌の組織標本を対象に

PICT-1の免疫染色を行い、さらに、子宮頚癌ではHPVs E6, E7を強制発現した際のPICT-1

量の解析を、卵巣癌ではUSP7の免疫染色を合わせて行った。

【結果/考察】 PICT-1の制御機構として、PICT-1の遺伝子発現にp53が、タンパク質の

安定化にUSP7が関与することを明らかにし、PICT-1はp53-MDM2-USP7複合体と密接に関係することでp53を制御することが示唆された。

一部の婦人科癌では、PICT-1の癌抑制機能に重要な領域にミスセンス変異が生じていた。

また、rs1804994は少なくともPICT-1のp53安定化機能を阻害し、婦人科癌のリスクを上

げることが示唆された。さらに免疫染色の結果、婦人科癌では前癌病変という早期の段階

からPICT-1量は減少し、大部分の浸潤癌では減少・消失していた。このPICT-1の量的減

少の原因として、高リスク型HPVs E6, E7や、大部分の癌で生じるp53変異、さらに本研究で明らかにしたUSP7の減少の関与が考えられた。また、角化した癌細胞ではPICT-1の細胞質への過剰発現が観察され、PICT-1の細胞質への局在変化は癌細胞の角化に関与する

(6)

【結論】 PICT-1の制御機構として、遺伝子発現をp53が、タンパク質の安定化を USP7 が担うことを明らかにした。一方、PICT-1異常 (特にタンパク質の減少・消失による量的異常、加えてrs1804994や遺伝子変異による質的異常)による癌抑制機能の減弱は、大部分の婦人科癌患者の発癌・腫瘍進行に関与することが考えられた。PICT-1は、p53安定化だけでなく、癌細胞の分化・角化誘導といった新しい癌治療へのアプローチを可能にするものと期待される。

(7)

Abstract of the Thesis

Purpose: Now, one out of every three people is likely to develop cancer. While understanding of

carcinogenesis has been gradually improving, we have yet to precisely identify genetic and molecular events which could serve as markers for early diagnosis or targets for new therapeutics.

Recently, several studies reported that protein interacting with carboxyl terminus-1 (PICT-1) is involved in p53 regulation. The purpose of this study was to determine the mechanism of PICT-1 regulation, and a role of PICT-1 in gynecological carcinogenesis.

Methods: In the study of PICT-1 regulation, we examined PICT-1 expression by p53 and USP7.

We examined PICT-1 gene mutations and codon 389 polymorphism (rs1804994) in gynecological cancer cell lines and patient samples using PCR-SSCP and DNA sequence methods. And also, we examined p53 expression by PICT-1 wild-type and rs1804994. To investigate PICT-1 protein expression and protein localization, we performed immunohistochemical staining in patient samples.

Results: In the study of PICT-1 regulation, we found that p53 increased PICT-1 expression and USP7 stabilized PICT-1 protein.

PCR-SSCP analysis of the entire coding region of PICT-1 showed that a polymorphism at codon 389 may increase the risk of gynecological cancers, and also identified novel missense mutations. Expression of wild-type PICT-1 inhibited the degradation of p53 in the presence or absence of HPV 18 E6 viral protein in vitro, while the expression of codon 389 polymorphic PICT-1 had a diminished inhibitory effect on p53 degradation, suggesting that this is one of the cause of increasing the risk of gynecological cancers.

Immunohistochemical staining of tumor samples revealed that lower levels of PICT-1 were observed in samples from precancer and cancer tissues, compared to normal epithelium and benign tumor tissues. The reduction of PICT-1 may therefore be an early event in gynecological tumorigenesis. We also found the USP7 reduction in ovarian cancers, therefore, this and p53

(8)

Furthermore, PICT-1 was particularly overexpressed in cellular cytoplasm within keratinizing lesions.

Conclusions: Our data indicated that p53 increased PICT-1 expression and USP7 stabilized

PICT-1 protein. PICT-1 abnormalities may be associated with the carcinogenesis of gynecological cancers. Further study of the association between PICT-1 and cell differentiation would be of value, particularly toward improving differentiation-inducing therapeutic options for the many patients with challenging gynecological cancers.

(9)

2.

3.

謝辞

本研究は、熊本大学大学院生命科学研究部 (保健学系) 構造機能解析学分野栁沼裕二教授の御指導のもとに行い、各種の研究方法や論文の読み方などに始まり、研究に対する姿勢や社会人としての振る舞い・心構えなど多面にわたり直接的な御指導・ご鞭撻を賜りました。心から深謝致します。

本研究の遂行にあたり検体の提供に御協力いただきました患者様に深謝致します。また、

検体収集などにおいて御協力を下さいました旭川医科大学付属病院病理部、産婦人科学講座の皆様に深謝致します。

本研究の遂行にあたりpEF1-MycHisA-PICT-1 expression plasmidを供与いただいた前濱朝彦先生 (国立感染症研究所)と、pact-FLAG-USP7 wild-typeおよびmutant expression plasmidを供与いただいた石井俊輔先生 (理化学研究所)に深謝致します。

最後に数多くのご助言やサポートをして頂きました熊本大学大学院生命科学研究部 (保健学系)の皆様に心よりの感謝を述べて、私の謝辞と代えさせて頂きます。

(12)

4.

