１ 調査研究の目的

システム技術開発調査研究 １８－Ｒ－２

遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化に関する調査研究 報 告 書

平成１９年３月

財団法人 機械システム振興協会 委託先 財団法人 バイオインダストリー協会

目 次

序 はじめに

１ 調査研究の目的

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1 ２ 調査研究の実施体制

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1 ３ 調査研究成果の内容

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4

第１章 我が国の臨床検査機械システム産業の欧米諸国との技術的差別化

及び市場優位性に関する調査・検討

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4 １．１ 発現解析法の実用化に向けた基盤技術の開発動向

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4 １．２ 欧米における最新の研究開発動向

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6

１．３ 欧米における遺伝子関連検査に係る政策論的取組み、及び標準物質

の開発を巡る動向

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11 １．４ 遺伝子発現検査の標準化

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17

１．４．１ 予備検討

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17 １．４．２ 戦略的に取り組むべき具体的な課題

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18 第２章 ヒト遺伝子発現解析データの相互比較の可能性に関する調査・検討

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26 ２．１ 遺伝子ＲＮＡの合成

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26

２．１．１ 完全長ｍＲＮＡの直接合成

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26

２．１．２ 発現ベクターの構築

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２．１．３ ｃＤＮＡの調製と発現ベクターへの導入

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31

２．１．５ ＲＮＡの試験管内合成

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41 ２．１．６ ＰＣＲによる目的遺伝子の増幅：Ｔベクターへの組み込み

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42 ２．１．７ ＰＣＲによる目的遺伝子の増幅：ｐＥＴ-９ａ改変ベクターへの組み込み

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45 ２．１．８ ＲＮＡの合成：メチレンブルー染色

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47 ２．１．９ 主要な実験手順の詳細

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51 ２．２ 発現解析実験

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56

２．２．１ 試料

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56 ２．２．２ 実験方法

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56 ２．２．３ 実験結果

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57 ２．２．４ 考察

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69 ２．３ 核酸参照物質（標準物質）の整備

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71

２．３．１ 概要

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72 ２．３．２ 背景、必要性及び目的

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72 ２．３．３ ＲＮＡ候補及び技術的課題

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73 ２．３．４ 参照ＲＮＡ物質の整備：保存性の検討、純度検定、ＳＩトレーサブル

な絶対量測定法開発の検討

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75 ２．３．５ ｍＲＮＡのｐｏｌｙ(Ａ)＋鎖長が標識効率に及ぼす影響の検討

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80 ２．３．６ 遺伝子発現の絶対的評価のための調査検討

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81 ２．３．７ ＲＮＡの半連続合成法の確立

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81 ２．３．８ ＲＮＡの大量合成および迅速精製法の確立

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82 ２．３．９ ＲＮＡの超大量合成

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83 ２．３．１０ 対象とすべき遺伝子

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83 ２．３．１１ 技術戦略マップ上の位置づけ及び研究体制（案）

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84 ４ 調査研究の成果（まとめ）

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85 ５ 調査研究の今後の課題及び展開

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91

５．１ 今後の課題：政策提言

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５．２ 今後の展開：核酸標準物質の整備

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５．３ 遺伝子発現解析検査の標準化研究

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92

〔資料編〕

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99 参考資料－Ａ 委員会議事録

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101 参考資料－Ｂ 遺伝子関連検査（Genetic Testing）に関係する欧米の機関、

プロジェクト等

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115

序

わが国経済の安定成長への推進にあたり、機械情報産業をめぐる経済的、社会的諸条件は急速 な変化を見せており、社会生活における環境、防災、都市、住宅、福祉、教育等、直面する問題の解 決を図るためには、技術開発力の強化に加えて、ますます多様化、高度化する社会的ニーズに適応 する機械情報システムの研究開発が必要であります。

このような社会情勢に対応し、各方面の要請に応えるため、財団法人機械システム振興協会では、

日本自転車振興会から機械工業振興資金の交付を受けて、機械システムの調査研究等に関する補 助事業、新機械システム普及促進補助事業を実施しております。

特に、システム開発に関する事業を効果的に推進するためには、国内外における先端技術、ある いはシステム統合化技術に関する調査研究を先行して実施する必要がありますので、当協会に総 合システム調査開発委員会（委員長 政策研究院 リサーチフェロー 藤正 巖氏）を設置し、同委員 会のご指導のもとにシステム技術開発に関する調査研究事業を実施しております。

この「遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化に関する調査研究報告書」は、上記事業の 一環として、当協会が財団法人バイオインダストリー協会に委託して実施した調査研究の成果であり ます。

今後、機械情報産業に関する諸施策が展開されていくうえで、本調査研究の成果が一つの礎石と して役立てば幸いであります。

平成１９年３月

財団法人機械システム振興協会

はじめに

２００３年（平成１５年）４月のヒトゲノム解読終了を契機にたん白質を中心とするポストゲノム研究 が進められ、更にＲＮＡ研究や糖鎖研究等次世代ポストゲノム研究と呼ぶべき研究も進められつつ ある。こうした中で、医療・健康分野においては、ヒトの遺伝子情報と疾患との関係に関する様々な 研究の進展によって、個別化医療、予防・健康サービス、医薬品開発、機能性食品開発、食品安全 性検査等の幅広い分野での新たな製品・サービスの創出が期待されている。

一方、遺伝子情報に係る検査・解析データの信頼性と互換性は、創薬等の学術研究用途だけで はなく、個別化医療の早期実現とも密接に関連するため、国際度量衡委員会（ＣＩＰＭ）/物質量諮問 委員会（ＣＣＱＭ）を構成する先進各国の国家研究機関の計量標準化研究の専門家が中心となり、

国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）、世界保健機構（ＷＨＯ）とも連携して臨床医学のトレーサビリティに関す る合同委員会（ＪＣＴＬＭ）が２００２年（平成１４年）に設立された。

また、国際標準化機構（ＩＳＯ）では、１９９５年（平成７年）に新しい専門委員会としてＴＣ２１２を立ち 上げ、欧州標準化委員会（ＣＥＮ）と連携してＩＳＯ１５１９３（標準物質に値を付けるための基準測定操 作法）、ＩＳＯ１５１９４（標準物質）、ＩＳＯ１５１９５（標準物質の特性を評価する基準測定試験所）、ＩＳＯ １５１８９（日常的に臨床検査を行う試験所の質と適合能力の規範）等の臨床化学検査に固有の要件 を付加した新たなＩＳＯ規格を順次制定し、臨床化学検査の国際標準化を進めている。

しかし、ヒトの遺伝子関連検査の標準化に関しては、技術革新が日々顕著で、かつ対象範囲があ まりにも広いため規格化には馴染まない等の理由で各国の取り組みが遅れていた。核酸標準物質 及び基準測定操作法の開発に関するＣＩＰＭ/ＣＣＱＭの活動も、現時点では基礎研究の段階を脱し ていないが、欧州では政策論的な取り組みとして、ＯＥＣＤベストプラクティス･ガイドラインの策定作 業及びＯＥＣＤ理事会勧告準備作業、上記ＣＩＰＭ/ＣＣＱＭ及びＪＣＴＬＭ等における臨床応用を想定 した国際的な核酸計量標準研究が加速されつつある。

