腸管マクロファージの形質制御機構の解明

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腸管マクロファージの形質制御機構の解明

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第2 章実験方法 使用機器・試薬表1,2 に示す。実験動物＜野生型マウス＞日本クレアから購入した。(C57BL/6J、♀、6-12 週齢、体重 30g 以下) ＜Maf 胎仔肝・骨髄キメラマウス＞ Maf の機能を調べるためには Maf 完全欠損マウスを解析する必要があるが、当該 マウスは出生前後に致死となる23_{。そこで、}_{CD45.1 の Maf}+/-_{マウスおよび}_Maf-/-_{マウ} ス胎仔肝臓から、造血幹細胞を含む胎仔肝臓細胞を調製し、これを野生型マウスに移植することで、造血幹細胞由来細胞でのみMaf を欠損するキメラマウスを作製し た。CD45.2 の野生型マウスに 8 Gy の X 線を照射して骨髄細胞を破壊した後、1 x 106_{から} _{5 x 10}6_{個の Maf}+/-_{胎仔肝臓細胞および} _Maf-/-_{胎仔肝臓細胞を静脈内注射に} より移植し、胎仔肝キメラマウスを作製した。移植から7-10 週間後の末梢血をフローサイトメトリー解析し、キメラ率が 90%以上の個体を実験に用いた。胎仔肝キメラマウスは個体数が少ないため、このマウスの骨髄細胞を移植した二次移植キメラマウスを作製し、個体数を確保した。移植から2 ヶ月以降に、Maf 胎仔肝キメラマ ウスから上腕骨、大腿骨及び脛骨を摘出し、CD45.1+_{の骨髄細胞を調製した。胎仔肝} キメラマウスと同様の方法で野生型マウスに骨髄細胞を移植した。＜Nrf2 欠損マウス＞ 東北大学医化学教室山本雅之先生から分与を受けた51_。上記の遺伝子改変マウスについて、ジェノタイピングに使用したプライマーセットを表3 に示す。炎症モデル＜デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導大腸炎＞

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＜酢酸誘導大腸炎モデル＞野生型マウスを6 時間絶食後、さらに 3 ml の下剤を（ニフレック、味の素）を経口投与針（夏目製作所）で1 時間毎に、3 回投与した。下剤投与から 12 時間後、軟性ゾンデ（FUCHIGAMI）で 100 µl 4% 酢酸を注腸した。10 秒後、直ちに 500 µl 生理食塩水を3 回注腸し、酢酸を希釈した。細胞の調製＜末梢血・骨髄細胞＞末梢血細胞については、ヘマトクリット毛細管を用いて眼窩静脈叢から末梢血を採取した。氷上にて、全血20 µl を 1 x Pharm Lyse 200 µl で 5 分溶血後、MACS Running buffer (0.5% BSA / 2 mM EDTE / PBS)で洗浄し、遠心後のペレットをフローサイトメトリー解析に使用した。骨髄細胞については、マウスを十分な麻酔下で安楽死させ、上腕骨、大腿骨及び脛骨を摘出後、MACS running buffer が入った 60 mm 無処理ディッシュに回収した。両側の骨端をハサミで切断し、断面に1 ml シリンジ (26G 針付, テルモ) で MEMαを注入し、流出する骨髄細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液をナイロンメッシュでろ過して15 ml チューブに回収した。遠心後、上清を除いたペレットに2 ml の 1 x Pharm Lyse を加えて溶血し、洗浄した。＜骨髄由来マクロファージ (BMDM)、骨髄由来樹状細胞 (BMDC) の誘導＞骨髄細胞を 1 x 106_{細胞 / ml になるよう、MEMα / 10% M-CSF (細胞株 CMG-14-12 の培} 養上清) / 10% FCS / 1% Penicillin-Streptomycin (以降 P/S)、もしくは RPMI-1640 / 10% GM-CSF (細胞株 MGM-5 の培養上清) / 10% FCS / 1% P/S に懸濁し、10 cm コートディッシュ、もしくは 60 mm 非コートディッシュに播種し、BMDM もしくは BMDC を誘導した。＜リンパ節のマクロファージ・樹状細胞＞

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＜大腸粘膜固有層の細胞＞マウスの大腸を摘出し、内容物をPBS で洗浄した。余分な脂肪や組織を取り除き、腸管を縦方向に切開した。氷冷した PBS で再度洗浄し、 2-3 等分した後、 EDTA solution; 20 mM EDTA pH 7.2 / 2% FCS / 1x HBSS に入れ、湯浴で撹拌しながら 15 分間、37℃でインキュベートした。PBS で腸を洗浄し、残存した上皮細胞をピンセットで鈍的に剥離した。断片がおよそ φ5 mm 以下になるまで、腸をハサミでミンチし、Collagenase solution; 0.15 mg/ml Liberase TL / 0.5 mg/ml DNase I / 1% Dispase / 10 mM HEPES / 2% FCS / RPMI-1640 で 37℃, 100rpm, 30 分間、震盪した。その後、細胞懸濁液をセルストレイナーで濾過し、4˚C, 500 x g, 10 分間遠心し、洗浄した。細胞を濃縮する場合、更にCD11b-microbeads を加え、30 分間、氷上でインキュベートした。MACS Running buffer で洗浄し、AutoMACS Pro により CD11b+_{細胞を粗精製} した(POSSELD モード)。