略語一覧

本論文を作成するにあたり、以下の略語を用いた。

protein interacting with carboxyl terminus-1：PICT-1 retinoblastoma：RB

mouse double minute 2：MDM2 ubiquitin specific protease：USP human papilloma virus：HPV

cervical intraepithelial neoplasia：CIN carcinoma in situ：CIS

E6 associated protein：E6AP CREB binding protein：CBP

HIV-1 tat interactive protein, 60kDa：TIP60 centromere protein-C：CENP-C

phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha：PI3KCA human epidermal growth factor receptor 2：HER2

human telomerase reverse transcriptase：hTERT hosphatase and tensin homolog：PTEN

atypical endometrial hyperplasia：AEH catenin beta 1：CTNNB1

kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog：K-Ras serous tubal intraepithelial carcinoma：STIC breast cancer：BRCA

loss of heterozygosity：LOH

AT-rich interaction domain 1A：ARID1A hepatocyte nuclear factor 1-beta：HNF-1β

glioma tumor suppressor candidate region gene 2：GLTSCR2 ataxia telangiectasia mutated：ATM

ataxia telangiectasia and rad3-related protein：ATR

(13)

checkpoint kinase：CHK alternative reading frame：ARF ribosome protein L11：RPL11

quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction：qRT-PCR immunohistochemical staining：IHC

American Type Culture Collection：ATCC glutamine：Gln, Q

arginine：Arg, R

single-strand conformation polymorphism：SSCP moloney strain of murine leukemic virus：M-MLV deoxynucleotide triphosphate：dNTP

placenta：pl primer set：P

small interfering RNA：siRNA wild-type：WT

cysteine：C alanine：Ala, A lysine：K

phenylalanine：F histidine：H aspartic acid：D

labeled streptavidin biotinylated antibody：LSAB odds ratio：OR

confidence intervals：CI forward：F

reverse：R proline：P serine：S glysin：G

(14)

isoleucine：Ile methionine：Met threonine：Thr

single nucleoid polymorphism：SNP coding-SNP：c-SNP

silent-SNP：s-SNP trypsin：W

transforming growth factor beta- receptor 1：TGFβR1

(15)

5.

研究の背景と目的

5-1.

一般的な発癌機序

我々の細胞では、細胞増殖を促進する癌原遺伝子と、細胞増殖を抑制する癌抑制遺伝子がバランスを保って機能し、正常な細胞増殖が制御されている。しかし両者のバランスの崩壊は、無秩序な細胞増殖を招き、細胞は発癌へと至る (図 1)。この原因には、質的異常として遺伝子変異による癌原遺伝子の活性化または癌抑制遺伝子の不活性化と、量的異常として様々な要因で生じる癌原タンパク質の増加または癌抑制タンパク質の減少が挙げられる (図 1)。一般的に、発癌に至る際には、十数年という長い期間をかけて、複数の癌原遺伝子・癌抑制遺伝子の異常が蓄積する(1)。

当然、我々の細胞には発癌を防ぐ機構が備わっており、その代表例が癌抑制遺伝子 p53

およびretinoblastoma (RB)の癌抑制機能である。P53はDNA損傷や低酸素等の各種ストレ

ス、癌原遺伝子の活性化、テロメアの短縮等の細胞異常に反応して安定化・活性化し、様々な標的遺伝子の転写を活性化する。その結果、細胞増殖の停止や DNA 損傷に対するチェックポイント機能の活性化、さらに DNA 損傷が修復できない場合は、強力かつ持続的に活性化したp53が細胞老化やアポトーシスを誘導する。正常な細胞では、p53は、E3ユビキチンリガーゼの一つmouse double minute 2 (MDM2)により低レベルに維持される。しかし細胞にストレスや細胞異常が加わると、脱ユビキチン化酵素 ubiquitin specific protease

(USP) 7がp53と結合してポリユビキチン鎖を外すことで、p53は瞬時に安定化・活性化し、

細胞の癌化を抑制する要として機能する(2,3)。

RBは細胞周期を制御し、G1期に自身のABポケット領域を介してE2Fと結合することで、E2Fの標的遺伝子の転写活性化機能を抑制し細胞周期を停止する。加えて、DNA損傷等でG1チェックポイントが活性化すると、活性化p53がp21, p27を介して細胞周期を停止し、DNA修復後に細胞周期が再開される(4)。また、修復しきれないDNA損傷が生じた場合はアポトーシスを誘導することで、DNA異常を娘細胞に引き継ぐことを防ぐ(5)。しかし婦人科癌を含む大部分の癌の発癌過程では、p53 および RB 経路は不活性化されている。その結果、上記の癌抑制機構が破綻し、遺伝子変異を蓄積した細胞が無秩序に増殖し続け、最終的に発癌に至る。

(16)

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(17)

CIS)を合わせたCIN3の3つに分類される (図2A)。

HPVは約8,000塩基対の二本鎖DNAウイルスで、6つの初期遺伝子 (E1, E2, E4, E5, E6, E7)と2つの後期遺伝子 (L1, L2)、そしてウイルスDNAの複製や転写を調節するlong control

region から構成される (図 2B)(10)。口腔や性器粘膜に感染する α-HPV 属は、良性の性器

疣贅や尖形コンジローマ等の原因となる低リスク型HPV (HPV6, 11等)と、子宮頚癌や肛門癌、外陰癌、陰茎癌、頭頚部癌等の悪性腫瘍形成能を有する高リスク型HPVに分類される

(11-13) 。高リスク型HPVのうち、子宮頚癌の原因は、HPV16が半数を、HPV18型が10-20%

を占めるが、子宮頚部腺癌ではHPV18が約40%を占める(14,15)。

高リスク型HPVの引き起こす発癌には、HPVの産生するE6とE7の安定的な高発現が必須である(16)。子宮頚部の傷口から重層扁平上皮の基底細胞に感染したHPVは、感染初期では、HPV自身の産生するE2がE6, E7の発現を抑制し、HPV DNAをepisomalな状態 (宿主細胞の染色体に組込まれず、環状 DNA の状態のこと)で比較的低コピー数に維持する (図2B)(17,18)。一般的に、約80%の女性が一生涯にHPVに感染するが、HPV DNAがepisomal な状態では、HPV感染の大部分は宿主の免疫応答により1年以内に排除され、HPV感染で生じた異形成も約3年以内に自然治癒する(19)。しかしHPV感染者の約10%で3年以上の持続感染が成立し、CIN2/3の段階でHPV DNAがintegration (E2領域の切断で環状から線

