Retention Behavior of Ionic Compounds in Liquid Chromatography Using Superheated Water as the Mobile Phase Yusuke SUZUKI, Kazunori SAITOH, Takashi YARITA and Masami SHIBUKAWA

高温水を移動相とした液体クロマトグラフィーにおけるイオン性化合物の保持挙動

日大生産工 (院) ○鈴木 悠介 日大生産工 齊藤 和憲 産総研計測標準 鎗田 孝 日大生産工 渋川 雅美

【緒言】高速液体クロマトグラフィー(HPLC) は，現在最も多用されている分離分析法の一つ であるが，その移動相として汎用されている有 機溶媒は，環境や人体への悪影響が懸念されて おり，あらゆる分析法においてその削減が求め られている。一方，環境適合型の分離分析法と して，高温高圧状態の水，いわゆる超高温水を 移動相としたHPLCである，超高温水クロマト グラフィー(Superheated Water Chromatography, SWC)が近年注目を集めている。SWCは，水の 物性が温度に依存して変化することを利用し た溶出力の制御，および移動相の温度上昇によ るカラム効率の向上を目的としている^1,2)。

本研究では，SWC の適用範囲を広げること を目的とした。これまでSWCにおいては，主 に逆相系固定相が用いられ，試料化合物との疎 水性相互作用により分離が行われている場合 が多い。したがって，イオン性化合物の分離を SWC によって行った報告例はほとんど無い。

そこで，本研究ではイオン性化合物の分離への SWC の適用を目的とし，逆相系および陰イオ ン交換系におけるイオン性化合物の保持挙動 を移動相として高温水を用いて検討した。

【実験】本研究で使用したSWCシステムを Fig.1に示す。溶離液には，NaClおよびNaClO₄ 水溶液，または所定のpHに調整した各種緩衝 溶液を用いた。試料化合物には，数種の無機陰

イオンとL-α-アミノ酸を用いた。カラムオーブ ンはGC用のものを用い，オーブン内にはプレ ヒートコイル(ハステロイ製，0.5 mm i.d.×3 m) およびLCカラムを設置した。カラム充填剤と しては，ポリスチレン‐ジビニルベンゼン (PSDVB)樹脂(HAMILTON製，PRP-1)および，

Cl^-形強塩基性陰イオン交換樹脂(三菱化学製，

DIAION CDR10，イオン交換容量: 0.3 meq/ml)

を用いた。

Fig.

Fig.11Schematic diagram of SWC systemSchematic diagram of SWC system 1:eluent

1:eluent，，2:degasser2:degasser，，3:pump3:pump，，4:injector4:injector，，5:oven5:oven，，6:preheating coil6:preheating coil，，7:column7:column，， 8:cooling unit

8:cooling unit，，9:photo9:photo--diode array detectordiode array detector，，10:back pressure regulator10:back pressure regulator waste

1 1

2 2

3 3

4 4

6 6

77 5 5

8 8 9

9 10

10

Temperature: 40 Temperature: 40--120120℃℃

Back pressure:

Back pressure:3 3 MPaMPa

Flow rate: 0.6 ml/min Flow rate: 0.6 ml/min

Packing material:

Packing material:

PSDVB, PSDVB, anion exchange resin anion exchange resin

Fig.

Fig.11Schematic diagram of SWC systemSchematic diagram of SWC system 1:eluent

1:eluent，，2:degasser2:degasser，，3:pump3:pump，，4:injector4:injector，，5:oven5:oven，，6:preheating coil6:preheating coil，，7:column7:column，， 8:cooling unit

8:cooling unit，，9:photo9:photo--diode array detectordiode array detector，，10:back pressure regulator10:back pressure regulator waste

1 1

2 2

3 3

4 4

6 6

77 5 5

8 8 9

9 10

10

Temperature: 40 Temperature: 40--120120℃℃

Back pressure:

Back pressure:3 3 MPaMPa

Flow rate: 0.6 ml/min Flow rate: 0.6 ml/min

Packing material:

Packing material:

PSDVB, PSDVB, anion exchange resin anion exchange resin

waste 1 1

2 2

3 3

4 4

6 6

77 5 5

8 8 9

9 10

10

Temperature: 40 Temperature: 40--120120℃℃

Back pressure:

Back pressure:3 3 MPaMPa

Flow rate: 0.6 ml/min Flow rate: 0.6 ml/min

Packing material:

Packing material:

PSDVB, PSDVB, anion exchange resin anion exchange resin

【結果および考察】

1. 逆相系 SWC における無機陰イオンおよ びアミノ酸の保持挙動

まず，すでに高温高圧水に対して耐久性があ ることが示されているPSDVBカラム³⁾におけ る無機陰イオンおよびアミノ酸の保持挙動を 検討した。無機陰イオンの保持は，温度を上げ ることにより減少した。また，理論段数は増加 し，カラム効率の向上が示唆された。しかし，

いずれの温度においても無機陰イオンの保持

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Yusuke SUZUKI, Kazunori SAITOH, Takashi YARITA and Masami SHIBUKAWA

は非常に小さく，また互いに近接しており，分 離することは困難であった。

次に，pH 6.0リン酸緩衝液を移動相として用

いたときに得られた各種アミノ酸の保持係数

をFig.2に示す。大部分のアミノ酸はほとんど

保持されずに溶出したのに対して，チロシン，

フェニルアラニン，トリプトファン等の芳香族 アミノ酸は大きな保持を示した。これは固定相 との疎水性相互作用に起因するものと考えら れる。これらのアミノ酸の保持時間と移動相の pH との関係を調べたところ，中性領域での保 持が非常に小さくなった。この結果は，両性イ オンとして存在するpH範囲では，アミノ酸の 逆相系固定相への保持が小さくなることを示 している(Fig.3)。

オン交換樹脂は耐熱性に乏しい 伴

, R. J. Burgess, J. Chromatogr. A,

avid, A. C. Stephen, LCGC ASIA

a, M. Shibukawa, Anal.

. Peuha, M. Latva-Kokko, S.

(2005) 166

Fig.4 Dependence of retention volumes of inorganic anions on tem Fig.4 Dependence of retention volumes of inorganic anions on temperatureperature

a

a): ): EluentEluent: 50 : 50 mMmMNaClONaClO₄₄solution, b): solution, b): EluentEluent: 50 : 50 mMmMNaClNaClsolutionsolution

2. 陰イオン交換系 SWC における無機陰イオ ンの保持挙動

これまで，イ

とされ，高温高圧条件下において使用されたこ とは，ほとんどなかった。しかし，Tiihonenら は，イオン交換樹脂が150℃の高温に耐えうる ことを示した⁴⁾。そこで本研究では，固定相と して陰イオン交換樹脂をSWCに導入すること とした。50 mM NaClO4水溶液を移動相として

用いたとき，SCN^-を除いた陰イオンは，温度 の上昇に伴い保持が大きくなった。次に，50 mM NaCl水溶液を用いたとき，IO₃^-は，温度が 上昇すると保持が大きくなったのに対してBr^- とNO3

-については，保持が減少した(Fig.4)。ま た，NaClO₄水溶液を移動相としたときBr^-と NO3-については，いずれの温度においても保持 が非常に近接しており，分離が困難であったの に対し，NaCl水溶液を用いたときについては，

両者を良好に分離することができた。これらの 結果から，温度と溶離電解質を変えることによ って，陰イオンの保持を選択的に制御しうるこ とがわかった。

一方，I^-と SCN^-については，温度の上昇に いピーク面積の減少が見られた。そこで，移 動相に還元剤であるNa2SO3を添加した。その 結果，ピーク面積の減少は抑制された。これは，