産業技術の開発・実用化に関して戦略的に欧州と一線を画している米国では、横断的な合意事項 であるＩＳＯ規格等よりは、内部核酸標準物質と特定企業のＤＮＡマイクロアレイを組み合わせた測定 系を「実質的な国際標準」として国際市場で優先確立することを目的とする米国企業主導の取組とし て、「臨床検査室における遺伝学的検査標準に関する国際会議（ＩＭＣＬＧＳ）及び外部ＲＮＡ標準コン ソーシアム（ＥＲＣＣ）」を２００３年（平成１５年）春より重点的に推進しており、遺伝子情報解析ツール を開発に取り組んでいる国内企業の競争力に直接的に影響しかねない状況が顕在化しつつある。

更に２００５年（平成１７年）１０月には我が国の行政及び産業界への影響力が無視できない米国Ｆ ＤＡが、ＤＮＡマイクロアレイを特定の疾患検査用診断試薬（ＤＮＡマイクロアレイ診断チップ）として実 用化することを目的とするＭＡＱＣ（ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）プロジェクトの立ち上げと２００７ 年（平成１９年）末のＦＤＡガイドライン制定をＷｅｂｓｉｔｅにて告知した。

ＦＤＡ/ＭＡＱＣプロジェクトは、２００５年（平成１７年）２月から１０月にかけて２種類のＲＮＡと主要７ 社のＤＮＡマイクロアレイ、計１３２９枚を用いた試験研究を実施し、ラットを用いた前臨床試験のデー タベース等による検討等も加えて、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏtechnoｌｏｇｙ 誌の２００６年（平成１８年）９月８日号に おいて、「異なるＤＮＡマイクロアレイ間の遺伝子発現解析結果について“統計的には”相互比較でき る」と結論して、１年半にわたる PｈａｓｅⅠを終了した。２００７年（平成１９年）２月末現在、引き続き、

実用的なバイオマーカーの探索を目指す PｈａｓｅⅡの準備段階にある。

尚、当該 ＭＡＱＣ PｈａｓｅⅡは、ＦＤＡの担当者が主導する Ｃｌｉniｃａｌ （臨床） ＷＧ、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂｉｏｓｔａｔｉｃｓ （生物統計学） ＷＧ、Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ （トキシコゲノミックス： ラット等を用いた前臨 床毒性試験結果のヒト臨床安全性試験への外挿について遺伝子関連検査の知見に基づいて検証 する） ＷＧ、及び大学･企業関係者が主導するＭＡＱＣ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ （混合試料の解析） ＷＧの、計４ 作業部会で構成される。

上述の通り、遺伝学的検査を取り巻く環境は、米国主導で研究開発の段階から欧米及び日本市 場における実用化・関連装置産業の新規立ち上げへ向けて動きを活性化しつつあるが、国内では、

異なるプラットフォーム間のデータの相互比較を可能にするためのいわゆる標準物質開発の可能性 を示唆する先駆的な試みとして、完全長ＲＮＡを利用する発案に基づく予備試験が実施され、ＤＮＡマ イクロアレイを利用する実験・検査系における核酸（ｍＲＮＡ）発現量の絶対値測定の可能性を将来 的に示唆する下記知見が得られている（独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構平成１ ７年度成果報告書：「遺伝子情報解析データの信頼性・互換性向上のための課題・方策に関する調 査」０５００１８６６-０、財団法人バイオインダストリー協会受託）。

・ 断片化後に蛍光標識したヒト遺伝子ｍＲＮＡの濃度とハイブリダイゼーション（注、蛍光強度として 検出）の相関性に関して、純粋な合成遺伝子ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）の系では、ほぼ良好な相 関性と再現性が示唆された。

・ ただし、遺伝子の種類によってハイブリダイゼーション効率に差が認められた。

ＤＮＡマイクロアレイを利用する遺伝子情報解析は、新たな社会的ニーズとして注目されている個 別化医療等の幅広い分野に適応する新たな機械情報システムの創出と普及を根底から支える基盤 技術である。しかし、ヒトから採取した血液検体の処理方法、測定機器メーカーごとに異なる測定プロ トコル、試薬類等に解析結果が大きく左右されるため、遺伝子情報解析ツール･試薬等の生産者（メ ーカー）、使用者（検査会社、医師）及び受益者（一般の患者）の全てから遺伝子情報解析結果の信 頼性及び互換性の向上が強く求められている。

米国は、自国製ＤＮＡマイクロアレイを利用する遺伝子情報解析・検査技術を事実上の標準として 確立して他国の関連技術開発を阻止するための手段とすべく、内部核酸標準物質の普及を急いで いるが、一度でも内部標準物質の利用が臨床検査の現場に普及してしまえば、医療現場の常として

が国の臨床検査機械システム産業は実質的に米国の支配下に置かれる可能性が十分に想起され る。

しかし、遺伝子情報測定データの比較可能な範囲（遺伝子情報解析・検査技術及び測定機器シス テム）を限定して自国産業の優位性確保を画策する米国企業群に対して、当該デ-タの比較互換性 が遍く保証される標準物質が我が国独自の発案により確立されれば、米国企業群に対する我が国 企業の立場が強化される。

そこで、本調査研究では、自国産業の競争優位を目指す米国企業群の上記取り組みに対峙して、

我が国独自の発案による標準物質の開発・普及を図るべく、我が国の臨床検査機械システム産業 の欧米諸国との技術的差別化及び市場優位性、及びヒト遺伝子発現解析データの相互比較の可能 性に関して調査・検討し、これらの調査・検討結果、及び専門家で構成される委員会における討議・

審議結果等を踏まえて、遺伝子発現解析検査に関連する検査機械システム市場の世界的な創生・

拡大及び健全な発展を図るために我が国が戦略的に取り組むべき課題を明らかにし（第１章）、本調 査研究の目的である核酸標準物質（参照物質）の具体的な開発方法を取りまとめた（第２章）。

平成１９年３月

財団法人バイオインダストリー協会

１ 調査研究の目的

本調査研究は、近い将来における実用化を見据えて最近数年の間に急遽、欧米で核酸（ＲＮＡ）標 準物質開発への具体的な動きが始まりつつある現状に鑑み、核酸標準物質の開発方法について我 が国独自の視点と発想で調査・検討し、我が国主導による国内外関連市場の拡大を図ることを目的 として実施した。

２ 調査研究の実施体制 ２．１ 実施体制

本調査研究は、財団法人機械システム振興協会の委託を受け、財団法人バイオインダストリー協 会内に「遺伝子情報解析データの信頼性・互換性向上調査委員会」を設置し、下記の体制で実施し た。