状DNAとなったHPV DNAが、ヒト染色体へ組込まれること)されると、宿主細胞内でE6,

E7が安定的に高発現する (図2B)(9,20)。その結果、免疫応答の抑制・不死化・形質転換・

アポトーシスの抑制・細胞分化の抑制等の細胞内の様々な癌抑制機構の破綻やゲノム不安定性を引き起こし、子宮頚癌への発癌が進行する(9)。

高リスク型HPVの引き起こす発癌過程で、E6の最も重要な機能は p53の不活化である (図2C)。高リスク型HPV E6は、宿主細胞内のHECT型E3ユビキチンリガーゼであるE6 associated protein (E6AP)と結合し、E6APの基質特異性を変えてp53 のユビキチン化と分解を促進する(21,22)。一方、低リスク型HPV E6はC末領域でp53と結合するが、p53の分解は促進しない(23)。さらに、高リスク型HPV E6はCREB binding protein (CBP)/p300, HIV-1 tat interactive protein, 60kDa (TIP60)等の機能を阻害することでp53のアセチル化を阻害し、

p53の標的遺伝子の転写活性化を抑制する(24-26)。このように高リスク型HPV E6 は、二重にも三重にも巧妙にp53の活性化を阻害し、宿主細胞の形質転換を促進する。また我々は、宿主細胞に恒常的に発現する脱ユビキチン化酵素USP15とE6が結合し、E6が宿主細

(18)

E7はRBのABポケット領域に結合することで、RBとE2Fの結合を競合阻害し、E2F1/2/3 の遊離とその恒常的な活性化を招く (図 2C)。低リスク型と比べて、高リスク型 HPV E7 はより強くRBを不活化する(28)。また我々は、高リスク型HPVが引き起こす新たな発癌機序として、E7が動原体構成要素の一つcentromere protein-C (CENP-C)と結合し、CENP-C と α-サテライト DNA の結合を阻害することを見出した。E7 は CENP-C と α-サテライト DNAの相互作用を阻害することで、正常な微小管と動原体の付着を阻害し、宿主細胞の染色体分配異常や染色体異数性を直接引き起こす (図3B)(29-31)。

さらに子宮頚癌の発癌では、様々な癌遺伝子や癌抑制遺伝子の異常が蓄積する。例えば、

phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha (PI3KCA) (3q26.3; 43%), cyclin D1 (11q13.3; 12%)の増幅は正常子宮頚部からCIN1への進行段階で、human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu) (17q21.2; 29%), human telomerase reverse transcriptase (hTERT) (5p15.33; 33%)の増幅はCIN1からCIN2への進行段階で、c-myc (8q24; 25%)の増幅はCIN2からCIN3への進行段階で、CIN3から子宮頚癌への進行段階ではPI3KCA活性化変異が生じる(32,33)。さらに、phosphatase and tensin homolog (PTEN)プロモーター領域の過剰メチル化がCIN2/3の40%、浸潤癌の60%で報告されている(34)。

(19)

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CIN1

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CIN3

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E6/E7

HPV DNA integration HPV DNA episomal

HPV DNA

A

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E1

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E2

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<Episomal> <Integration>

E2

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(20)

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HPV

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E6

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A

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(21)

5-3. Ĭĵ¡ȁ*ȃȁƺŒ

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(22)

5-4.

卵巣癌の発癌機序

日本では、近年、卵巣腫瘍の患者数が増加傾向にあり、毎年約8,300人が罹患している。

国立がん研究センターがん対策情報センターによれば、卵巣癌の5年生存率は過去20年間で改善がみられず、毎年約4,600人が死亡している。正常な卵巣は2~3 cmの臓器で骨盤腔の奥に位置するために、卵巣腫瘍は発症に伴う自覚症状に乏しく、早期の発見が困難であり、卵巣癌患者の約70%が進行癌で発見される(47)。

卵巣癌の約90%以上を占める上皮性卵巣癌は多様な組織型を示し、2016年に病理組織学的に5つに分類された。すなわち、漿液性癌を2つに分類し、高異型度漿液性癌と低異型度漿液性癌、さらに類内膜癌、明細胞癌、粘液性癌である (図 5A)。これまで、全ての卵巣癌の発生起源は、排卵時に生じた傷から卵巣表層上皮が卵巣間質内へ陥入し形成された表層上皮性封入嚢胞、つまり「卵巣自身」であると考えられてきた。封入嚢胞には、様々な細胞ストレスが原因で遺伝子変異が蓄積し、卵管上皮・子宮内膜・子宮頚管腺に化生を起こすことで、多様な組織型を示す上皮性卵巣癌が発症するとされてきた(48,49)。しかし最近、一部の卵巣癌は卵巣以外の組織、例えば卵管を構成する卵管釆や卵巣子宮内膜症から発生し、二次性に卵巣と関係するという説が提唱された (図 5B)(50,51)。このように卵巣癌は、その発生起源や発癌機序の分子生物学的違いにより、不均一で複雑な組織型を示し、さらに各々の腫瘍細胞で化学療法への反応性や治療効果も異なる(52,53)。

