博 士 （ 理 学 ） 楊 晶 晶
学位論文題名
A Study on the Effect of Hydrogel Sca 任61ds OntheBehaViorandFateofHumanCe11S
（ハイドロゲルの物性によるヒト細胞の挙動と運命の制御）
学位論 文内容の要旨
Many patients in need of organ transplants die while waiting for a suitable donor. Ttierefore, tissue engineering, which is a method by using scaffolds to expand the isolated cells or develop tissues from the isolated cells in vitro, has recently been proposed as an alternative treatment to whole organ transplantation, due to limited amount of donor organs available. In this case, the properties and functions of cells and tissues developed by tissue engineering in vitro were expected to be similar to that in vivo. In fact, isolated cells are usually expanded in vitro for tissue engineering by using a polystyrene (PS) scaffold, which is a widely used scaffold in cell culture in vitro. However, there are many researches showed that some cells lost their specific functions when cultured on this flat PS scaffold. The cells of human body reside in a complex environment whose nature is both biochemical and biomechanical. The complex environment surrounding each tissue in vivo is unique, and plays important role in regulating the development and maintaining the normal function of cells, which will influence the function of tissues. Therefore, it is necessary to find out the appropriate environment, which is called as scaffold in tissue engineering, for specific cell culture in vitro.
Hydrogels with three‑dimensional network structure and viscoelasticity are similar to those of the macromolecular‑based extracellular matrix ECM in biological tissue. As a result, hydrogels are commonly used not only as scaffolds for repairing and regenerating a wide variety of tissues and organs but also as substitute materials to develop artificial tissues and organs. A variety of naturally derived hydrogels can;be used for tissue engineering scaffolds. However, these hydrogels usually show a poor cellular compatibility without modification with cell adhesive proteins. Our previous study showed that synthetic hydrogels with negative charges, such as poly (sodium p‑styrene sulfonate) (PNaSS), poly (2‑acrylamido‑2‑methylpropanesulfonic sodium) (PNaAMPS), could be used as good scaffolds for endothelial cells (ECs) culture without the need for any surface modification. Synthetic hydrogels have many advantages over natural hydrogels, for example, they are infection‑free and low cost, can withstand high‑temperature sterilization, have controllable and reproducible properties, can mimic several properties of natural ECM to regulate biospecific cell adhesion and cell migration.
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Based on these results, in this study, we focus on the 2‑dimensional cell culture by using hydrogels as scaffolds, and study on the effects of properties of hydrogels on the behavior and fate of human cells. Two kinds of cells, one is an anchorage independent cell, chondrocyte, which exists in a 3‑dimensional environment in vivo, and the other one is an anchorage dependent cell, endothelial cell, which exists as mono‑layer in vivo, were used in this study. The behaviors of these cells were investigated when cultured on the surface of several hydrogel scaffolds with different properties. The dissertation covers 4 chapters: chapter l is the general introduction, chapter 2〜 3 are the main text, and chapter 4 is the conclusions. The main results are given as follow:
In chapter 2, the spontaneous redifferentiation of chondrocytes was found on the surface of neutral hydrogels, such as poly (N, N'‑dimethylacrylamide) (PDMAAm) etc., but was not on the surface of negative charged hydrogels, such as PNaAMPS etc. Furthermore, the redifferentiation of chondrocytes can be regulated by the charge density of hydrogel scaffolds. The normal human articular chondrocytes‑knee (NHAC‑kn) cells form cell colonies, show cartilage‑specific morphology and high cartilage‑specific gene expression on neutral hydrogel and hydrogels with low charge density. The results indicate that this redifferentiated behavior on chondrocytes is due to a proper weak adhesion of these hydrogels to adhesive protein existed in the cultivate solutions, which prevent a strong adhesion of the substrates to the cells. We assume that the weaker adhesion of the gel favors the 3D stacking of the cells, which is similar to the behavior in vivo, and this promotes the redifferentiation of the cells.
In chapter 3, The gene expression, glycocalyx content, and surface properties of human coronary artery endothelial cells (HCAECs) cultured on PNaSS hydrogels with various levels of elasticity ranged in 3 kPa〜 300 kPa were measued. We found that all HCAECs reached confluence on these hydrogels while retaining the similar expression of EC‑specific markers to that on PS, a widely used scaffold in cell culture in vitro. Polymerase chain reaction (PCR) and glycosaminoglycan assay .
showed that the amount of EC‑specific glycocalyx secreted by HCAECs cultured on PNaSS was higher than that cultured on PS, and.it increased with an increase of gel elasticity. Furthermore, the HCAECs cultured on PNaSS gels showed excellent property against platelet adhesion and low surface friction than that on PS. The platelet adhesion and surface friction of HCAECs cultured on PNaSS gels also depend on the elasticity of gels. The largest amount of EC‑specific glycocalyx, excellent blood compatibility, and the lowest friction were observed when the elastic modulus of the gel was larger than 60 kPa. Overall, HCAECs cultured on these hydrogels have better surface properties than those cultured on PS scaffolds, demonstrating the PNaSS gels as potential tissue engineering material for blood vessels.