図２-１ 実施体制

２．２ 業務分担

遺伝子発現解析実験（３ 調査研究成果の内容 第２章 ２．２）に係る下記３項目について、九州 大学に業務を再委託した。

１） 合成済みのヒト遺伝子ＲＮＡを用いた外部核酸標準物質の調整 ２） ＤＮＡマイクロアレイと核酸標準物質のハイブリダイゼーション操作

財団法人バイオインダストリー協会

遺伝子情報解析データの 信頼性・互換性向上調査委員会

九州大学

（再委託）

財団法人機械システム振興協会 総合システム調査開発委員会

（委 託）

２．３ 財団法人機械システム振興協会総合システム調査開発委員会

表２-１ 総合システム調査開発委員会 委員名簿

委員長 政策研究院 リサーチフェロー 藤正 巖

委 員 埼玉大学 地域共同研究センター 教授 太田公廣

委 員 独立行政法人産業技術総合研究所 エレクトロニクス研究部門

副研究部門長 金丸正剛

委 員 独立行政法人産業技術総合研究所 産学官連携部門

コーディネータ 志村洋文

委 員 東北大学 未来科学技術共同研究センター センター長 中島一郎 委 員 東京工業大学大学院 総合理工学研究科 教授 廣田 薫

委 員 東京大学大学院 工学系研究科 助教授 藤岡健彦

委 員 東京大学大学院 新領域創成科学研究科 教授 大和裕幸

２．４ 遺伝子情報解析データの信頼性・互換性向上調査委員会

表２-２ 遺伝子情報解析データの信頼性・互換性向上調査委員会 委員名簿

委員長 九州大学大学院 教授 久原 哲

委 員 三重大学大学院 教授 登 勉

委 員 浜松医科大学 教授 前川真人

委 員 徳島大学 ゲノム機能研究センター 教授 篠原康雄

委 員 東京理科大学 教授 村上康文

委 員 長浜バイオ大学 教授 大島 淳

委 員 九州大学大学院 助教授 田代康介

委 員 独立行政法人産業技術総合研究所 生物機能工学研究部門

主任研究員 川原崎 守

委 員 独立行政法人産業技術総合研究所 生命情報科学センター

研究員 藤渕 航

委 員 東レ株式会社 CR 企画室長 田中利明

委 員 タカラバイオ株式会社 ドラゴンジェノミクスセンター 副センター長 大門尚志

委 員 株式会社東芝 研究開発センター 研究主幹 石森義雄

委 員 日本ガイシ株式会社 ライフサイエンス担当部長 川瀬三雄

委 員 株式会社エスアールエル 理事 引地一昌

委 員 株式会社エスアールエル 技術開発課 担当課長 石川 博 委 員 株式会社ビー・エム・エル 臨床ゲノム開発部 次長 山口敏和

委 員 株式会社三菱化学ビーシーエル 遺伝子検査部長 山森俊治

関係者 東レ株式会社 先端融合研究所 副所長 米原 徹

関係者 東レ株式会社 先端融合研究所 主任研究員 秋山英雄

関係者 経済産業省 製造産業局 生物化学産業課 課長 徳増有治

関係者 経済産業省 産業技術環境局 知的基盤課 課長 吉田雅彦

関係者 経済産業省 製造産業局 生物化学産業課 課長補佐 荒田芙美子 関係者 経済産業省 製造産業局 生物化学産業課 標準化係長 行本治代

関係者 経済産業省 産業技術環境局 知的基盤課 高橋昌行

関係者 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構

バイオテクノロジー・医療技術開発部 主査 古川善規

関係者 経済産業省 関東経済産業局 産業部産業振興課

バイオ産業チーム チーム長 鈴木隆文

事務局 財団法人バイオインダストリー協会 技術企画部長 堀 友繁

３ 調査研究成果の内容

第１章 我が国の臨床検査機械システム産業の欧米諸国との技術的差別化及び市場優位 性に関する調査・検討

ＤＮＡマイクロアレイを用いる発現解析及び外部核酸標準物質の応用に係る海外技術動向を踏ま えて、臨床現場から早期実用化への要請が高まりつつある遺伝学的検査に関して、我が国の臨床 検査機械システム産業が欧米諸国との技術的差別化と市場優位性を将来的に維持する方策につい て調査・検討した。

海外動向調査の調査対象は、欧州における遺伝子情報解析データの信頼性・互換性向上に関わ る主要な企業、団体、国際機関（ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔ、ＪＣＴＬＭ等）を主導する研究開発もしくは施策担当 者とし、調査は、面談、関連会議等への出席により行った。また、調査研究委託実施期間の全期間 に亘って、関連するウェブサイトを適宜調査した。

ついで、後述のヒト遺伝子発現解析データの相互比較の可能性に関する調査・検討結果（第２章）

も踏まえて、国内有識者で構成される専門家委員会（委員長：九州大学大学院 久原 哲教授）（表２

－１）を合計３回開催し、遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化に向けて、我が国の臨床 検査機械システム産業が欧米諸国との技術的差別化及び市場優位性のために戦略的に取り組む べき優先課題について検討し、具体的な調査・研究計画（案）を取りまとめた（第１章 １．４）。

１．１ 発現解析法の実用化に向けた基盤技術の開発動向

“バイオテクノロジー”という言葉が初めて使われたのは約９０年前の１９１７年（大正５年）頃といわ れている。その後三分の１世紀を経て、１９５３年（昭和２８年）にはＤＮＡの構造が明らかになり、すぐ にも生命科学の分野で革命的な成果が得られるかの期待が一気に高まったが、その後の動きは鈍 く、更に２分の１世紀が経過した２００３年（平成１５年）の春、ようやくヒトゲノムの全塩基配列が明ら かになった。

一方、ゲノムの情報を利用する遺伝子工学の領域では、最も有用な実用的な手法のひとつとして、

異種のＤＮＡ同士や、ＤＮＡとＲＮＡをアニーリングする操作（分子雑種形成：ハイブリダイゼーション）

が、創薬等の研究開発分野で利用されており、ハイブリダイゼーションと新しい基盤技術（単一細胞 分離技術、レーザー干渉技術、ＢｅａｄＡｒｒａｙテクノロジー等）との組み合わせにより、遺伝学的検査

1917年1917年:: バイオテクノロジーという言葉がはじめて登場（米国・シカゴ）バイオテクノロジーという言葉がはじめて登場（米国・シカゴ）

1953年1953年:: ＤＮＡの構造解明ＤＮＡの構造解明 （ワトソン、クリック両氏）（ワトソン、クリック両氏）

1979年1979年:: バイオテクノロジーがはじめてベンチャー投資家の対象となる。バイオテクノロジーがはじめてベンチャー投資家の対象となる。

1996年 1996 年 : : ＤＮＡマイクロアレイによるはじめての遺伝子発現解析実験

ＤＮＡマイクロアレイによるはじめての遺伝子発現解析実験

2003年 2003 年 : : ヒトゲノムの全塩基配列解明

ヒトゲノムの全塩基配列解明

1953 1953

イノベーションの浸透 イノベーションの浸透

Time Time 2003 2003

遺伝子関連検査の臨床応用 遺伝子関連検査の臨床応用

・産業応用に向けて！

・産業応用に向けて！

図３-１-１ 発現解析法の実用化を巡る経緯及び現状

１）～４）に国内及び海外専門家に対する個別面談の結果を示す。

１） 単一細胞分離技術

安田賢二教授 （東京医科歯科大学、生体材料研究所）は、静的なゲノム（遺伝子配列情報）に対 峙する動的なものとしてエピジェネティクスの特長についての考察をした後、マイクロフルィディックス

（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、微小領域の流体力学）を利用して、特定の細胞を微小流路流動系中において１個 単位で実時間分離できることを実証した。

