序 文
ヒトのウイルス性下痢症の主な原因ウイルスは ロタウイルス，アデノウイ ル ス 40!41 型，ノ ー ウォークウイルス（NV），サッポロウイルス（SV）， アストロウイルス（HAstV），アイチウイルスおよ びコロナウイルスである1）．その中でも NV，SV および HAstV は直径 30nm 前後のウイルスであ ることから，いわゆる 小型球形ウイルス と称 されるウイルスの一群であるが，食中毒の病因物 質として重要度が高いことから，1997 年 5 月，厚 生省は食中毒起因病原体に小型球形ウイルスおよ びその他のウイルスを追加し，食中毒発生時には ウイルスの検査が実施されている．一方，小型球
形ウイルスは食中毒のみならず小児科領域におい ても乳幼児感染性胃腸炎の起因ウイルスとして重 要であることから2）3），広島県における乳幼児の NV，SV および HAstV の流行状況と流行型につ いて検討したので報告する．
材料と方法 1．供試検体
1995!96 年 か ら 2001!02 年 の 冬 季 7 シ ー ズ ン
（各シーズン 10〜5 月）に，広島県内の医療機関
（小児科）で散発性感染性胃腸炎として採取された 糞便 525 検体（−80℃ 凍結保存）を対象とした．
供試した糞便の内訳は，女児では 1 歳未満 63 検体，5 歳未満 106 検体，10 歳未満 22 検体，10 歳以上 18 検体，不明 4 検体の計 213 検体，男児で は 1 歳未満 74 検体，5 歳未満 176 検体，10 歳未満 37 検体，10 歳以上 18 検体，不明 2 検体の計 307
乳幼児感染性胃腸炎患者における Norwalk virus ，Sapporo virus および Human astrovirus の検出状況と流行型
広島県保健環境センター微生物第二部
福 田 伸 治 宮 崎 佳都夫
（平成 15 年 4 月 23 日受付）
（平成 15 年 7 月 22 日受理）
1995!96 年から 2001!02 年の冬季 7 シーズンを対象に，広島県における乳幼児感染性胃腸炎患者の ノーウォークウイルス（NV），サッポロウイルス（SA）およびアストロウイルス（HAstV）の流行状況 と流行型を検討した．7 シーズンにおける NV の検出率は 23.6％（16.3〜34.4），SV は 2.5％（1.5〜4.7）お よび HAstV は 3.2％（1.5〜6.0）であった．NV は 11 および 12 月に流行のピークが認められたが，SV および HAstV には明らかな月集積性が認められなかった．検出された NV は遺伝子型 II が大部分を占 めており，そのプローブ型（Fukuda らのプローブ型）は G2F が最も多く，次いで G2E および G2B であっ た．NV のプローブ型には年により若干の違いが認められた．SV のプローブ型（Vinj!らのプローブ型）
は LON 型および SAP 型のいずれかであった．HAstV の血清型は 1 型が主流であった．
〔感染症誌 77：965〜970，2003〕
要 旨
別刷請求先：（〒734―0007）広島市南区皆実町 1―6―29 広島県保健環境センター微生物第二部
福田 伸治
Key words： Norwalk virus,Sapporo virus,human astrovirus, child, gastroenteritis
Table 1 Incidence of gastroenteritis viruses No. of positive samples No. of
samples Season
HAstV SV
Adenovirus NV type 40/41 Rotavirus
2
2
21
10
61
1995/96
（3.3）
（3.3）
（34.4）
（16.4%）
5
5
22
1996/97
（22.7）
（22.7）
1
13
3
10
45
1997/98
（2.2）
（28.9）
（6.7）
（22.2）
1
2
7
1
12
43
1998/99
（2.3）
（4.7）
（16.3）
（2.3）
（27.9）
1
1
15
3
15
68
1999/2000
（1.5）
（1.5）
（22.1）
（4.4）
（22.1）
3
3
38
4
40
136 2000/01
（2.2）
（2.2）
（27.9）
（2.9）
（29.4）
9
5
25
12
36
150 2001/02
（6.0）
（3.3）
（16.7）
（8.0）
（24.0）
17 13
124 23
525 128 Total
（3.2）
（2.5）
（23.6）
（4.4）
（24.4）
NV, Norwalk virus；SV, Sapporo virus；HAstV, human astrovirus.
