原 著

1 

原 著

品 文

2 

ブ ロ 一 ^{サ イ ト メ リ よ る}

^{。 ス ツ} 一 ^{ノ レ ヒ イ し}

3 

た ド ナ 一

^{、 ノ レ ク 中 コ 。 残 存 細 胞 コ 。 解 析}

4 

著 者 氏 名 事 会 木

_{池 田 裕}

若 林 干 日 イ

5  ^Z) 

く オ 里 子 克 己

磯 山 恵

6 

H 百 干 日 大

病 院 児 科

7  2) 

H 百 干 日 大

藤 ^{七 三} 丘 病 院 児 科

8  3) 

H 百 干 日 大

工 東 豊 割

病 院 児 内 科

9 

10  Key words,  donor hurran milk,  milk somatic cell,  flow cytometry, 

11 

12 

著 者 連 絡 先 H 百 干 日 大

病 院 児 科

13  T  142  8666 

東 京 都 品

区 旗 コ 。

^{、 ょ}

14  Department  of Pediatrics,  Showa University School of Medicine 

15  1 5 8 Hatanodai,  Shinagawa ku,  Tokyo 142 8666, Japan 

16 

17  E mail:  m suzuki

伽

18 

19 

20 

1 

要 約

2 

新 生 児 に お い て パ ス ツ ー ノ レ 化 し た ド ナ

3 

ノレク（OM ） の 使 用 は 人 工 乳 に 比 較 し て 壊 死 性 腸 炎

4  ( N E C ） の 擢 患 率 を 低 下 さ せ る と 報 告 さ れ て い る

5  こ れ は 母 乳 に 含 ま れ る 免 疫 物 質 が ［ M 精 製 に 必

6 

要 な 熱 処 理 後 も 存 在 し て い る こ と が 理 由 の ひ

7 

と つ と 考 え ら れ て い る 新 鮮 母 乳 に お け る 総

8 

細 胞 数 や

＋ 細 胞 数 細 胞 表 面 マ カ の 解

9 

析 の 検 討 は 数 多 く 行 わ れ て い る が 熱 処 理 後

10 

の 母 乳 す な わ ち

中 に 含 ま れ る 白 血 球 数

11  CD45

＋ 細 胞 数 生 細 胞 率 の 報 告 や 残 存 細 胞

12 

の 表 面 マ カ を 解 析 し た 報 告 は な い 今 回

13  OM

中 の 残 存 細 胞 数 と 細 胞 の 特 徴 を 明 ら か に す

14 

る 目 的 で ブ ロ サ イ ト メ ト リ ^FCM  を 用

15 

い て 熱 処 理 後 の 母 乳 中 細 胞 の 解 析 を 行 っ た

16  OM

中 の

＋ 細 胞 数 は

生 細 胞 数 は

17  4.  7±0. 32X104/ml

あ っ た

＋ 細 胞 の う ち

18 

T 細 胞 ） 、

B 細 胞 ） 、

NK 細 胞 は 全

19 

て

% 末 満 で

（ マ ク ロ ブ ア

土

± 

20  7.  4 % 

樹 状 細 胞 （

） は

% で あ っ

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

14 

15 

16 

17 

18 

19 

20 

た

け

す る

母 乳 中 の 樹 状 細 胞 は 児 の 免 疫 系 に 働 き か

腸 管 粘 膜 で 児 の

細 胞 B 細 胞 を H 府 活 化

と さ れ て お り 樹 状 細 胞 の 残 存 が OM に よ

る

発 症

｛ 氏 下 コ 。 因 に な っ て い る 可 能 性 が

司て〈

唆 さ れ た

1  Analysis of a Cell of Pasteurizecl Human Milk by Using Flow Cytometry 

2 

3  Manabu Suzuki, Hirokazu lkerla, Kazuyo WAkabayashi, Katsumi h

也

4  I:epartment of Pediatrics, Showa University School of Medicine, Tokyo, Japan 

" ^D 

6  Pasteurized human mill

三 （donorm

7  (NEC) in neonates compared to the use of formula. Based on reports, immunological 

8  subjects included in human mill三continueto persist even after Holder pasteurization 

9  and contribute to a neonate's immune system. There is no report pertaining to the 

10  somatic cell count (SCC) in donor milk. We analyzed a cell of donor milk by using flow 

11  cytometry. sec in donor mill三was4.7土0.32X 104/ml, the viable cell count was 2.2土

12  0.21X105/ml, and T cell, B cells, and natural killer cells were< 0.5%. Macrophages 

13  were noted to be 83.7土7.4%,and dendritic cell count was 62.8土26.1%.Dendritic cells m 

14  human milk reportedly act on the immune system of neonates. The possibility has been 

15  suggested that the ability of dendritic cells to su円 iveHolder pasteurization contributes 

16  to the reduction in the rate of onset of NEC. 