この技術は、基礎研究の段階ではあるが、細胞１個単位での遺伝子発現解析が実現可能である ことを示唆する画期的なものである。

２） レーザー干渉技術

Ｐｒｏｆ．Ｗｉｌｌａｍ Ｇ．Ｔｏｎｇ （サンジェゴ州立大学 生命物理、レーザー分光専攻） は、独自のレー ザー干渉技術を駆使して従来の蛍光分析の壁を超える、超高感度遺伝子発現解析の実現可能性を 示唆した。

３） ＢｅａｄＡｒｒａｙ テクノロジー

Ｄｒ．Ｊａｍｅｓ Ｔｈｅｒｒｉｅｎ （イルミナ株式会社、Ｄｉｒｅｃｔｏｒ/Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｌｉａｉｓｏｎ, 日本担当）は、イル ミナ社製のＤＮＡマイクロアレイを利用すれば数理統計学的に信頼性の高い値を安価で実現できるこ とを曖昧さのない明快な技術説明によって明らかにした。

４） 定量ＰＣＲ

Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｓｔｏｒｔｓ （プロメガ社、Ｄｉｒｅｃｔｏｒ/Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、プロメガ社が増幅反 応の進行に伴い蛍光強度が増加する従来法とは逆の発想（増幅反応の進行に伴い減光する）を利 用して、少ないプライマーで、多数の試料を同時に、かつ定量分析できる ｑＰＣＲ 及び ｑＲＴ-ＰＣＲ を開発・実用化したことを明らかにした。

１．２ 欧米における最新の研究開発動向

ヒト遺伝子発現解析データの信頼性・互換性向上、核酸標準物質の開発及び標準化に係る海外 動向調査（欧州、第１回目）として、オランダ・アムステルダム市内で開催された Select Biosciences 主催の第２回Advances in Microarray Technology Conferenceに出席し、遺伝学的情報の網羅的 な測定を特長とするマイクロアレイ利用技術に係る応用基礎及び実用化研究の最前線に於ける現 状及び動向について、我が国の臨床検査機械システム産業が欧米諸国との技術的差別化及び市 場優位性のために戦略的に取り組むべき優先課題探索の視点で、全ての講演（２８件）、ポスター発 表（５６件）、及び関連企業展示ブース（２８社）を精査し、重要案件については担当者との直接面談 によって、詳細かつ正確な情報を直接入手した。尚、会議への出席者約３００名中、日本からの出席 者は１名のみであった。

発表講演は、Microfluidics、Bioinfirmatics、Cell Microarrays、Protein Microarrays: Capture、

Protein Microarrays: Interactions、DNA Microarrays: Polymorphisms、DNA Microarrays:

Hybridization、DNA Microarrays: Gene Expression の大分類に沿って研究・実用化最前線に特

いわゆる DNAマイクロアレイを用いる遺伝学的情報の網羅的な測定法の利用現状は、概ね予想 の範囲内（より詳細な領域に踏み込んだ改良研究の積み重ね：従ってブレイクスルーは起きにく い。）であったのに対し、約１年半前（２００５年（平成１７年）秋）には萌芽的な基礎研究の段階にあり、

実用化は当面想定外の感がしたプロテイン・マイクロアレイが一気に実用化段階に達し、一部製品 化に至っていた。

ＤＮＡマイクロアレイを用いる発現解析等の定量測定についても２００５年（平成１７年）秋には、ごく 一部の関係者が、言外にその必要性と有用性を控えめに指摘するに止まっていたが、今回は臨床 応用をはっきりと掲げて、絶対計量を目指す戦略的取り組みが、ＤＮＡマイクロアレイだけではなく、

プロテイン・マイクロアレイ、更には細胞・マイクロアレイに至るマイクロアレイ・テクノロジーの全領域 で強調されていた。

日本国内では、当該定量測定の必要性の議論はごく少数派に止まっているが、国際的には昨年、

２００６年（平成１８年）の３月中旬、米国臨床化学会（AACC）の San Diego 部会で DNA Probe Technology – Two Decades of Innovationと題された学術集会が開催され、発現解析等の定量測 定は既に規定の流れと見極め、５年以内に世界のトップ１０の製薬企業が全て再編されるとの指摘 が展望講演で当然のごとく述べられた経緯にある。（非公開のため関係者以外はあまり認識しては いないが）国際度量衡委員会の物質量諮問委員会でもＤＮＡの絶対計量に取り組んでいる経緯があ り、この指摘が必ずしも荒唐無稽ではないことを示唆している。特に、今回は、欧州の産業界レベル で発現解析等の定量測定に言及した点で特筆に価する。

バイオ分野、特に遺伝子情報を取り扱うバイオテクノロジー分野に関する関心が、我が国では一 時期の勢いがなくなり、バイオテクノロジーの将来性に陰りが見え始めたかの感があるが、国際的に は決してそのような兆候はなく、実用化に向けた取り組みが質的に異なる変化を伴いながら着実に かつ指数関数的に加速している状況が実例に基づき垣間見られた。

例えば、平成１０年（１９９８年）にDr. Stephen Quake が考案し、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌２００２年１０月１８日 号の表紙を飾ったＩＦＣ (Integraded Fluidic Circuits) 技術を携えて、平成１１年（１９９９年）に設立さ れた米国のベンチャー企業であるFluidigm 社は、最近３年間に限ると前年比１０倍前後で市場占有 率が伸び続けており、かつて唱えられたコンピュータ演算素子の事例（いわゆる Moore’s Law）（備 考参照）を遥かに上回っている。（図３-１-２）

備考 コンピュータ演算素子の集積度 （ビット／平方インチ） ＝ ２ ＾ （ t – １９６２ ） ここで、 ｔ は、年を表す。

尚、同社は、従来のＤＮＡマイクロアレイを用いずに、マイクロフルィディクスと従来のＴａｑＭａｎ法に よる定量ＰＣＲを組み合わせて、１枚のチップで２０００検体以上の定量ＰＣＲを同時に実現し、既に市 場導入を完了している。ただし、日本国内には販売拠点を持たない。今回、定量測定原理の簡易さ に着目して、Fluidigm社のExecutive Vice President (Dr. Michael Lucero) （図３-１-３） に面談し て詳細情報を収集し、網羅的定量ＰＣＲ用チップ（図３-１-４） も入手した。

図３-１-２ 米国Fluidigm社（http://www.fluidigm.com/index.html）の業績等

Michael Lucero, Executive VP Business Development, Fluidigm Corp.

図３-１-３ 米国Fluidigm社のExecutive Vice President、Dr. Michael Lucero

図３-１-４ 米国Fluidigm社の網羅的定量PCR用チップ (http://www.selectconferences.com/AMT2006/presentations/lucero.pdf)

Mike Lucero has been influential in the development of analytical tools for life science over the past decade and a half. In the 1990s, while at Applied Biosystems, he was promoted to Vice President of PCR Marketing and R&D.

Under his watch, the company introduced the world’s first instrumentation and chemistry for real-time quantitative PCR. Currently, as Executive Vice President of Business Development, he plays a leading role in defining the strategy for commercializing the company’s core technology, integrated fluidic circuits, for life science and allied fields. Mr. Lucero received a BA in biochemistry in 1985 and an MBA in 1989 from the University of California, Berkeley.