高温条件下で試料の一部が酸化されてしまっ たことによるものと推測される。

【参考文献】

1) R. M. Smith 785 (1997) 49 2) C. Zhu, M. D PACIFIC, 8 (2005) 48

3) T. Yarita, R. Nakajim Sci., 19 (2003) 269

4) J. Tiihonen, E. V

Silander, E. Paatero, Sep. Purif. Technol., 44

3 6 9 12 15

40 60 80 100 120

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

a)

5 15 25 35 45 55 65 75

40 80 120 160

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

b)

◆:Br^-

■:IO₃^-

▲:NO₃^-

●:I^-

＊:SCN^-

◆:Br^-

■:IO3-

▲:NO₃^-

Fig.4 Dependence of retention volumes of inorganic anions on tem Fig.4 Dependence of retention volumes of inorganic anions on temperatureperature

a

a): ): EluentEluent: 50 : 50 mMmMNaClONaClO₄₄solution, b): solution, b): EluentEluent: 50 : 50 mMmMNaClNaClsolutionsolution

3 6 9 12 15

40 60 80 100 120

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

a)

3 6 9 12 15

40 60 80 100 120

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

a)

5 15 25 35 45 55 65 75

40 80 120 160

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

b)

5 15 25 35 45 55 65 75

40 80 120 160

Temperature (℃)

Retention volume (ml)

b)

◆:Br^-

■:IO₃^-

▲:NO₃^-

●:I^-

＊:SCN^-

0 1 2 3 4

Gly Le

u Met Phe Trp Ser Tyr Sy s As

p H

is

Retention factor (k)

Fig.2 Retention factors of amino acids obtained in the system wh Fig.2 Retention factors of amino acids obtained in the system where ere phosphate buffer (pH6.0) was used as the mobile phase

phosphate buffer (pH6.0) was used as the mobile phase 0

1 2 3 4

Gly Le

u Met Phe Trp Ser Tyr Sy s As

p H

is

Retention factor (k)

0 1 2 3 4

Gly Le

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p H

is 0

1 2 3 4

Gly Le

u Met Phe Trp Ser Tyr Sy s As

p H

is

Retention factor (k)

Fig.2 Retention factors of amino acids obtained in the system wh Fig.2 Retention factors of amino acids obtained in the system where ere phosphate buffer (pH6.0) was used as the mobile phase

phosphate buffer (pH6.0) was used as the mobile phase

◆:Br^-

■:IO3-

▲:NO₃^-

20

0 4 8 12 16

2 4 6 8 10

pH

Retention factor (k)

▲: Trp

■: Phe

×: Tyr

◆: His

Eluent

Eluent: pH 2.0: 10 : pH 2.0: 10 mMmMNaClONaClO44/HClO/HClO44, pH 6.0: 10 , pH 6.0: 10 mMmMphosphate buffer solution, pH 10.0: phosphate buffer solution, pH 10.0:

10

10 mMmMNaOH/NaNaOH/Na₂2BB₄4OO₇7, Sample concentration: 0.1 , Sample concentration: 0.1 mMmM, Temperature: 40, Temperature: 40℃℃ Fig.3 Dependence of retention factors of amino acids on the Fig.3 Dependence of retention factors of amino acids on the pH of the mobile phase

pH of the mobile phase Eluent

Eluent: pH 2.0: 10 : pH 2.0: 10 mMmMNaClONaClO44/HClO/HClO44, pH 6.0: 10 , pH 6.0: 10 mMmMphosphate buffer solution, pH 10.0: phosphate buffer solution, pH 10.0:

10

10 mMmMNaOH/NaNaOH/Na₂2BB₄4OO₇7, Sample concentration: 0.1 , Sample concentration: 0.1 mMmM, Temperature: 40, Temperature: 40℃℃ Fig.3 Dependence of retention factors of amino acids on the Fig.3 Dependence of retention factors of amino acids on the pH of the mobile phase

pH of the mobile phase

0 4 8 12 16

2 4 6 8 10

pH

Retention factor (k)

▲: Trp

■: Phe

×: Tyr

◆: His 20