高異型度漿液性癌は上皮性卵巣癌の約34%を占め、約80%が診断時に進行したステージで腫瘍が卵巣を超えて進展し、卵巣癌の死亡者の約90%を占める。高異型度漿液性癌の発生起源に関しては、2001 年に卵管采に生じた卵管上皮内癌 (serous tubal intraepithelial

carcinoma; STIC)と高異型度漿液性癌の因果関係について初めて示された(54,55)。加えて最

近、不死化した卵管上皮細胞から高異型度漿液性癌を作り出すことに成功し(56)、現在で

は50~60%の高異型度漿液性癌は、卵管に生じたSTICが二次性に卵巣に浸潤・転移するこ

とに由来すると報告されている (図 5B)(57,58)。高異型度漿液性癌は、大部分に p53 異常が生じ(59,60)、さらに DNA 損傷修復に関与する breast cancer (BRCA)1/2の機能不活化が 40-50%にみられ、高度な染色体不安定性に陥っている(61)。Cancer Genome Atlas Network は、高異型度漿液性癌の発癌に関与するその他の分子生物学的異常として、67%に RB 経路の異常、45%にPI3K/Akt, PI3K/RAS経路の異常、51%に相同組換え修復経路の異常、22%

にNotch経路の異常を報告している(62)。

(23)

低異型度漿液性癌は上皮性卵巣癌の約 5%を占め、その大部分が診断時に卵巣内に限局し、高異型度漿液性癌よりも予後が良い。発生起源である卵巣表層上皮は、封入嚢胞を形成後、卵管上皮へ化生し、漿液性腺腫、漿液性境界悪性腫瘍を経て、低異型度漿液性癌に

至る (図 5B)(63)。この組織型の発癌機序では、K-Ras-BRAF-MEK-MAPK シグナル経路の

活性化が60~70%に認められる(64,65)。

類内膜癌は上皮性卵巣癌の約16%を、明細胞癌は約23%を占める。両者の発生起源は卵巣子宮内膜症で (図 5B)、日本の卵巣子宮内膜症患者6,398 人を対象にした最長17年間の前方視的な調査は、子宮内膜症患者の 0.72%が卵巣癌へ進行していたことを報告した

(66,67)。卵巣子宮内膜症は、封入嚢胞の子宮内膜細胞への化生や、月経時の月経血逆流に

よって子宮内膜細胞が卵管を通って卵巣へ異所性に着床することで生じる(68)。卵巣子宮内膜症を起源とする発癌時には、子宮内膜症の内容液が自由鉄を豊富に含むため、高度の酸化ストレスや DNA 損傷が子宮内膜症を構成する細胞に加わる(69)。また、癌に近接する子宮内膜症、類内膜癌、明細胞癌に各々みられる共通した異常として、PTEN が存在する10q23.3のloss of heterozygosity (LOH) (各々56.5%, 42.1%, 27.3%)や PTEN体細胞変異 (各々20.6%, 20.0%, 8.3%)(70)、PTENの発現消失 (各々60.0%, 38%, 37.5%)(71,72)、AT-rich interaction domain 1A (ARID1A)体細胞性変異 (各々100%, 46%, 30%)やARID1Aの発現消失 (各々100%, 42%, 31%)(73,74)、PIK3CA活性化変異 (各々90%, 12%, 25%)(75,76)が挙げられる。さらに、類内膜癌の発癌機序では、エストロゲンの長期的な刺激(77)や、CTNNB1 活性化変異 (38-50%)を介した Wnt/β-catenin経路の異常(78)が認められる。また、大部分の明細胞癌にみられるhepatocyte nuclear factor 1-beta (HNF-1β)の過剰発現は、細胞質へのグリコーゲンの蓄積や抗アポトーシス作用、化学療法への抵抗性等の明細胞癌の特徴的な病態を形成する(79,80)。

粘液性癌は上皮性卵巣癌の約12%を占め、封入嚢胞が子宮頚管内膜へ化生を起こすことで粘液性腺腫から粘液性境界悪性腫瘍を経て生じるが、正確な発生起源については未解明である (図5B)(50)。粘液性癌の発癌機序では、K-Ras活性化変異 (腺腫, 55.7%; 境界悪性腫瘍, 73%; 粘液性癌, 85%)(81)や、HER2/neuの遺伝子増幅と過剰発現 (15%)(82)が認められる。

(24)

č5ˤèŉȁ*ȃȁƺŒ&ȃǱʐǛ

(A) Ȇūèŉȁ+˞ǹđŔǝǔūȁ ǹđŔǝǔūȁ˚ÂɒȁƟȯɉȁȪǔū ȁ)ĠÉ˚<ôȃȁƺŒǹ(;(B) <2%Ľ¾ćɉ)Ȟ*ÞǱǱ

$èŉȁ+Ǳ;&ɂ9<$<)Ø$Ǯď%+èȨȆ7ĬĵÂɒȯ ɉȤ*èŉĞ*ȱȼèŉȁ*ȃǱʐǛ&(;&Ɵ9)(!

( )

(34%) (5%) (16%) (23%) (12%)

p53 BRCA

K-Ras BRAF PIK3CA

PTEN PIK3CA ARID1A

()

PTEN PIK3CA ARID1A

HNF-1!

K-Ras HER2/neu

A

B

() HNF-1!