以下、特記事項について概要を列記する。

核酸標準物質の開発に関しては、Target Hybridization Rate を規定することが必須要件になると 想起されるが、本課題に関しては、ベルギー・ブリュッセル大学の研究グループが理論的な研究に取 り組んでいる （図３-１-５）。現時点では、基礎的な検討が始まったばかりであり、今後の進展が注目 される。

図３-１-５ Target Hybridization Rateに関する研究動向

(http://www.selectconferences.com/AMT2006/presentations/posters/Session%20A/120.pdf)

本調査研究の第１回及び第２回専門家委員会でも、そもそもハイブリダイゼーションとは何か、と いう基本的な問いかけがなされており、プローブの最適化設計への挑戦とあわせて、化学反応速度 と拡散速度の比が律速となるハイブリダイゼーション効率に関する取り組みの重要性を認識した。

従来、網羅的な測定に定量測定は馴染まないとされていたが、臨床応用を戦略の要に据え定量 測定自体をビジネスモデルとして、売るべき製品の開発を待たずに起業したベンチャー企業の存在 も象徴的であった。

プラットフォームに関しても、従来のアフィメトリックス方式とスタンフォード方式の競争の狭間から、

質的な変化を遂げて登場した Bead Array Technology （図３-１-６） を利用したイルミナ社のマイク ロアレイが明らかに次代を担うと確信された。

Core BearArray

^®

Technology

図３-１-６ ＤＮＡマイクロアレイに臨床応用・産業応用に向けた新技術の事例：

Ｉｌｌｕｍｉｎａ社 Core BeadArray

^TM

Technology

（http://www.illuminakk.co.jp/tech/index.shtml）

臨床的な遺伝学的検査の領域でも早晩、多種類多数個の細胞が混在する検体から、ごく微量もし くは特定の１個の細胞へと様変わりし、標準物質を利用する定量計測、平板から球面利用へ変わり つつあるプラットフォームとの組み合わせによる、新たな取り組みが主流となろう。

１．３ 欧米における遺伝子関連検査に係る政策論的取組み、及び標準物質の開発を巡 る動向

ヒト遺伝子発現解析データの信頼性・互換性向上、核酸標準物質の開発及び標準化に係る海外 動向調査（欧州、第２回目）として、ベルギー・ルーブン市内、Ｇｒｏｏｔ Ｂｅｇｉｊｎｈｏｆ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｃｌｕｂ 会 議場で開催されたＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt プロジェクトの第３回総会及び成果報告会（非公開）に出席し、ＥＵ 及び米国が連携して取り組んでいる遺伝子関連検査に係る政策論的取組み及び標準物質の開発を 巡る動向等について関係者との直接面談によって現状を調査した。

１） 遺伝子関連検査に係るＯＥＣＤベストプラクティス・ガイドラインの策定

遺伝子関連検査に係る基盤技術確立の動きに呼応して遺伝学的検査に係る政策論的取り組み

（いわゆるバイオポリティックス）も各国、地域で始まりつつあり、先進国の世界的政府間組織である 経済開発機構（ＯＥＣＤ）ではヒト遺伝子関連検査に関する大部のベストプラクティス・ガイドライン（仮 翻訳：分子遺伝学的検査の質保証、Draft Guidelines for Quality Assurance in Molecular Genetic Testing）の最終原案が、ＯＥＣＤに於ける６年間の取組み成果として、昨年(平成１８年)７月から９月 にかけての全世界を対象にした公開意見聴取を経て、本年（平成１９年）春から夏の予定でＯＥＣＤ 理事会勧告として発行されることがほぼ確実となった。

本ガイドラインの詳細については、外交文書に順ずる秘匿解除の手続きが済むまで非公開となっ ているが、ヒトから採取した臨床検体について国境を越えて移動することを許容するものであり、我 が国も例外ではないが、遺伝子関連検査に対する国内体制が未構築の各国にとってはその影響は 無視できないものがあると容易に想像される。

２） ＯＥＣＤベストプラクティス・ガイドラインとＩＳＯ国際規格の整合化への動き

先進国政府の閣僚級会議による緩やかな強制力を持つ、いわゆる紳士協定的な一面を有するＯ ＥＣＤの理事会勧告発行の動きに対峙して、途上国を含む１４０カ国が加盟する民間の機関である国 際標準化機構（ＩＳＯ）でも、現時点（平成１９年２月現在）では若干の不透明さが否めないが、遺伝子 関連検査に関連する規格作りに向けての具体的動きが始まるのが確実視されている。規格化の可 否が討議される場は、ＩＳＯ/ＴＣ２１２の総会であり、本年(平成１９年)５月下旬に開催予定の北京総 会がそのきっかけとなる可能性が高い。

ＩＳＯの場における審議を持ちかけたのは他ならぬ我が国であり、一昨年（平成１７年）２月に正式 提案（ＩＳＯ/ＴＣ２１２ Ｎ１４９）した経緯にある。ＩＳＯの各専門委員会（ＴＣ）に於ける議事録等も非公 開であるため詳細については省略するが、ＩＳＯで規格化されると、ＩＳＯ規格自体は任意規格である が、欧州ではそのまま強制規格として運用されるため産業界に及ぼす影響は無視できない。我が国 でも１９９５年（平成７年）の閣議決定により、ＩＳＯ規格との整合性を表明しており、直接的ではないに しても、実質的な影響は避けられない。

３） 欧州における最新の政策論的取組み

上述バイオポリティックス発祥の地、欧州すなわちＥＵでは、３年前にＥＵプロジェクトとして６つの ユニットで構成されるＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔプロジェクト（備考参照）が立ち上がり、ＥＵのプロジェクトであり

有力者のひとりである Dr. Joe Boone、米国・臨床遺伝学会（ＡＣＭＧ）の関連委員会を統括する Dr.

Sue Ｒｉｃｈａｒｄ等がその運営に深くかつ積極的に関わっており、上記ＯＥＣＤベストプラクティス・ガイド ラインの正式発行を待って、その影響力を強めるもの想起される。

備考 ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔの活動に係る主要な関係者、計６名について所属等を以下に列記する。

・ Joe Boone, National Center for Marketing, CDC, USA

米国で一貫して Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ の標準化に取り組んでいる第一人者。ＯＥＣＤガイドラインの 策定作業を米国代表団の代表者として取り仕切り、連携するＩＳＯの国際規格１５１８９を制定したＩＳ Ｏ/ＴＣ２１２でも実質的に会議を主導している Ｋｅｙ ｐｅｒｓｏｎである。（写真３-１-１）

・ Elletra Ronchi, OECD, France

ＯＥＣＤ/ＷＰＢで６年来にわたって、事務局としてＯＥＣＤガイドライン策定作業を一手に取り仕切り、

理事会勧告発行を事実上主導した当事者。（写真３-１-１）

写真３-１-１ Joe Boone（前列右）、Elletra Ronchi（前列左）

･ David Barton, National University of Ireland, Dublin, Ireland.

ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt/ＣＲＥＧＥＮ（認証標準物質開発プロジェクト）の責任者。本年（平成１９年）、５月に アイルランドで開催される、遺伝子関連検査用標準物質にかかる国際会議の主催者。

・ Els Dequeker, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium

ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt/Ｕｎｉｔ１（遺伝子関連検査の質保証）責任者。ＯＥＣＤガイドラインに準拠するＩＳＯ国 際規格策定に係るＥＵの実質的な代表者。

・ Egbert Bakker, Leiden University Medical Center, the Netherlands

ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt/Ｕｎｉｔ５（標準物質を利用する測定技術及び装置関係）の責任者。

・ Jean-Jacques Cassiman, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium

ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt の最高責任者。Playing Director の役割を自ら演じて、ＥＵ全体の利益にために強 力な指導力を発揮している。（写真３-１-２）

写真３-１-２ Jean-Jacques Cassiman （ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt最高責任者）

写真３-１-３ ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｓｅｍｂｌｙ 出席者（全員）

（http://www.eurogentest.org/web/db/event/65/index.xhtml）

４） 米国における最新の政策論的取組み

米国では、ＣＤＣが中心となってＣＥＴＴ プロジェクト（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ、 Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、 ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｒａｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）を立ち上げて米国内の研究・技術開発、

政策論的な動向等を共有化し、臨床応用の早期実現に取り組んでいるが、ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt プロジェ クトは、ＣＥＴＴに先んじて欧州で立ち上がった同様の取組みであり、いずれも民間企業ではなく、国 家機関主導による政策論的取組みに分類されるのが特徴である。

５） 標準物質開発を巡る現状

遺伝子関連検査の臨床応用を阻害要因は単一ではなく、政策論的、倫理的、社会的要因もある が、技術的には定量解析が最大の課題として挙げられる。定量解析には、物差しとなる核酸標準物 質が必要であり、各国の国民が望む医療（患者主体の医療）に不可欠な、画一的な定量診断の早期 実現に向けて、ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔにおいても当然のこととして核酸標準物質の開発・整備が、プロジェク トの最重要目標のひとつとして位置づけられている。ただし、国際的な取組みとの整合性を重視する 各ユニットリーダーの意向が、あくまでも臨床現場に於ける応用を指向している末端の医療関係者ま

遺伝子関連検査に係る標準物質の開発プロジェクトに関していえば、欧米で過去にもいくつか小さ な取組みがあったようである。しかし、標準物質の整備を患者の細胞に依存し、予定通り細胞が集ま らなかったことにより、活動基金が枯渇し、成果を得ることなく立ち消えとなった事例も多かったと推 察された。上述のＣＥＴＴではまだ顕在化していないが、ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt の財政支援によるＥＵの臨床 遺伝子検査用標準物質整備プロジェクトであるＣＲＥＧＥＮ（責任者：Ｄａｖｉｄ Ｂａｒｔｏｎ）も第１期３年が 過ぎたところで、第２期 ｐｏｓｔ ＣＲＥＧＥN の立ち上げが難航している模様である。

尚、ＣＥＴＴ及びＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓt/ＣＲＥＧＥＮの“標準物質”は、疫学的ないし単純な統計的検証に準 拠する“暫定的な管理標準物質”であり、ＳＩトレーサブルな本来の標準物質には該当しない。

一方、各国を代表する国家軽量・標準化機関がＳＩトレーサブルな本来の標準物質の開発に取り 組んでいる国際度量衡局（ＢＩＰＭ）/物質量諮問委員会（ＣＣＱＭ）では、ＤＮＡ分子１個の絶対定量に 挑戦しており（図３-１-７）、進捗は早くはないものの一定の成果が得られつつある。

P-54 DNAの一次定量

分子量の測定

• ＩＣＰ-ＯＥＳ : Inductionely Coupled Plasma – Optical Emmission Spectroscopy

• ＬＣ-ＩＤＭＳ : Liquid Chromatography

– Isotope-Dilution Mass Spectrometry

図３-１-７ ＢＩＰＭ/ＣＣＱＭにおける方法論としての標準化への取組み

我が国としては、遺伝子関連検査に係る標準物質の整備に関しては進捗度を早める前提で、ＳＩト レーサブルな本来の標準物質の開発を目指すＢＩＰＭ/ＣＣＱＭの取り組み方に準拠すべきと結論す る。

１．４ 遺伝子発現検査の標準化

１．４．１ 予備検討

第１回目（平成１８年７月１８日、２０名出席）及び第２回目（平成１８年１０月２５日、２３名出席）専 門家委員会を開催し、発現解析法の実用化に向けた基盤技術の開発動向（第１章 １．１参照）等を 踏まえて、遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化に係る現状、及び我が国の臨床検査機 械システム産業が欧米諸国との技術的差別化及び市場優位性のために戦略的に取り組むべき優 先課題等について検討した。

１） 遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化に係る現状

・ 市場占有率の小さな国産のＤＮＡマイクロアレイを使用している場合は、特に互換性が重要で ある。

・ ＤＮＡマイクロアレイの比較検討は企業独自では難しいため、標準物質の整備が望まれる。

・ ＮＩＳＴのＤＮＡマイクロアレイ関係者がＢＩＰＭ/ＣＣＱＭ/ＢＡＷＧに参加し始めているのでＣＣＱ Ｍでもそろそろ（遺伝学的検査の信頼性・互換性向上及び標準化が）議論の対象になると思 われる。

・ ＣＣＱＭではＤＮＡの抽出、ＤＮＡ分子の定量計測の検討がされているが、後者は予定通り上 手くは進捗していないようである。

・ ＣＣＱＭでは測定機器ごとのプロトコルは問題にしない。操作方法のプロトコル自体を同じにし て、いずれの器械もしくは誰がやっても誤差が少なくなる全体的なプロトコル（標準物質の開発 及び基準測定操作法の確立）を対象としている。

２） 戦略的に取り組むべき優先課題

標準物質の開発・整備 ｍＲＮＡ標準物質 ｍＲＮＡの純度測定方法

検体採取の標準化（検体の質の保証）

検体採取後における、時間経過に伴うＲＮＡの分解防止

検体前処理（ターゲット調整）の標準化 標識方法

重要用語の定義及び統一化 標準物質

内部標準物質 外部標準物質

ハイブリダイゼーション

革新的に新しい設計思想に基づくＤＮＡマイクロアレイ用プローブの最適化 未知の splicing に対応できる“更新”体制の整備

実験による確認方法の構築（可能であるが、極めて難しい）

１．４．２ 戦略的に取り組むべき具体的な課題

有識者で構成される第３回専門家委員会（平成１９年１月１７日、２２名出席）を開催し、第２回目

（平成１８年１０月２５日）専門家委員会開催後の調査・検討結果、及びヒト遺伝子発現解析データの 相互比較の可能性に関する調査・検討結果（後述）等を踏まえて、遺伝学的検査の信頼性・互換性 向上及び標準化に向けて、我が国の臨床検査機械システム産業が欧米諸国との技術的差別化及 び市場優位性のために戦略的に取り組むべき具体的な包括的課題として、「遺伝子発現検査の標 準化」について取りまとめた。（図３-１-８～図３-１-１３）

国民の望む医療の形は様々であるが、医師の診断根拠として利用される検査結果（の数値）は、

全国どこで検査しても同じ値が得られるべきであり（図３-１-８）、そのためには共通の物差しが必要 である。コレステロール等、通常の生化学検査に関しては、徐々にではあるが標準物質（基準測定操 作法で値付けが行われ、国がその値の信頼性を保証しているもの。）の整備が進んでいる。しかし、