Table 2 Monthly incidence of Norwalk virus, Sapporo virus and human astrovirus between 1995/96 and 2001/02 season
Month Virus
MAY APR.
MAR.
FEB.
JAN.
DEC.
NOV.
OCT.
9.8 7.5
17.9 20.3
18.3 38.2
45.6 9.1
NV
3.3 3.0
0.0 0.0
1.4 6.7
1.3 9.1
SV
8.2 3.0
2.4 3.1
1.4 4.5
1.3 0.0
HAstV
NV, Norwalk virus；SV, Sapporo virus；HAstV, human astrovirus.
Numbers indicate percent of positive samples.
検体および性別不明 5 検体で，重複のない検体で ある．
2．NV，SV および HAstV の検出法
NV，SV および HAstV の検出は RT-PCR によ り行った．NV の検出プライマーには NV81!NV 82，SM82 お よ び Yuri22R!F4）を，SV に は Vinj!
ら5）の JV33!SR80 を，HAstV には Sakon ら6）の AC230!AC1 を用いた．
まず，糞便はリン酸緩衝液（PBS（−））で 10〜
20％ 乳剤とし，ハイドロクロロフルオロカーボン
（HCFC-141b）を約 1!5 量加えて振盪した後，2,500 rpm，30 分間遠心分離した．そして，遠心上清 250 µl を用いて，Trizol LS 試薬（Invitrogen）により RNA を抽出した．
逆転写反応は 5×RT buffer 4µl，dNTPs（各 2
mM 濃 度）4µl，ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ー（50µM，
Takara）1µl，ReverTra Ace（100u!µl，TOYOBO）
1µl，RNase インヒビター（40u!µl，TOYOBO）0.5 µl に RNA 抽出液 9.5µl を加えて行った．
NV，SV および HAstV の検出は NV81!NV82，
SM82 および AC230!AC1 プライマーを用いる系 と Yuri22R!F および JV33!SR80 プライマーを用 いる 2 系統の multiplex PCR で行った．PCR 反応 は 10×PCR buffer 5µl，dNTPs（各 2.5mM 濃度）4 µl，各 プ ラ イ マ ー（10µM）各 1µM，KOD Dash
（2.5u!µl，TOYOBO）0.5µl，逆転写産物 3µl を加え，
Diethyl Pyrocarbonate 処理水（DEPC 水）で全量 を 50µl とし，94℃3 分間加熱後，94℃30 秒間，50
℃15 秒間，72℃30 秒間を 40 サイクル行い，72℃
5 分間反応させた．
Table 3 Probe types of Norwalk virus in 7 cold seasons Probe type
No. of positives Season
G1A ＋ G2E ＋ G2F G2E ＋ G2F
G1A ＋ G2E G2F
G2E G2D G2C G2B G2A G1B G1A
18 1 2
21 1995/96
4 1
5
1996/97
4 8 1
13 1997/98
1 3
3
7
1998/99
11 3 1
15 1999/2000
1 13
20 2
2 38 2000/01
1 1
15 1
6 1
25 2001/02
1 2
1 68 33 1 2 12 4
124 Total
Probe types were classified into 8 groups, according to Fukuda et al.7） .
Table 4 Probe types of Sapporo virus in 7 cold seasons
Probe type No. of
positives Season
STO PAR SAP LON
1 1
2
1995/96 1996/97
1997/98
1 1
2
1998/99
1
1
1999/2000
3
3
2000/01
5
5
2001/02
7 6 13 Total
Probe types were classified into 4 groups, according to Vinjé et al.5） .