The results in this study promise a novel, less exp.ensive, and efficient method to obtain the redifFerentiated chondrocytes, and a novel culture system to get more similar functions of endothelial cells in vitro to that in vivo. It is expected that these synthetic hydrogels can be used as excellent scaffolds in fundamental medical research and tissue engmeering in future.
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学 位論文審 査の要旨
主 査 教 授 冀 剣 萍 副 査 教 授 佐 々 木 直 樹 副 査 准 教 授 福 井 彰 雅 副 査 准 教 授 芳 賀 水
学位論文題名
A Study on the Effect of Hydrogel Sca 任61ds OntheBehaViorandFateofHumanCe11S
（ ハ イ ド ロ ゲ ル の 物 性 に よ る ヒ ト 細 胞 の 挙 動 と 運 命 の 制 御 ）
博 士 学 位 論 文 審 査等 の 結果 に っい て（ 報 告）
ハ イ ド ロ ゲ ル は3次 元 網 目 の 中 に 多 量 の 水 を 含 ん で い る の で 、 生 体 組 織 と 似 っ て い る と 言 わ れ て い る 。 そ の た め 、 細 胞 培 養 基 盤 と し て 再 生 医 療 へ の 応 用 を 目 指 す 研 究 が 最 近 盛 ん に 行 わ れ て い る 。特 に 、 化 学 架 橋 の ハ イ ド ロ ゲ ル は 化 学 種 、 電 荷 、 弾 性 率 な ど 様 々 な 物 性 が 系 統 的 に 調 整 す る こ と が 可 能で あ る た め 、 基 盤 の 物 性 が 細 胞 の 増 殖 ・ 分 化 へ の 影 響 を 検 討 す る 基 礎 研 究 、 更 に は 、 諸 ニ ー ズ に 合 わ せた 細 胞 培 養 基 盤 を 開 発 す る 応 用 研 究 に お い て 、 高 い 可 能 性 を 秘 め て い る 。 従 来 の 研 究 で 用 い た ゲ ル は 細胞 に 対 す る 接 着 性 が 低 く 、 ゲ ル 表 面 に 細 胞 接 着 タ ン パ ク の 処 理 が 必 要 で あ っ た 。 本 学 位 申 請 者 が 所 属 する 研 究 室 で は 、 ア ニ オ ン 性 高 分 子 ゲ ル を 用 い て 、 表 面 処 理 せ ず に 内皮 細 胞を 培 養す るこ と に成 功 した 。 しか し 、 培 養 し た 内 皮 細 胞 の 物 性 及 び ゲ ル に よ る 他 の 細 胞 の 制 御 な ど は ま だ 分 か っ て い な い 。 本 学 位 論 文 で は 、 中 性 お よ び 負 電 荷 を 持 つ ハ イ ド ロ ゲ ル 上 に お け る ヒ ト 細 胞 の 挙 動 に っ い て 評 価 し た 。 そ の 際 に 、 ゲ ル の 弾 性 率 、 膨 潤 度 、 電 荷 密 度 な ど の 物 性 を 系 統 的 に 変 化 さ せ た 。 細 胞 は 非 接着 依 存 性 細 胞 （ 軟 骨 細 胞 ）と 接着 依 存性 細 胞（ 血 管内 皮 細胞 ）を 用 いて 実 験を 行 った 。軟 骨 細胞 に おい て は、 マ イ ナ ス 電 荷 を 持 つ モ ノ マ ー と 中 性 な モ ノ マ ー を 共 重 合 し 、 様 々 な 電 荷 密 度 を 持 つ ハ イ ド ロ ゲ ル 上 での 脱 分 化 し た ヒ ト 軟 骨 細 胞 の 再 分 化 性 に っ い て 調 べ た 。 そ の 結 果 、 ゲ ル 上 で は 脱 分 化 し た 軟 骨 細 胞 が 自発 的 に 再 分 化 す る 現 象 を 発 見 し た 。 こ れ は 二 次 元 基 盤 上 で 軟 骨 細 胞 が 再 分 化 す る 初 め て の 例 で あ る 。 