17 

18 

19 

20 

1 

^{目 的}

2 

昭 和 大 学 江 東 豊 洲 病 院 で は

3 

4 

" ^D 

パ ン ク を 開 設 し

、 ノ レ ク（OM ）の

使 用 を 行 っ て い る し カ 過 し 本 邦 全 体 で は

そ の 普 及 に 至 る に は い ま だ 安 全 性 の 啓 蒙

6 

有 用 性 の 提 示 が 不 足 し て い る 印 象 が 否 め な い

7  OM

は 人 工 乳 よ り も 壊 死 性 腸 炎 （NEC ） の 擢 患 率 を

8 

低 下 さ せ る と さ れ て お り 母 乳 に 含 ま れ る 免

9 

疫 物 質 が

精 製 に 必 要 な 熱 処 理 後 も 存 在 し て

10 

い る こ と が 理 由 の ひ と つ と 考 え ら れ て い る

11  OM

中 に 含 ま れ る 免 疫 物 質 の う ち

グ ロ ブ リ

12 

ン や サ イ ト カ イ ン の 含 有 量 を 検 討 し た 報 告 は

13 

散 見 さ れ る

は 、

中 の 免 疫

14 

グ ロ プ リ ン や サ イ ト カ イ ン を 解 析 し

% 程 度

15 

の 残 存 を 認 め た

と い う 結 果 で あ っ た 方

16 

で

中 の 正 確 な 白 血 球 数 CD45 ＋ 細 胞 数

17 

生 細 胞 率 の 報 告 は な く 残 存 細 胞 の 特 徴 を 解

18 

析 し た 報 告 は な い 今 回 我 々 は

の 細 胞 成 分

19 

に 関 す る 検 討 を 行 う 目 的 に FCM を 利 用 し て 細

20 

胞 数 と 細 胞 成 分 を 解 析 し た

1 

方 法

2 

母 乳 は

年

月 か ら

年

月 に 昭 和 大 学 江

3 

東 豊 洲 病 院

同 時 期

4 

に 同 院 の 母 乳 外 来 を 受 診 し た 母 親 か ら 採 取 し

" ^D 

6 

7 

8 

9 

10 

た 検 体 は 各 家 庭 で 搾 乳 さ れ た 後 に 各 家 庭 で

冷 凍 し 冷 凍 し た 状 態 で 母 乳 パ ン ク に 郵 送 さ

れ た 採 取 方 法 は 搾 乳 器 シ ン ブ オ ー

Swiss 

ま た は 用 手 搾 乳 で 行 っ た 郵 送 さ れ た

母 乳 は 母 乳 バ ッ グ カ ネ ソ ン 大 阪 を 使 用

し て

° C  

分 を 行 っ た 後

11 

に 再 び 冷 凍 し て 硬 質 プ ラ ス チ ッ ク の 容 器

12  Medela,  Swiss 

で

° C 以 下 で 保 存 し た

13  pasteurization

を 行 っ た 後 の 母 乳 を

と 定 義 し た

14 

解 析 は

作 成 か ら 約

か 月 後 に 施 行 し た

15  OM

を