3．NV の型別
NV の型別には Fukuda ら7）の 8 プロ ー ブ セ ッ ト（G1A，G1B，G2A，G2B，G2C，G2D，G2E および G2F）を用いたマイクロプレートハイブリ ダイゼーションにより行った．
4．SV の型別
SV の型別には Vinj!ら5）の LON（一部改変，5 - GCATGCCRTTYACYAGTG-3 ）， SAP， PAR，
STO の 4 プローブを用いて，マイクロプレートハ イブリダイゼーションにより行った．
5．HAstV の型別
HAstV の型別には Sakamoto ら8）の型別用プラ イマーを用いて行った．
成 績
1．NV，SV および HAstV の検出率（Table 1）
冬 季 7 シ ー ズ ン の NV の 検 出 率 は 23.6％
（16.3〜34.4）であり，ロタウイルスと同程度であっ た．また，NV は 1 年周期で増減を繰り返している ことが認めれた．SV の検出率は 2.5％（1.5〜4.7）お よび HAstV は 3.2％（1.5〜6.0）であった．2001!02 シーズンにおける HAstV の検出率は他のシーズ ンと比較して高率であった．SV およ び HAstV の検出率はアデノウイルス 40!41 型の検出率に比 較してもやや低かった．
2．NV，SV および HAstV の月別検出率（Ta- ble 2）
NV は 11 および 12 月に流行のピークが認めら れ，対象とした 10 月から 5 月のすべての月で検出 された．また，シーズンによる変動は認められな
かった．SV は 2 月および 3 月を除き検出された が，月による明らかなピークは認められなかった．
HAstV は 10 月を除き検出されたが，SV と同様，
月による明らかなピークは認められなかった．
3．NV のプローブ型（Table 3）
冬季 7 シーズンの NV のプローブ型は G2F が 68 株と最も多く，次いで G2E，G2B，G1A，G2C，
G2D の順であり，複数の型に反応するものが 4 株 認 め ら れ た が，G1B お よ び G2A は 認 め ら れ な かった．また，遺伝子型 II が大部分を占めていた．
1997!98 年 お よ び 2000!01 年 は G2F よ り G2E が 多く認められたが，その他のシーズンは G2F が主 流であった．1998!99 年シーズンは NV の検出数 が少ないものの，G2B が約半数検出された．G1A の検出は少ないが，1999!2000 年シーズン以降に
Table 5 Serotypes of human astrovirus in 7 cold seasons
Serotype No. of
positives Season
8 7 6 5 4 3 2 1 2
2
1995/96
1996/97
1
1
1997/98
1
1
1998/99
1
1
1999/2000
1 2
3
2000/01
9
9
2001/02
1 2 1 13 17 Total
Serotypes were classified into 8 groups by the method of Sakamoto et al.8） .
認められ，それ以前には検出されなかった．
4．SV のプローブ型（Table 4）
SV のプローブ型はいずれのシーズンも LON 型か SAP 型に限られており，LON 型が 6 株，SAP 型 が 7 株 と ほ ぼ 同 数 で あ っ た．PAR 型 お よ び STO 型は認められなかった．
5．HAstV の血清型（Table 5）
HAstV の血清型は，1995!96 年から 1999!2000 年 シ ー ズ ン，2001!02 シ ー ズ ン は 1 型 が 主 流 で あったが，2000!01 年シーズンは 4 型および 5 型 が検出された．
考 察
NV，SV お よ び HAstV は プ ラ ス 1 本 鎖 RNA を遺伝子として持つ小型のウイルスであり，ヒト のウイルス性下痢症の病原体として重要である．
特に NV はわが国のみならず諸外国においても冬 季のウイルス性下痢症の原因となっている9）．
広 島 県 に お け る NV の 検 出 率 は SV お よ び HAstV に 比 較 し，23.3％ と 高 率 で あ っ た．NV はウイルス性下痢症の中でもロタウイルスと並び 主要な原因ウイルスであることが示唆された．ま た，NV の流行は 1 年周期の増減を繰り返してお り，検出率が高かった次の年は低い，低かった次 の年は高い傾向にあることが示唆された．NV は 寒い時期に流行する季節集積性が認められてい る9）．わが国では 11 月および 12 月に流行のピー クがあり1），広島県においても同様の傾向であっ
た．この月集積性は乳幼児のウイルス性下痢症の 主要なウイルスであるロタウイルスのそれとは明 確に異なることが認められた10）．NV は大きく 2 つの遺伝子型に分類されているが，広島県内で乳 幼児に流行する NV は大部分が遺伝子型 II であ り，遺伝子型 I は僅少であった．遺伝子型 II の中 でも主要な流行プローブ型は遺伝子型 II に属す る G2F，G2E および G2B であるが，シーズンによ り流行型に若干の違いが認められた．G2E，G2F および G2B は Ando ら11）の P2A，P2B および P1 B に相当し，このプローブ型の流行は広島県のみ ならずわが国の他の地域においても同様の傾向が 認められ，主要な流行型であることが示唆され た12）〜14）．また，2001!02 シーズンは G2B の占める 割合が高いことが認められた14）．今回は地域別の 流行状況は検討していないが，主要流行型は地域 により違いがあることも報告されており15），同 シーズンであっても地域により主要流行型は一律 でないことも示唆される．