BMDM または BMDC の形質変化の誘導

BMDM と BMDC を 4 日間培養後、7.5 x 104_{cells / 100 µl / well で 96 well plate に} 播種した。24 時間後にリポ多糖 (LPS, O55:B5、100 ng/ml) またはマレイン酸ジエチル (DEM, 100µM) 刺激した。刺激 5 時間または 24 時間後に培養上清を回収しサイトカイン濃度をELISA で定量した。さらに細胞から RNA を抽出し定量 PCR に用いた。 M1・M2 の形質変化を誘導する場合、10 ng/ml LPS と 20 ng/ml IFN-γ(M1 誘導)、もしくは 20 ng/ml IL-4 存在下（M2 誘導）で培養し、24 時間後の細胞を溶解して RNA を抽出した。酸化ストレスに対する応答を評価する実験では、BMDM を培養 4 日後、2.0 x 104 cells / 100 µl / well で 96 well plate に播種した。24 時間後に 50 µM、100 µM、200 µM の濃度になるようにtBHP (tert-butyl hydroperoxide, Sigma)を添加した。24 時間後に、 Cell counting kit-8 (DOJINDO)を培養上清の 10%量を加え、2 時間後に 460 nm 吸光度を測定して生存率を評価した。

フローサイトメトリー・セルソーティング

細胞と蛍光色素標識抗体を含む全ての試薬はMACS Running Buffer に懸濁した。 Fc-Blocker を加えて 5 分後に、細胞を蛍光色素標識抗体の溶液に懸濁し、30 分間氷上でインキュベートした。二次抗体が必要な場合は、MACS Running Buffer で洗浄後、更に当該抗体と20 分間、氷上でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し 7-AAD もしくは DAPI (いずれも 1 µg/ml)を添加し FACSVerse で解析した。

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いはSH-800 により分取し、RPMI-1640 (2 % FCS / 1 % P/S)もしくは TRIzol LS に回収した。培養液に回収した細胞をPBS で洗浄後、RNA を抽出した。

フローサイトメトリーに用いた抗体は表4 の通り。抗 CD169 抗体(Clone: M7)は当研究室で作製し17_{、EZ-Link (Sulfo-NHS-LC-LC Biotin, ThermoFisher scientific)により} ビオチン化した。ビオチン化抗体は PE-Streptavidin (0.2 µg/ml, Biolegend)あるいは Alexa fluor 488-streptavidine (1 µg/ml, ThermoFisher scientific)で検出した。

プラスミド

<ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築>

Ccl8, Ccl8-mut1, Ccl8-mut2, Ccl8-mut3, Ccl8-mut4, Slpi -Luc-pGL4.10 (図 4, 6b,c)

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＜Maf 発現ベクター（Maf-pBOSEX）の構築＞

Maf cDNA-pBlueScript プラスミド（筑波大学解剖学発生学研究室高橋智先生

から分与48_{）を}_{EcoRI および NheI で制限酵素処理し、pEFBOS-EX プラスミドに挿} 入した。

＜Maf 発現レトロウイルスベクター（Maf-pMSCV）の構築＞

Maf-pBOSEX を、EcoRV および SacI で制限酵素処理し、得られた DNA 断片を

DNA Blunting kit で平滑化した。pMSCV-pgk-Venus ベクター (タカラのベクター： pMSCV-pgk-puro を改変)を HpaI で消化し、平滑化断片を組み込んだ。

＜Nrf2 発現ベクター（Nrf2-pBOSEX）の構築＞

野生型BMDM から作製した cDNA を鋳型に、Nrf2 遺伝子を PCR で増幅した。 PCR 産物および pEFBOS-EX を、KpnI および NheI で制限酵素処理しライゲーションおよびクローニングした。