° C の 冷 凍 庫 か ら 研 究 室 に 搬 入 後 、

入

16 

り の 硬 質 プ ラ ス チ ッ ク 容 器 ご と

° C 恒 温 槽 に

17 

5 分 間 静 置 し 解 凍 し た 解 凍 後 速 や か に

18 

に リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 （

を 加 え ト タ

19 

ノ レ

に 希 釈 し て 遠 心 分 離 （

分 し た

20 

心 後 に 上 清 を 吸 引 し 残 っ た 沈 殿 に

を 加

1  え

て 再 度 同 様 コ 。

、 分 自 在 と 上 1 ^青 コ 。 吸 ｜ 号 を 計

2 

回 1 T   ^{し 、} 沈 殿

を 力 日

て 細 胞 混 濁 液 を 作

3 

成 し ^ー

^、 れ を 検 体 と し た

4  OM 

中 コ 。

細 胞 数 と 生 細 胞 数 関 し て

土 検 体

5  10 μ L 

ト リ

。 ン フ ノ レ 染 色 液

を 力 日

6 

て 細 胞 数 担 リ ^疋

器

自 動 セ ノ レ カ ウ ン タ

7 

て 角 平 析 し

中 コ 。 全 細 胞 数 と 生 細 胞 数 を

8 

計 担 u し そ れ を 基 生 細 胞

（ 同 ） を 算 ^疋

し た

9 

ブ ロ 一 ^{サ イ ト メ ト リ}

^土

^〔

を ｛ 吏 用 し て 1 T   ^{し 、} 、 検 体

土

11  polypropylene round bottom tubes  (BO  Biosciences) 

入 れ た 後 検

12 

査 す る も コ 。 と し た 検 体

土 ブ ロ 一 ^{サ イ メ}

13 

リ 一 ^で

^土

を カ ウ ン ト す る ま で 検 体 を

抽 出 し た

15  CD45+ 

細 胞 数 コ 。 担 u ^疋

土 以 下 コ 。 と お り で あ る 。

16 

抗 体 試 薬 と し て 抗

体

17  CA,  USA

）と

を 染 色 ピ 一

18  (Beckman Coulter,  Brea,  CA,  USA

） を

主

19 

で 角 平 析 を 1 T   ^{イ コ た}

20  Graft Engineering (ISHAGE) 

コ 。 ガ イ ド ブ イ ン 従 ^{し 、}

20 

1  細 胞 を ゲ ト し 算 定 し た

＋ 細 胞 数 ＝CD45+

2 

細 胞 数 ／u

テ ス ト チ ュ ブ あ た り の ピ

3 

数 ＼ ピ ズ 数 希 釈 因 子 ＼ 検 体 量 （5

） で あ る

4  T

細 胞 B 細 胞 NK 細 胞 マ ク ロ ブ ァ

" ^D 

樹 状 細 胞 の 測 定 は 以 下 の 通 り で あ る 解 析 に

6 

使 用 し た 抗 体 は 抗

抗 体 n r   ^{p u}   抗

7  FITC  ) 

抗

抗 体 （ P E )