SV の 検 出 率 は 数％で あ る と 報 告 さ れ て お り16），広島県においても 2.5％（1.5〜4.7）であり同 様の結果であった．SV の流行は NV のそれに比 較して小さいことが示唆された．月別検出率では 主だった傾向は認められなかった．SV のプロー ブ型も LON 型と SAP 型に限られており，年変化 も認められなかった．この流行型は，わが国の他 地域の報告を見ても同様であり16），わが国の SV の流行型は London 型あるいは Sapporo 型が主流 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た．SV の 遺 伝 子 型 は Schuffenecker ら17）により 3 つの遺伝子型に分類 されており，この分類に従うと，London 型は遺伝 子型 SG-II に，Sapporo 型は SG-I に属しており，
わが国では 2 つの遺伝子型が主に流行しているも のと考えられた．
広島県における HAstV の検出率は SV と同様，
3.2％（1.5〜6.0）と低くかったが，わが国の他の報 告 に お い て も 数％で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る8）．また，わが国における流行型は 1 型が主流で あり，次いで 3 型および 4 型であることが報告さ れており1）3）8）18），広島県においても同様の結果で あった．諸外国においても 1 型が主流であり1）3），
1 型は広く世界中に分布しているものと考えられ る．HAstV は冬季に流行することが認められてい る3）が，SV と同様年変化および流行月は明確でな かった．
いわゆる 小型球形ウイルス の中では，NV は食中毒などの集団感染性胃腸炎と同様，乳幼児 ウイルス性下痢症の主要ウイルスであること，流 行型の年変化および月集積性が存在することは明 確になったが，SV および HAstV の検出数は少な く，対象とした冬季に流行していることは確認さ れたものの，流行の月集積性など明確でないこと も多く今後の検討課題である．また，成人による SV 食中毒事例19）および HAstV による大規模集団 発 生 事 例 も 報 告 さ れ て お り20），NV の み な ら ず SV および HAstV による集団感染事例の発生に も注意する必要がある．
文 献
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Incidence and Prevalent Types ofNorwalk virus,Sapporo virusandHuman astrovirusin Pediatric Gastroenteritis in Hiroshima Prefecture
Shinji FUKUDA & Kazuo MIYAZAKI
Division of Microbiology II, Hiroshima Prefectural Institute of Public Health and Environment
The incidence and prevalent types ofNorwalk virus（NV）,Sapporo virus（SV）, andhuman astrovi- rus（HAstV）in pediatric gastroenteritis in Hiroshima Prefecture were investigated in 7 cold seasons, between 1995!96 and 2001!02. The incidences of NV, SV, and HAstV were 23.6％ ranging from 16.3 to 34.4, 2.5％ ranging from 1.5 to 4.7, and 3.2％ ranging from 1.5 to 6.0, respectively. The peak of the in- cidence of NV was found in November and December. No accumulation of monthly incidence in SV or HAstV was noted. Most NVs detected belonged to genogroup II. A probe type of G2F, according to Fukuda et al., was predominant in NV, followed by G2E and G2B. The probe types of LON and SAP, according to Vinje et al., were predominant in SV. Serotype 1 was predominant in HAstV.