B

SCOUT

STIC STIN

(25)

5-5. PICT-1

について

PICT-1は別名glioma tumor suppressor candidate region gene 2 (GLTSCR2)と呼ばれる核小体タンパク質で、478 個のアミノ酸をコードし、グリオーマや卵巣癌で高頻度に欠失がみられる染色体 19q13.3 に位置する(83)。現在までに様々な悪性腫瘍の発癌過程において、

PICT-1の遺伝子変異や、mRNA・タンパク質の発現減少が報告されている (表1)(84-94)。

PICT-1は様々な癌抑制タンパク質と相互作用し、癌抑制機能を発揮する (図6A)。例え

ば、PICT-1はPTENと結合して、PTENのリン酸化を促進することで安定化し、増加した

PTENが腫瘍形成を阻害する(95)。またPICT-1は、PTEN や merlinと相互作用してアポトーシスを促進する(96,97)。さらにPICT-1は、mycと結合して発癌を促進するnucleophosmin の分解を促進するとともに、myc-nucleophosmin複合体による転写活性化を阻害する(98)。核小体に局在するPICT-1 は、他の核小体タンパク質と同様に、低酸素(99)やDNA損傷

(100)、リボソームストレス(101)等の細胞ストレスに反応して、その発現が増加し核小体か

ら核質へ移行する。核質へ移行したPICT-1は、ataxia telangiectasia mutated (ATM)とataxia telangiectasia and rad3-related protein (ATR)のリン酸化を促進し、ATM-checkpoint kinase

(CHK)2やATR-CHK1 経路を活性化して DNA損傷修復を促進する(100)。また、核質局在

PICT-1は、MDM2による p53のユビキチン-プロテアソーム系による分解を抑制し、安定

化したp53を介して細胞増殖の抑制やアポトーシスを誘導する (図6B)(101)。さらに最近、

核質でMDM2によるp53ユビキチン化・分解を阻害するalternative reading frame (ARF)と核小体内で結合してARFの核質移行を促進することや(102)、核小体局在のPICT-1がリボソーム RNA 転写を阻害することでオートファジーを誘導して細胞増殖を抑制すること

(103)が報告された。このように PICT-1 は、様々なタンパク質との相互作用を介して、癌

抑制機能を発揮する癌抑制遺伝子であると考えられている。

一方、核小体内で、ribosome protein L11 (RPL11)を介してp53分解を誘導することが報告された(104)。また、野生型p53をもつ胃癌患者ではPICT-1 mRNAの低発現と予後良好が

相関し(105)、野生型 p53をもつ肝癌患者ではPICT-1 mRNAの高発現と予後不良が相関す

ること(106)が報告された。このように、PICT-1の異常と発癌との関係、さらに細胞内での

PICT-1の制御機構については依然として未解明である。

(26)

ɦ1 PICT-1*ǹō&ȁ

qRT-PCR; quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, IHC;

immunohistochemical staining.

PICT-1 qRT-PCR, Western blot,

direct sequence

PICT-1 ,

PICT-1 [84]!

IHC PICT-1 [84]!

RT-PCR, Western blot,

RNA-sequence PICT-1 PTEN [85, 86]

IHC PICT-1 [87]

qRT-PCR PICT-1 [88]

IHC PICT-1 Fuhrman nuclear grade

[89]

IHC PICT-1 Gleason’ score [90]

qRT-PCR, IHC PICT-1 , ,

, [91]

IHC PICT-1 [92, 93]

Microarray assay PICT-1 [94]

qRT-PCR PICT-1 p53

[105]

qRT-PCR PICT-1 p53

[106]

(27)

č6ˤPICT-1*Ȋ£ǳ˓ē8-p53Ïţƺƶ&PICT-1*ŞÕ

(A) PICT-1+Ǩ)Cƪ˓ē>$Ʒ(W}dJʌ&Ȋ£ǳȁżÏƺɊ>ȃƍ

;(B) ȯɉ)DNAƎ·Ȥ*ȯɉS]{SØ=;&USP7)8;p53*ɋwfIY }Þªʡ<p53 +įıÞ;Ø$ȯɉS]{S)Ū$ƴŀ¡9ƴʌ/Ȝ

ɤPICT-1+MDM2)8;p53wfIY}Þ>ʽĶ;&%p53*įıÞ)ʻ

;

5-6. ƫȒȠ*ȈȄ

PICT-1+Ʒ(W}dJʌ&*Ȋ£ǳ>$ȁżÏȄ)ƺɊ"*ȁ)

$ʩĬĝǹ7ȃǮʳ*ǹōĖü<$;īșȁ*ȃȁ);PICT-1*Ş Õ+Ɵ9)(!$(2PICT-1*Ïţƺƶ)"$6ƩɵƟ% ;%ƫȒ

Ƞ%+PICT-1 *Ïţƺƶ>Ɵ9);&&6)īșȁ*ȃȁ); PICT-1 *

ŞÕ>Ƶɸ;&%Ƙ(ȁɺƗ~ǊȀǍ*ʹȃ)ñƻ(ȃȁƺŒ*ƛ>ɵƟ

;&>ȈȄ&

478 (a.a.) 432

400

63 149 181 347

1 342

Interaction with nucleophosmin and its degradation PTEN-modulated apoptotic cell death

Interaction with PTEN and its stabilization

Formation of oligomerlization Induction of autophagy in nucleolus Interaction with p53 and its stabilization

A

B

^P53

PICT-1 p53

MDM2 USP7

MDM2 p53

⬆

p53 p53

PICT-1

P53

478 ( 432

400

63 149 181 347

1 342

PICT-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

(28)

6.

実験方法

6-1.

細胞株と患者検体

子宮頚癌細胞株 (HeLa S3, Ca Ski, SiHa, C-4I, ME-180, HT-3, C-33A)、子宮体癌細胞株 (Ishikawa, Hec 1A, Hec 1B, RL95-2, KLE, AN-3)、卵巣癌細胞株 (Caov-3, Caov-4, OVCAR-3, SKOV-3, Kuramochi, ES-2, JHOC-6, SMOV-2, Tov-112D, PA-1)、および293T株を解析に用い

た。Ishikawa 株は西田正人先生から供与していただき(107)、その他の株は American Type

Culture Collection (ATCC)より購入した。すべての細胞株は、10% fetal bovine serumおよび 1% 抗生物質を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Mediumを用いて37℃、5% CO₂下にて培養した。