抗

抗 体 n r   ^{p u}   抗

以 上

8  USA  ) 

9 

抗

CD163

抗 体 （

以 上 以 上

抗

HLA DR抗 体 lineage

抗 体

11  Miltenyi Biotec,  Auburn,  CA,  USA

） で あ る 。 こ れ ら の 検 体 の 陰

12 

性 コ ン ト ロ ー ノ レ に は

PE 

抗 体 以

13 

上 ，

＋ 分 画 を

14  T

細 胞 ，

＋ ま た は

＋ の 分 画 を

細 胞 、

か

15 

つ

＋ の 分 画 を NK 細 胞

＋ の 分 画 を マ ク ロ

16 

ブ ア

_{＋ ， か っ}

_{か っ}

＋ の 分 画 を 樹 状

17 

細 胞 と し 検 体

に そ れ ぞ れ の 細 胞 に 対 応 し

18 

た 抗 体 試 薬 を 加 え 混 和 し 室 温 暗 所 で

分

19 

間 静 置 し た 後 に コ ン ト ロ ー ノ レ 抗 体 を 用 い て 陰

性 分 画 を セ ッ テ イ ン グ し た ま た 抗

1 

性 細 胞 を ゲ

ン ゲ し た ー

、

細 胞 集

2 

団

つ ち そ れ ぞ れ

表 面

カ 七 三 _占 め る

3 

割

、 〉 細 胞

） 同 を 担 u ^疋

し た 上 言 己

方 法 よ

4 

り 得 ら れ た

タ は

5  Ashland,  OR,  USA) 

を ｛ 吏 用 し て そ れ ぞ れ

細 胞 分 画

6 

角 平 析 を 1 T  

^た

7 

結 果

8  OM 

中

総 細 胞 数 と 生 細 胞 数

平 均 値 と 標 準

9 

偏 差

土 そ れ ぞ れ

だ

10 

た な お 各 検 体 で 細 胞 数

_{担 リ} ^疋

七 三 _{で き} な

11 

も

土 な ^{; I p}  

た 表

12  CCD45+ 

細 胞 は

生 細 胞 数

土

13  4.  7±0. 32Xl04/ml 

だ

た

14  CD45

ゲ 一

^{ン ゲ よ る 免 疫 細 胞}

^{解 析 で}

^土

15  CD4

＋ま た

土

土

弘 、 さ ら に

＋ま た

土

細 胞

16  ^半＋  l

土

弘 、

力 道

細 胞

土

弘 、

ク ロ _ブ

17  _ア エ／ コ。

指 標 と さ れ る

細 胞 は

18 

で あ

た 樹 状 細 胞

指 標 と さ れ る

、 色

19  Lin  <7コ

細 胞 は

で ー

、

細 胞 中 の

20  % 

^が

^{＋ だ}

^{た 。 図}

^図

^表

1 

2  I

考 察

3 

母 乳 に は 人 工 乳 と 比 較 し て 神 経 学 的 予 後 改

4 

" ^D 

6 

7 

善 や 感 染 防 御 末 熟 児 網 膜 症 や 壊 死 性 腸 炎 の リ ス ク 軽 減 な ど の 多 く の 利 点 が あ り

新 生

児 に と っ て 最 良 の 栄 養 源 で あ る 特 に 感 染 防 御 に 関 し て は 新 生 児 の 腸 管 に は 欠 損 ま た は

8 

ご く 稀 に し か 存 在 し な い

を 含 有 し て お り

9 

腸 管 免 疫 に 働 き か け る

） こ と が 報 告 さ れ て い

10 

る ま た 母 乳 中 に 含 ま れ る 免 疫 物 質 の う ち

11 

白 血 球 は 初 乳 中 に は

成 熟 乳 に は

12  1.0X105/ml

程 度 含 ま れ て お り 、 そ の う ち 好 中 球 が

13  30  40%

で 抗 原 提 示 細 胞 が

と さ れ こ れ ら

14 

の 細 胞 は 児 の 生 体 内 特 に 腸 管 で 利 用 さ れ 免

15 

疫 機 能 に 寄 与 し て い る

こ の よ う に 母 乳 が

16 

新 生 児 の 感 染 防 御 腸 管 免 疫 に 果 た す 役 割 ｜ は

17 

大 き く 細 胞 成 分 も そ の 端 を 担 っ て い る と

18 

考 え ら れ る

19 

そ の た め 米 国 小 児 科 学 会 （ 畑 町icanAcademy of Pediatrics 

20  AAP

） は 母 乳 育 児 推 進 を 提 言 し て い る 針 。 実 の 母

1 

親 の 母 乳 （ 伽

） で の 栄 養 が 最 も 望 ま し い

2 

3 

4 

" ^D 

6 

I i '   母 体 の 感 染 症 な ど に よ り 〔

が 使 用 で き な い こ と が あ り j 与 る

が 得

ら れ な い 状 況 で は 過 去 に は 他 の 母 親 の 母 乳

も ら い 乳 の 使 用 が 散 見 さ れ た が 感 染 性

そ こ で 次 の 問 題 か ら 現 在 は 般 的 で は な い

7  善 の 策 と し て 使 用 が 推 奨 さ れ て い る の が OM で

8 

あ る OM で 栄 養 さ れ た 児 は 人 工 乳 で 栄 養 さ れ

9  た 児 と 比 較 し て NEC の 擢 患 率 を 2 .5 倍 か ら 4 倍 低

10 

下 さ せ る

の こ と は 聞 が 推 奨 さ れ る 根 拠 と な っ

11 

て お り 理 由 と し て 母 乳 中 に 含 ま れ る 免 疫 物