また 、 ハ イ ド ロ ゲ ル の 電 荷 密 度 に よ る 、 軟 骨 細 胞 の 再 分 化 性 が 制 御 で き る こ と も 明 ら か に な っ た 。 す な わち 、 ハ イ ド ロ ゲ ル の 電 荷 密 度 が 低 い ほ ど 、 軟 骨 細 胞 の 再 分 化 が 促 進 さ れ る こ と が 分 か っ た 。 一 方 、 内 皮細 胞 に お い て は 、 マ イ ナ ス 電 荷 を 持 つ モ ノ マ ー を 重 合 し 、 架 橋 剤 の 変 化 に よ る 弾 性 率 が 違 う ハ イ ド ロ ゲル を 用 い て 、 ヒ ト 血 管 内 皮 細 胞 の 挙 動 を 調 ぺ た 。 そ の 結 果 、 ゲ ル の 弾 性 率 が 上 が る と 培 養 し た 内 皮 細 胞が 分 泌 し た 特 徴 的 な 糖 鎖 の 量 が 多 い こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 ゲ ル の 弾 性 率 が 上 が る と 培 養 し た 細胞 の 表 面 血 小 板 適 合 性 が よ く な り 、 ガ ラ ス 基 板 上 で の 滑 り 摩 擦 が 小 さ く な る こ と が 分 か っ た 。 さ ら に 、ハ イ ド ロ ゲ ル 上 で 培 養 し た 血 管 内 皮 細 胞 の 表 面 物 性 は 普 通 培 養 用 ポ リ ス チ レ ン 基 盤 上 で 培 養 し た も の よ り 表 面 物 性 が 良 く 、 生 体 内 の 血 管 内 皮 細 胞 の 表 面 物 性 と 近 い こ と が 明 ら か に な っ た 。 本 研 究 は さ ら に 、 な ぜ ハ イ ド ロ ゲ ル の 電 荷 密 度 や 弾 性 率 に よ っ て 細 胞 の 挙 動 が 大 き く 異 な る かに っ い て 、 細 胞 と 基 盤 と の 相 互 作 用 の 観 点 か ら 検 討 し た 。 中 性 な ゲ ル 上 で 細 胞 を 培 養 す る と 、 基 盤 と 細胞 の 相 互 作 用 が 弱 く 、 ゲ ル 上 で の 細 胞 運 動 が 促 進 さ れ 、 細 胞 と 細 胞 の 相 互 作 用 が 強 く な る 。 そ の た め 、二 次 元 基 盤 上 で 三 次 元 な 細 胞 構 造 が 形 成 さ れ た 。 こ の よ う な 環 境 は 非 接 着 依 存 性 細 胞 の 生 体 内 環 境 と 近 い た め 、 非 接 着 依 存 性 細 胞 に と っ て 最 適 な 培 養 基 盤 と な っ た と 考 え ら れ る 。 そ れ に 対 し 、 マ イ ナ ス 電荷 を 持 っ ゲ ル 上 で 細 胞 を 培 養 す る と 、 基 盤 と 細 胞 の 相 互 作 用 が 強 く 、 非 接 着 依 存 性 細 胞 が 単 層 な 細 胞 にな っ て し ま い 、 物 性 が 劣 化 し て 行 っ た と 考 え ら れ る 。 ー 方 、 マ イ ナ ス 電 荷 を 持 っ ゲ ル 基 盤 と 細 胞 の 相 互作 用 が 強 い た め 、 接 着 依 存 性 細 胞 は 基 盤 上 で 強 く 接 着 し 成 長 し た 。 こ の よ う な 環 境 は 接 着 依 存 性 細 胞 の生 体 内
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環 境 と 近 い た め 、 接 着 依 存 性 細 胞 に と っ て 最適 な 培 養 基 盤 と なっ た と 考 え ら れ る 。ま た 、 接 着 依 存 性の 細 胞 は 基 盤 ー の 依 存 性 が 高 い た め 、 培 養 し た 細 胞 の 物 性 が ゲ ル の 弾 性 率 に 強 く 影響 さ れ た と 考 え られ る 。
本 研 究 で 得 ら れ た 成 果 は 再 生 医 療 分 野 に お け る 基 礎 研 究 や 応 用 研 究 に 大 きく 貢 献 す る も の であ る 。 よ っ て 著 者 は 、 北 海 道 大 学 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め る 。
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