患者検体は外科的に摘出された47例の子宮頚癌検体、34例の子宮体癌検体、34例の卵巣癌検体を-80℃で凍結し、抽出した核酸を解析に使用した。これら検体のうち、10 例の子宮頚癌検体、10例の子宮体癌検体、20例の卵巣癌検体をPICT-1の全coding領域の遺伝子変異解析に用いた。

また、PICT-1 codon 389 の遺伝子多型 [rs1804994; codon 389 の glutamine (Gln, Q)を

arginine (Arg, R)に置換]の解析には、これら手術時摘出検体全例に加えて、パラフィン包埋

された15例の子宮頚癌検体、15例の子宮体癌検体、30例の非担癌患者の子宮から抽出した核酸を解析に用いた。つまり、rs1804994の解析には、子宮頚癌では7例の子宮頚癌細胞株と62例の子宮頚癌患者検体 (47例の手術時摘出検体と15例のパラフィン包埋検体)、子宮体癌では 6 例の子宮体癌細胞株と 49 例の子宮体癌患者検体 (34 例の手術時摘出検体と 15 例のパラフィン包埋検体)、卵巣癌では 11 例の卵巣癌細胞株と 34 例の卵巣癌手術時摘出検体を用いた。また30例の非担癌患者の子宮は、健常群のrs1804994の頻度の検討に用いた。これらすべての患者検体は、旭川医科大学にて手術時に摘出された検体を供与していただいた。

また、本研究は熊本大学倫理委員会 (承認番号ゲノム第262号、倫理第748号)および旭川医科大学倫理委員会 (承認番号 1146)の承認と、ヘルシンキ宣言倫理ガイドラインに基づいて行った。

(29)

6-2. RNA

抽出、

RT-PCR、 single-strand conformation polymorphism (SSCP)、

PICT-1

増幅産物のクローニング

グアニジンチオシアン酸塩法 (ISOGEN; Nippon Gene, Tokyo, Japan)によってtotal RNA を抽出し、200 unitsのmoloney strain of murine leukemic virus (M-MLV)逆転写酵素とoligo (dt) primersまたはrandom primers (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてcDNAを合成した。

PICT-1 全 coding 領域の PCR-SSCP と DNA シークエンスを用いた解析のために、0.5 µM primers, 10x HF buffer 1 µl, 0.2 µM deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 1.5 mM MgCl2, 1.0 unit Platinum Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen)を含む全量10 µl のPCR反応をPC 320 サーマルサイクラー (ASTEC, Fukuoka, Japan)を用いて行った。PCRの反応条件は、94℃, 2 分 (pre-heating)の後, 94℃, 30秒 (denaturation), 50-60℃, 30秒 (annealing), 68℃, 30-60秒 (extension)を35サイクル行った。

PCR-SSCP解析に使用したprimer setの位置とその配列を図7および表 2に示す。Primer set 1を用いて得られた458 bpの増幅産物をtemplateにprimer set 2および3を用いてnested PCR を行なった。同様に primer set 8 を用いて得られた 585 bp の増幅産物を template に primer set 9および10を用いてnested PCRを行なった。これらnested PCRの増幅産物に99%

ホルムアミド (nacalai tesque, Kyoto, Japan)を加えて95℃で5分間熱変性し、SSCP解析に用いた。また、手術時摘出検体においては、primer set 5を用いて得られた474 bpの増幅産物をtemplateにprimer set 6および7を用いてnested PCRを行なった。この nested PCRの増幅産物に50 µM NaOH (nacalai tesque)を加えて50℃で10分間熱変性し、SSCP解析に用いた。熱変性させた検体は、electrophoresis gel (Gene Gel Excel 12.5/24 Kit; GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, England)を用いて5℃または15℃, 600V, 80分間電気泳動を行なった後、

銀染色 (DNA Silver Staining Kit; GE Healthcare UK Ltd.)にて解析した。SSCPにて正常コントロールの胎盤 (placenta; pl)とバンドパターンが異なる検体については、DNAシークエンス (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) によって遺伝子変異を同定した。また、明瞭なnested PCR産物が得られなかったprimer set 4領域および細胞株におけるprimer set 5領域は、直接DNAシークエンスを行った。

RL95-2株では、認めた2つの変異を含む領域をprimer 4Fとprimer 9Rを用いて増幅し、

得られた増幅産物をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen)によりクローニング後、

(30)

č7ˤPCR-SSCPɵƮ)¤ǳprimer set

Primer set 1, 4, 5, 8>ǳ$PICT-1*¿coding˓ē>û48)PCR>ɤ!<9>

template)primer set 2, 3, 6, 7, 9, 10>ǳ$ nested PCR>ɤ(PCRǲǧ>SSCPɵƮ

)¤ǳPrimer set 4˓ē8-ȯɉƳ%*primer set 5˓ē+¿¥DNAQL}S

>ɤ(!Primer set, P.

6-3. DNA ſÈ& genomic DNA * SSCP ɵƮ

Rs1804994 *ɵƮ*5)dxhB}ÝĒ< 15 ¥*Ĭĵ˔ȁƵ¡15 ¥*Ĭĵ

¡ȁƵ¡30¥*ˍƀȁŭɃ*Ĭĵ>ô4 µm%ɡÊŠTakara DEXPAT (Takara, Shiga, Japan)>ǳ$genomic DNA>ſÈPCR-SSCPǍ%rs1804994*˗Ŕ>ɵƮPCR

* í Ū Ƭ + 94$, 2 É (pre-heating)* Š, 94$, 30 Ț (denaturation), 55$, 30 Ț (annealing), 68$, 30 Ț (extension)> 25 OCJzɤŢ9<ĚŎǲǧ> template ) primer set 12>ǳ$nested PCR>ɤ(!*nested PCRĚŎǲǧ>SSCPɵƮ)¤