12 

質 が OM 精 製 過 程 の 熱 処 理 後 も 残 存 す る こ と が

13 

考 え ら れ て い る

14 

去 の 報 告 を 示 す

OM 中 の 免 疫 物 質 に 関 す る 過

サ イ ト カ イ ン や 免 疫 グ ロ ブ

15 

リ ン な ど の 免 疫 活 性 物 質 に 関 す る 検 討 は 散 見

16 

さ れ

や

1 7  chemoattractant protein

な ど の 抗 原 提 示 細 胞 に 関 連 す る

18 

サ イ ト カ イ ン は 熱 処 理 に よ り

% 程 度 減 少 す

19 

20 

る

と 報 告 さ れ て い る し か し 免 疫 担 当 細 胞

に 関 し て は 白 血 球 数 や 生 細 胞 数 の 報 告 や 残

1  存 細 胞 の 特 徴 を 解 析 し た 報 告 は な か っ た

2 

れ は OM 精 製 過 程 で 行 わ れ る 熱 処 理 に よ る 細

3 

胞 へ の 影 響 が 考 慮 さ れ た 結 果 と 考 え ら れ る

4 

実 際

は 母 乳 を 感 染 経 路 と す る

5  H C V ,  HTLV  1 ,   CMV を 不 活 化 す る だ け で な く 細 菌 を 死 滅

6 

す る

ま た

後 の 母 乳 を ト リ

7 

パ ン ブ ノ レ 染 色 し た 結 果 生 細 胞 が み と め ら

8 

れ な か っ た

） と の 報 告 や

に よ

9 

り 免 疫 担 当 細 胞 は 完 全 に 活 性 を 失 う と の 報 告

10 

が あ る

し カ 過 し 過 去 に は 熱 処 理 を 行 っ て

11 

い な い 母 乳 を 用 い て

で 解 析 を 行 っ た

12 

検 討 が あ り 泌 乳 期 や 在 胎 週 数 に よ る 差 は あ

13 

る が

程 度 の

＋ 細 胞 が み と め ら

14 

れ た

） こ と が 報 告 さ れ て い る ま た

ら は

15  2015年 に Flowcytometry

を 用 い て パ ス ツ ノ レ 化 と 同 様

16 

の 低 温 殺 菌 処 理 を し た 牛 乳 中 の 細 胞 を 検 討 し

17 

た 結 果 熱 処 理 後 に も 生 理 活 性 を も っ 細 胞 が

18 

残 存 す る こ と を 報 告 し て い る

そ の た め OM

19 

中 に も 生 理 活 性 が あ る 免 疫 担 当 細 胞 が 残 存 す

20 

る 可 能 性 は 否 定 で き な い と 考 え 我 々 は 今 回

1 

を 用 い て

の 検 討 を し た そ の 結 果

2  OM

中 に は

程 度 の

＋ 細 胞 が 存 在 し

3 

程 度 が 生 細 胞 と し て 存 在 し て い る こ と が 示 さ

4 

" ^D 

6 

れ た 。 今 回 の 検 討 よ り 検 体 の 加 熱 滅 菌 に

Holder pasteurization

法 を 用 い て も 相 当 数 の 細 胞 が

残 存 す る こ と が 明 ら か に な っ た こ れ は 私 た

ち が 初 め て 明 ら か に し た

つ 目 の 知 見 で あ る

8 

さ ら に 残 存 細 胞 を

＋ で ゲ テ イ ン グ し

9 

て 行 っ た 解 析 で は T 細 胞 ， B 細 胞 NK 細 胞 を

10 

み と め ず マ ク ロ ブ ァ ジ と 樹 状 細 胞 の み 残

11 

存 し て い た こ れ は 私 た ち が 初 め て 明 ら か に

12 

し た

つ 目 の 知 見 で あ る 異 種 抗 原 の 原 因 と

13 

な り う る

細 胞 B 細 胞 は 消 失 し て い た に も

14 

か か わ ら ず 抗 原 提 示 細 胞 の み が 残 存 し た 理

15 

由 は 現 状 で は 不 明 で あ り 今 後

16 

前 後 で の よ り 詳 細 な 解 析 が 行 わ れ る 必 要 が あ

17 

る ま た 樹 状 細 胞 残 存 の 臨 床 的 意 義 と し て

18 

母 乳 中 の 抗 原 提 示 細 胞 は 微 生 物 を 貧 食 す る

19 

20 

こ と や 活 性 化 を 示 唆 す る 細 胞 表 面 マ カ

） を 発 現 し て お り 児 の 免 疫 系 に 働 き か け

1  T 

細 胞 B  細 胞 を 断 活 化 す る

と ^{古 三} 報 告 さ

2 

れ て 才 占 り 樹 状 細 胞 コ 。 残 存 ^{七 三} OM  よ る

発 症

3 

率 低 下 コ 。 因 な コ イ て ^{し 、} る 可 能 性 ^{七 三}

唆 さ れ

4 

た

5 

先

し た 牛 字 L を 用 ^{し 、} た 検 討 で l 土 熱 処 理

6 

後 も 生 理 活 性 を も

コ 細 胞 ^{三 七} 残 存 す る

と ^{三 七}

7  ^司て〈

さ れ て ^{才 占} り

OM  中 コ 。 生 細 胞 も 生 理 活 性

8 

^{七 三} あ る 可 能 性 l 土 否 ^疋

で き な ^{し 、} そ コ 。 た め 我 々

9 

l 土 OM  中

ま れ る 抗 原 提 示 細 胞 コ 。 生 理 活 性 を