遺伝子関連検査に関しては、国内だけでなく世界中どこにも標準物質が存在していない。

勿論、特定の研究所や企業、研究者個人が研究開発等のために、何らかの“基準”となる物質を 持っていることに疑う余地はないが、相互比較がなされていないため、絶対値が算出できない。７種 類に集約されたＳＩ（Ｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄ´ｕｎｉｔｅｓ）単位で値が付けられている標準物質と の比較の連鎖（トレーサビリティ）によってのみ、定量測定が可能となる。

遺伝子関連検査用の標準物質は、物質としては核酸そのもの、もしくは類似の構造を有する高分 子が想定されるため、純金属等の物理計量標準にはない困難さが伴い、開発への取組みが先送り されてきた経緯にある。困難さの理由としては、不安定、多種類、純度もしくは値付けの方法論が未 開発、等々列挙に事欠かない。想定される単位としては、ｍｏｌ が挙げられるが遺伝子の量が少な い（～10^-12）ため、氷点降下法の利用も想定できない。

核酸参照物質（標準物質）の整備は、必須の要件ではあるが、それだけでは遺伝子発現検査の信 頼性は担保できない。遺伝子発現検査の一連の流れを概観すると、検体採取（例えば、採血）からデ ータ処理（検査結果の“数値”を得る。）まで概ね７段階の操作が行われ（図３-１-９）、それぞれの段 階で検査結果に対する不確かさが累積する。

ＤＮＡマイクロアレイ等の様々な “道具” が考案され、将来の覇権を賭けて製品として市場にも流 通しているが、“測定”に関わる不確かさは、標準物質の整備と方法論としての標準化（確立）によっ て初めて解消可能となる。一方、測定に用いる検体の質保証に関しては、米国の企業が考案したＲ ＮＡに関する指標値（ＲＩＮ）が唯一の参考手段として普及しているだけである。

技術的な課題は山積している（図３-１-１０）が、ＲＮＡ検体の質保証及び一連の実験プロトコルの 標準化によって検査データの質保証が実現できれば（図３-１-１１）、遺伝子発現解析検査の臨床応 用及び産業応用が進み当該検査用機械システム市場の世界的な創生、拡大及び健全な発展が図 れる可能性が高い（図３-１-１２、図３-１-１３）。

遺伝子発現検査の標準化 ⇒ 国民の望む医療の提供

標準プロトコルによる 個別化医療のための診断の実現

標準プロトコルによる 個別化医療のための診断の実現

データ処理

検体Ｒ Ｎ Ａ の 質保証 及び 解析 デ ー タ の 質保証 シ ス テ ム の 確 立

全国どこでも、同一基準による治療の選択が可能

検体採取・調整

標識・ハイブリダイゼーション

図３-１-８ 遺伝子発現検査の標準化： 同一基準による医療を目指して

遺伝子発現検査の標準化

（調査・研究計画(案）の全体像）

個別化医療のための診断の実現 日本発の遺伝学的検査の質保証システム 日本発の遺伝学的検査の質保証システム ＲＮＡ抽出（内部参照RNA）

検体の収集

ハイブリダイゼーション

洗浄

データ取得

データ処理 ターゲット調整

AAAA…

AAAA…

AAAA…

**

*

検体ＲＮＡの質保証体制の整備

（チェックポイント、チェック方法、基準値の設定）

• ＲＮＡの分解度判定、定量技術

• 参照ＲＮＡの大量合成技術、等 標準（リファレンス）プロトコル 標準（リファレンス）プロトコルの確立の確立

プロトコル：チップデータの質保証体制の整備

（基準プローブによる測定不確かさの基準設定）

• 外部・内部参照ＲＮＡによる特異性、感 度、再現性チェック 等

測定不確かさの基準値設定 測定不確かさの基準値設定

= +

精確な治療方針 サンプル採取

外部参照 RNAの添加

図３-１-９ 遺伝子発現検査の標準化： 調査研究計画（案）の全体像

実験プロトコルの標準化

コンテンツ、アルゴリズムに強く依存 ＲＮＡ抽出（内部参照RNA）

検体の収集

ハイブリダイゼーション

洗浄

データ取得

データ処理 ターゲット調整

外部参照 RNAの添加

安定発現遺伝子、鎖 長の異なる遺伝子等

産総研設計RNA やUCP-1 RNA等、

検体組織で発現し ていないRNA

基準プローブによる許 容範囲の設定

（特異性、感度など）

基準、チェックポイント（項目）

採取・輸送時の核酸安定性 ＲＮＡ分解の度合い

ＲＮＡ量（回収効率）

RNA純度

RT時の鎖長（合成度合い）

増幅効率 蛍光取り込み効率

測定不確かさの算出

ダイナミックレンジ（相対倍数量

：fold-change）による感度判定 複数の濃度の異なる外部参 照RNAの検出

（PMＴ値、シグナル値に依 存しない感度検定）

開発・整備すべき技術課題

（RNA Later, PaxGene）

内部参照RNA

3’PCR/,5’PCR比での評価 23S/18S rRNA比での評価 核酸(RNA）の定量

（吸光度測定）

外部参照RNA

3’PCR/,5’PCR比での評価 核酸（RNA）の定量 定量PCRでの増幅前後比較

（吸光度測定）

参照ＲＮＡに対する基準プローブ のデザイン

（特異性、感度、再現性の保証）

参照RNAリストの創出

（アレイＤＢ等の活用）

・内部参照RNA：組織共通的に 安定発現する遺伝子リスト

・外部参照RNA：各組織特異的 に発現していない遺伝子とヒト cDNAクローンとの対応リスト

赤字：必須開発項目

図３-１-１０ 遺伝子発現検査の標準化： 技術的課題の詳細

我が国の臨床検査機械システム産業が

欧米諸国との技術的差別化及び市場優位性のために 戦略的に取り組むべき優先課題

１ １ ．ＲＮＡ ． ＲＮＡ検体の質保証 検体の質保証

・ＲＮＡ標準物質 ・ＲＮＡ 標準物質 （参照物質）の開発 （参照物質） の開発

・

・ＲＮＡの純度測定 ＲＮＡの純度測定

・ ・検体採取後におけるＲＮＡの分解防止 検体採取後におけるＲＮＡの分解防止

２ ２ ．実験プロトコル ． 実験プロトコル の標準化 の標準化

・

・標識方法 標識方法

・遺伝子発現頻度検出用 ・ 遺伝子発現頻度検出用プローブの最適化 プローブの最適化

図３-１-１１ 遺伝子発現検査の標準化： 政策提言

ＲＮＡ検体の質保証 ＲＮＡ検体の質保証

（検体採取、検体調整の適正化）

（検体採取、検体調整の適正化）

解析データの質保証 解析データの質保証

（標識効率、遺伝子発現の絶対評価）

（標識効率、遺伝子発現の絶対評価）

遺伝子発現解析検査用機械システム市場 遺伝子発現解析検査用機械システム市場

の世界的な創生 の 世界的な創生・拡大及び発展 ・拡大及び発展

+ +

↓ ↓

図３-１-１２ 遺伝子発現検査の標準化： 機械システム市場の創生・拡大及び発展

図３-１-１３ 遺伝子発現検査の標準化： 国際標準化を含む今後の展開

第２章 ヒト遺伝子発現解析データの相互比較の可能性に関する調査・検討

互換性のある網羅的ヒト遺伝子発現解析への応用を想定した核酸（ＲＮＡ）標準物質に関する調 査研究として、人工的に合成（第２章 ２．１）した濃度既知の複数の純粋なヒト遺伝子完全長ｍＲＮＡ だけを使ったＤＮＡマイクロアレイ発現解析及び当該合成完全長ｍＲＮＡとヒトの標準組織（ＨｅＬａ細 胞）から調製された総ＲＮＡが共存する条件下でのＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析（第２ 章 ２．２）を実施して、夾雑物としてのＨｅＬａ細胞総ＲＮＡの影響をも考慮した条件でプラットフォーム 間のデータ互換性について調査・検討した。