ǳ

6-4. âıʳȄ RT-PCR

PICT-1 mRNA ȃǮʳ>ıʳ;ƙǍ&$âıʳȄRT-PCR >ɤ(!PCROCJ zƔ+ôO}jz20, 25, 30, 35OCJzɤĚŎǲǧjx])ʥ;Ñ*25OC Jz%ɤ(!Ţ9<c}^+ImageJ software (NIH)>ǳ$Ɣ±ÞÂʪƸǜ&

$¤ǳ!-actin mRNA %ɪƾPCR)+PICT-1+primer sets 4>!-actin+ɦ 2)ȕprimer set>¤ǳ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

P1 P4 P5 P8

1 st PCR primer set

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

P2 P3 P6 P7

Nested PCR primer set

P2 P3 P6 P7

P9 P10

(31)

6-5. USP7

ノックダウン

USP7のノックダウンにはUSP7特異的small interfering RNA (siRNA)を、コントロールとしてsiGENOME Non-Targeting siRNA #1 (D-001210-01-05)を使用し、各々のsiRNA 100pmol をLipofectamine RNAiMax (Invitrogen)を用いて導入した。USP7特異的siRNAの配列は以下の通りである。

Sense 5’ – CCC AAA UUA UUC CGC GGC AAA UU – 3’

Antisense 5’ – UUU GCC GCG GAA UAA UUU GGG UU –3’

6-6. Plasmid

作製と

transfection

HA-tagged p53, HPVs E6の作製では、ヒトp53とHPVs E6 cDNAをpCMV-HA expression vector (BD Science, San Jose, CA)に組み込んだ。FLAG-tagged PICT-1, USP15, HPVs E7の作製では、ヒトPICT-1、USP15とHPVs E7 cDNAをpFLAG-CMV-2 expression vectorに組み込んだ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。HPVs E6, E7 cDNA は、JCRB gene bank (National Institute of Biomedical Innovation, Osaka, Japan) より得たplasmid DNAをtemplateにPCRを行うことで作製した。ヒトPICT-1 cDNA を得るために、前濱朝彦先生 (国立感染症研究所) より供与していただいたpEF1-MycHisA-PICT-1 expression plasmid DNAをtemplateにPCR を行った(95)。この PICT-1 plasmid は codon 235 (rs1042558), 389 (rs1804994), 407 (rs11083695)に遺伝子多型を含んでいたため、野生型PICT-1 cDNAをGene Art Site-Directed Mutagenesis PLUS Kit (Invitrogen)を用いて作製した (表2)。FLAG-tagged USP7 expression vectorは、pact-FLAG-USP7 wild-type (WT)および、codon 223のcysteine (C)をalanine (A)に置換したmutant (C223A)と、codon 869のlysine (K)をphenylalanine (F)に置換したmutant

(K869F)を石井俊輔先生 (理化学研究所)より供与していただいた (図 8)(108)。これら

expression plasmidsはLipofectamine LTXまたはLipofectamine 3000 (Invitrogen)を用いて一過性に強制発現した。

(32)

č8ˤƫȒȠ%¤ǳUSP7 mutant plasmid

USP7 C223A mutant + USP7 *ɋwfIY}ÞʬȮǏū>ǘŁ(109)USP7 K869F

mutant+USP7*wfIY}ÞʽĶ<įıÞ;(110)Histidine, H; aspartic acid, D.

6-7. Western blot Ǎ

Ĕ˛ȯɉ9*W}dJʌſÈ+lysis buffer [150 mmol NaCl, 50 nmol Tris (pH 8.0), Halt TM Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)]%nu R_CP (Sonifier 450; Branson, Kanagawa, Japan)>ǳ$ǈÅ(9ſÈŢ9

<nRa]+15,000rpm, 4$, 10ÉʺʧŨW}dJʌſÈǔ&$Ǘ>Ĉî

<9W}dJʌ+8-15% SDS-PAGE)$ÉˉŠPDVFt}i{} (GE Health- care UK

Ltd.))30V, 6Ơʺ*Ƭ%ˋǆȄ)ʕÄt}i{}>4% skim milk%i|ZI}K

Š1ƼŽ¡>íŪƼ%ʨÊ(peroxidase-conjugated 2ƼŽ¡>ĴǙ1ƠʺíŪ c } ^ * Ƶ È + Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare UK Ltd.)>ǳ$ƵÈ1ƼŽ¡)+Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas) ȗ* anti-PICT-1 (C-20; sc-46615)& anti-p53 (PAb 1801; sc-98)Ž¡Sigma-Aldrich ȗ*

anti-#-actin (A5316)anti-FLAG M2anti-USP7 (PLA0009)Ž¡Roche (Indianapolis, Ind.)ȗ

*anti-HAŽ¡GeneTex (Irvine, CA)ȗ*anti-beta Tubulin (GTX101279)Ž¡>¤ǳ 2c}^*ıʳ+ImageJ software>ǳ$ɵƮ

1 53 560 1102

TRAF -like

Catalytic core;

C223, H464, and D481

HUBL

1 2 3 4 5

208

C223A; the inhibition of de-ubiquitinating enzyme activity

K869F; the inhibition of USP7 ubiquitination USP7

TRAF

1 2 3 4 5

(33)

6-8.