10 

熱 処 理 前 コ 。 母 乳 と 比 較 検 討 す

く OM  中 コ 。 抗

11 

原 提 示 細 胞 内 コ 。 サ イ カ イ ン コ 。 分 析 を 予 ^疋

し

12 

て ^{し 、} る

13 

14 

15 

16 

17 

18 

19 

20 

1  I

文 献

2  1)  Sisk PM, Lovelady CA, et al. Early human milk feeding is  associated with a lower 

3  risk of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants  J Perinatol 2

〔

4  428 433 

5  2) Espinosa‑Martos I,  Montilla A, de Segura AG, et al.Bacteriological, biochemical, and 

6  immunological modifications in human colostrum after Holder pasteurisation. J 

7  Pecliatr Gastrcenterol Nutr 2013 , 56  560‑8 

8  3) Furman L, Taylor G, et al. The effect of maternal mill三onneonatal morbidity of very 

9  low‑birth‑weight infants. Arch Pediatr Adolesc Merl 2003  157  66‑71 

10  4) Hy lander MA, Strobino DM, et al. Association of human mill三feedingswith a 

11  reduction in retinopathy of prematurity among very low birth weight infants  J 

12  Perinatol 2001  21  35'1‑362 

13  5) Brandtzaeg P. Mucosal immunity. integration between mother and the breast‑feel 

14  infant. Vaccine 2003 , 21  3382‑3388 

15  6) Goldman,A.S. The immune system of human milk antimicrobial, anti‑inflammatory 

16  and immunomodulating properties. Pediatr. Infect. Dis. J 1993, 12  664‑671 

1 7  7) Field CJ. The immunological components of human milk and their effect on immune 

18  development in infants. J Nutr 2005, 135  1‑4. 

19  8) American Academy of Pediatrics  Policy statement and the use of human mill三

20  Pecliatrics 2005, 115  496‑5'. 

  l '

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2  banking Assa North Am, Fort Worth Tx 2012. 

3  10) Boyd CA, Quigley MA, Brocklehurst P. Donor breast mill三versusinfant formula for 

4  preterm infants. systematic review and meta‑analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal 

5  Ed. 2007, 92  169‑75. 

6  11) Davanzo R De Cun to A, et al. To feed or not to feed

ワ

7  practice guidance for human milk feeding and group B streptococcus in developed 

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ら

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1  mill

♂

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4 

" ^D 

表 1

DM(n=8) lml あたりの細胞数 細胞数測定器

総細胞数 ^{1 . 2  +Q.69 × 1 0 6}  

（生細胞数） ^{(2.7+0.25 × 1 0 5 )}   T r u c o u n t 5 去 ：

CD45 陽性細胞 ^{2 . 2  +Q.21 × 1 0 5}  

（生細胞数） ^{(4.7+0.32 × 1 0 4 )}  

表 2

CD45 陽性細胞の分画（% n = 8 )  

樹状細胞 ^62.8+26.1 

マクロファージ ^{6 3 . 1  +37.4} 

T 細胞 <  0.5% 

B 細胞 <  0.5% 

NK 細胞 <  0.5%