更に、遺伝子発現解析検査の臨床応用及び産業応用の促進に向けて、より高い視点で、核酸標 準物質の整備に係る７項目の課題及び具体的な方策について取りまとめた。

２．１ 遺伝子ＲＮＡの合成

２．１．１ 完全長ｍＲＮＡの直接合成

ｐｏｌｙ (Ａ) + ｔａｉｌ 等の３’及び５’末端近傍領域を含む全ての配列情報が既知で、かつ検索に適し たヒト遺伝子に係る公開ｃＤＮＡライブラリーが整備されていないため、下記２条件に準拠して１７種類 のヒト遺伝子（表３-２-１）を選択して完全長ｍＲＮＡの直接合成を試み、１３種類の完全長ｍＲＮＡ

（表３-２-２、第２章 ２．１．４）（備考参照）を得た。

１） 遺伝子は、ヒト組織（ＨｅＬａ細胞）（注、ヒトのがん細胞から分離され、性質を維持しながら継代培 養されている組織。提供者の氏名を秘匿するためにＨｅLａと命名された。）で発現頻度が低く、

ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔの存在が知られていないものとする。

２） 蛍光標識の方法が異なる複数のプラットフォームで検討することを考慮して、未標識の完全長セ ンスＲＮＡとする。

備考 １７種類中の４種類について配列の一部欠損が観測されたが、発現解析に利用可能な１３ 種類の完全長ｍＲＮＡが得られた。尚、配列一部欠損の原因については、splicing の影響 等が想起されたが、詳細ついては不明。

尚、上記、完全長ｍＲＮＡの直接合成は、徳島大学ゲノム機能研究センターにおいて実施した。

表３-２-１ ｃＤＮＡ調製に用いた ｐｒｉｍｅｒ （完全長ｍＲＮＡの合成を試みた１７種類）

試料 No.

遺伝子名¹⁾

accession 鋳型²⁾ オリゴ名 方向³⁾ 塩基配列

GE1014 S agagccgcaggtcagtcgtg 1 L-FABP

NM_001443 肝臓

GE1015 AS aaaacaaagttcactttatt GE1016 S tgcagcttccttctcacctt 2 A-FABP

NM_001442 脂肪

GE1017 AS ctaaatctaaaaaaagttat GE1018 S tgggtcagtgtcacctccag 3 CKM

NM_001824 骨格筋

GE1019 AS aaggccaccaatgcttttat

GE1192 S caccagcaggtctacggcctccaaag 4 CKMT1B

NM_020990 脳

GE1073 AS tgcagcatagcaaggagtct GE1070 S ggctccggcttcaagatcaa 5 CKMT2

NM_001825 骨格筋

GE1161 AS gtaaagataggcaggatctacaatt GE1121 S cggggcgcggggcgctgcgg 6 SLC25 A10

NM_012140 肝臓

Ge1122 AS ggcagctcccggcatttattg GE1123 S gggcgctgaagtggagcagg 7 CYP 11A1

NM_000781 肝臓

GE1124 AS cgatggttcagctgtttattgtc GE1119 S gagttgccacagctcttctac 8 CYP 17A1

NM_000102 肝臓

GE1156 AS ctgtttatgcacatcactggc

GE1190 S cttcacctcactttaccttctcctccagc GE1191 AS tttaaagctgggaggttctgccaccaagc GE1154 S’ ggcattatctttggaggccg

9 PCK1⁴⁾

NM_002591 肝臓

GE1126 AS’ ccatcttttctataaaacttcattttg GE1172 S cagctacagcacagatcagcaccatg 10 SAA2

NM_030754 脂肪

GE1173 AS ccacctcttaagcatttattagatgcc GE1174 S cattcccagcctcacatcactcacacc 11 CCL19

NM_006274 脂肪

GE1175 AS ttagttgtaaacaccaggcggctttattgg GE1178 S gacccctcacactcacctagccacc 12 CRYAB

NM_001885 脂肪

GE1179 AS gcttgataatttgggcctgcccttagc GE1180 S aggagcgtttttggagaaagctgcac 13 ITLN1

NM_017625 脂肪

GE1181 AS ctcttctgccattaacattctagctactgggtaag GE1178 S gcaggggagctccgagtgtccacag

14 ITLN2

脂肪

GE1184 S gaccttgagggagttaatgtgtaatattctagg 15 LGALS2

NM_06498 脂肪

GE1185 AS ctcggctggaagtcttttattcttttaacttg GE1186 S cagagtcactcctgccttcaccatgaag 16 SLPI

NM_003064 脂肪

GE1187 AS cattgatcaactggcacttcttgaaagcctgc GE1188 S agcattcctccaacgggcaggtctcag 17 HAI-2

AF213678 脂肪

GE1189 AS gcagaaggcagagaggaaggtttaatgagccc

1) 上段に遺伝子名（略称）を、下段にデータベースでの accession number を示す。

各遺伝子の正式名称は以下の通りである。

L-FABP: fatty acid binding protein 1, liver (FABP1) A-FABP: fatty acid binding protein 4, adipocyte (FABP4) CKM: creatine kinase, muscle

CKMT1B: creatine kinase, mitochondrial 1B

CKMT2: creatine kinase, mitochondrial 2 (sarcomeric)

SLC25A10: solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; dicarboxylate transporter), member 10 CYP11A1: cytochrome P450, family 11, subfamily A, polypeptide 1

CYP17A1: cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1 PCK1: phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (soluble)

SAA2: serum amyloid A2

CCL19: chemokine (C-C motif) ligand 19 CRYAB: crystallin, alpha B

ITLN1: intelectin 1 (galactofuranose binding) ITLN2: intelectin 2

LGALS2: lectin, galactoside-binding, soluble, 2 (galectin 2) SLPI: secretory leukocyte peptidase inhibitor

HAI-2: HAI-2 related small protein

2) 試料Ｎｏ.１～９ の遺伝子については市販のＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを用いた。また、どの組織 のＲＮＡを用いたかも記載してある。試料Ｎｏ.１０以降の遺伝子については、徳島大学病院等に おいて開腹手術をうけた患者さんからインフォームドコンセントのもとに摘出された脂肪組織から 調製したＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを用いた。

3) オリゴの方向をセンス(Ｓ)、アンチセンス(ＡＳ)で示した。

4) ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲで調製したため２種の組み合わせのｐｒｉｍｅｒを用いた。