免疫組織染色

免疫組織染色に用いた検体は次の通りである。子宮頚癌の解析では17 例の CIN、30 例の子宮頚癌、36 例の腫瘍に近接する正常子宮頚部、子宮体癌の解析では 8 例の AEH、33 例の子宮体癌、16 例の腫瘍に近接する正常子宮体部、卵巣癌の解析では 23 例の子宮内膜

症、27例の腺腫 (14例の漿液性と13例の粘液性)、10例の境界悪性腫瘍 (5例の漿液性と

5 例の粘液性)、55 例の卵巣癌 (17 例の高異型度漿液性癌、6 例の高異型度漿液性癌、16 例の類内膜癌、12 例の明細胞癌、4例の粘液性癌)、腫瘍に近接する 37 例の正常卵巣表層上皮と9例の正常卵管上皮を解析した。これらすべての患者検体は、旭川医科大学にて手術時に摘出された検体を供与していただいた。

患者組織を4 µmで薄切し、脱パラフィン後、クエン酸buffer (pH 6)に浸し120℃で15 分間賦活化した。0.3% 過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ除去、イムノブロックによるブロッキングを行った後、1 次抗体に 800 倍希釈した PICT-1 (HPA018999;

Sigma-Aldrich)または1,000倍希釈したUSP7 (PLA0009; Sigma-Aldrich)抗体を用いて、4℃で一晩反応させた。本研究では、labeled streptavidin biotinylated antibody (LSAB)法に基づいた間接酵素抗体法によって、対象抗原を検出するため、ビオチン標識Igおよびアビジン-HRP (I-VIEW DAB ユニバーザルキット; Roche Tissue Diagnostics, Tokyo, Japan)を反応させDAB にて検出した。また、対比染色としてマイヤーヘマトキシリンにより核を染色した。

免疫組織染色による発現量の検討には、図9に示すexpression scoreを算出し検討した。

まず、染色強度を次の3段階に分類した: 0, negative; 1+, 弱陽性; 2+, 強陽性 (図9A)。さらに、陽性細胞の割合を次の5段階に分類した: 0, negative; 1, ≤25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; 4,

≥76%。最後にexpression scoreを算出し (expression score = intensity score × percentage score)、それらを次の4段階に分類した: 1, expression score 0-1; 2, expression score 2-3; 3, expression score 4-6; 4, expression score 8 (図9B)。

6-9.

統計処理

Rs1804994の頻度と子宮頚癌、子宮体癌、卵巣癌のリスクの関係を解析するためにχ²検

定を行い、odds ratio (OR)と95% 信頼区間 (confidence intervals; CI)の算出に 2 × 2 分割表

(34)

Kruskal-WallisƵı8-Steel-Dwass2+Mann-WhitneyƵı>¤ǳɔődxt

W&PICT-18-USP7 expression score*ʻ©>ɵƮ;5) Mann-WhitneyƵı 2+Kruskal-WallisƵı>¤ǳPICT-1&USP7 expression scoreʺ*Ȋʻʻ©>ɵ Ʈ;5)Spearman’s rank correlation>¤ǳƫȒȠ%+P-value <0.05)$Ʀű(

Ȋʻ&

ɦ2 PCR-SSCPɵƮâıʳȄRT-PCR8-site-directed mutagenesis)¤ǳprimer

Primer^* Product length Primer sets for SSCP analysis

1F CTGAGTTCTTCCTTTGAC 458 bp

1R CTGAGCTTCTTGGCGTTG

2F CTGAGTTCTTCCTTTGAC 264 bp

2R GGCCTCTGACAACAAGCC

3F CTACAGGAGCGCACGAGC 242 bp

3R CTGAGCTTCTTGGCGTTG

4F GAGAACACATCCAAAGTC 384 bp

4R GGATGGATTGTAGGAAGC

5F AGTGAAGCGGCCAGCACG 474 bp

5R GCCACCTGGGCCTTGATC

6F AGTGAAGCGGCCAGCACG 255 bp

6R ATCCGACTCCTCCAGCAG

7F CATTCCAGGAGCTGTGCG 259 bp

7R GCCACCTGGGCCTTGATC

8F CATTCCAGGAGCTGTGCG 585 bp

8R GCGAGTCTCCGGCATCTG

9F ACCAGGAGCTGTTCCGGC 232 bp

9R AACCGGTCTCGAAGGATG

10F GCTGACAGACTCGCTCAG 194 bp

10R GCGAGTCTCCGGCATCTG

11F GTGTAGAGAGAAGGTCTC 257 bp

11R GCCTGGTTCTCACTTGAG

12F CGGGTACAGCAGGCCGCG 175 bp

12R TGAGCCGCCCCAGCCTTC Primer sets for semi quantitative PCR for !-actin

!-actin (F) ACAATGAGCTGCGTGTGGCT 371 bp

!-actin (R) TCTCCTTAATGTCACGCACGA Primer sets for Site-Directed Mutagenesis

13F AAGCCGTCCCAGGCACCCGCCGTGGAGGTG 13R ACCTCCACGGCGGGTGCCTGGGACGGCTTG 14F AGCTGGCGCGGCGCAGAGGCGGCGGCAGG 14R GCCTGCCGCCGCCTCTGCCGCCGCGCCAGC 15F CCCCGAAGGCTGGGGCGGCTCAAGTACCAG 15R TGGTACTTGAGCCGCCCCAGCCTTCGGGGC

*PCR primer sequences used to generate a product of the indicated size, listed in a 5’-to-3’ orientation. F,forward; R,reverse.

(35)

č9ˤPICT-18-USP7*ưɛřŔ&expression scoreȧÈƙǍ

(A) PICT-18-USP7*ưɛřŔ>ř˃ū (2+)˃ū (1+)˂ū (0)*3ǂ˄)É$

ɻ¨(B) PICT-1&USP7*expression score+ưɛřŔ>3ǂ˄˃ūȯɉƔ>5 ǂ˄)É$ɻ¨ôƈõ=;&%ȧÈ

A

B

Intensity !

0% : 0 0&1 1

: 0 25% : 1 2&3 2

: 1

!

^26-50% ^{: 2} ^4&6 ³

: 2 51-75% : 3 8 4

76% : 4

Percentage Expression score

2+ 1+ !

PICT-1 intensity

USP7 intensity

2+

1+

2+ 1+