＜Maf 3´-UTR レポーターベクター（Maf 3´-UTR-psiCHECK2）の構築＞

野生型BMDM から作製した cDNA を鋳型に、Maf 遺伝子の終止コドン直後の Maf 3´-UTR 領域を PCR で増幅した。PCR 産物および pBluescript II SK(+)を EcoRI およびNotI で制限酵素処理し、ライゲーションおよびクローニングした。このプラスミドを XhoI および NotI で制限酵素処理し、psiCHEK2 (Promega)に組み込んだ。 MSCV レトロウイルス発現システム ＜ウイルスの作製＞パッケージング細胞 Platinum-E (Plat-E)細胞（東京大学医科学研究所先端医療研究センター細胞療法分野北村俊雄先生から分与 52_{）をトランスフェクション前} 日に、2 x 106_{細胞 / 4ml DMEM (10% FCS / 1% P/S) になるよう懸濁し、60 mm コー} トディッシュに播種した。24 時間後、Maf-Venus もしくは

pMSCV-pgk-Venus（以後、コントロールと表記）各 5 µg を、Plat-E 細胞に Fugene6 を用いてトラ

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抽出した。

4 日間培養後の BMDM を、5 x 104_{cells / 200 µl / well の条件で 48 well plate に播} 種した。24 時間後の培地を、MEMα / 10% M-CSF / 10% FCS / 1% P/S / ウイルス培養液 / polybrene (8 µg/ml)に交換し、Maf-pMSCV-pgk-Venus トランスフェクションした。 感染 16 時間後に培地交換し、さらに 40 時間培養した。この細胞に DEM（終濃度 100 µM）を添加し、さらに 5 時間後に、培地を除去し、LPS (100 ng/ml)で刺激した。 24 時間後に RNA を抽出した。 Total RNA 抽出

RNeasy Mini kit もしくは miRNeasy Mini kit のプロトコルに従い、RNA を抽出した。細胞は Buffer RLT もしくは TRIzol LS で溶解した。TRIzol LS で溶解した場合、 TRIzol LS : 細胞懸濁液が 3 : 1 になるよう液量を調製した。さらにこの液に対して、 1/5 量のクロロホルムを加え、有機層にタンパク質および DNA を、水層に RNA を溶解した。水層を回収し、以後、RNeasy Mini kit の推奨プロトコルに準拠して操作を行った。

定量RT-PCR (qRT-PCR) ＜mRNA の定量＞

100 ng – 1µg の RNA を ReverTra Ace qPCR RT Kit で逆転写した。得られた cDNA を鋳型とし、THUNDERBIRD® qPCR Mix のプロトコルに準拠して qRT-PCR を行った。18S rRNA の発現量を内在性コントロールとして、目的遺伝子の mRNA 発現量を相対的に定量した。qRT-PCR に用いたプライマーは表 6 に示す。

＜miRNA の定量＞

miRNA は、Taqman Micro RNA Assays (Applied Biosystems)キットのプロトコルに従い、逆転写およびqRT-PCR を行なった。Sno135 を内在性コントロールとして、miR-129, miR-155 の発現量を相対的に評価した。

DNA マイクロアレイ

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microRNA-sequencing (miRNA-seq)

6 日間培養した野生型 BMDM 5x 105_{cells / 2ml / well を 6 well plate に播種した。} 19 時間インキュベートした後、最終濃度 100 µM DEM を添加した。刺激から 5 時間後、miRNeasy mini kit を用いて miRNA を含む全 RNA を抽出した。Agilent 2100 Bioanalyzer and Quantus Fluorometer (Agilent)により RNA 濃度を測定した。NEBNext Multiplex Small 274 RNA Library Prep Set for Illumina (NEB)を用いてアダプター配列を付与した RNA ライブラリーを作製し、3% アガロースカセットをセットした BluePippin (Sage Science)により miRNA を分離した。精製した miRNA を Illumina Hiseq 1500 platform でシークエンスした。Strand NGS software (v2.9, Agilent Technologies)を用い、得られた配列データからアダプター配列をトリミングし、 mm10 ゲノムシークエンスにマッピングした後、2 サンプルの発現量を分位正規化して統合し、散布図を作成した。

ルシフェラーゼアッセイ

RAW264.7 細胞をもしくは HepG2 細胞を DMEM / 10% FCS / 1% P/S で懸濁し、1 x 105 _{cells / ml に調製した。細胞懸濁液 500 µl を 24 well plate に播種した。24 時間} 後に発現ベクター、レポーターベクター、コントロールレポーター（pRLTK）のミックスをFuGENE6 によりトランスフェクションした。また、HEK293T 細胞 1x 104 個を96 well plate に播種し、24 時間後に Maf 3´-UTR-psiCHECK2 および miRNA mimic (miRCURY LNA inhibitor, control or miR-155 or miR-129, exiqon)を、Lipofectamine 3000 によりトランスフェクションした。トランスフェクション後 24 時間に Dual Luciferase Kit （Promega）付属のプロトコルに準拠して細胞溶解液を作製し、ルシフェラーゼ活性を GloMax-20/20 で測定した。Ccl8, Slpi, xCT-pGL4 のホタルルシフ ェラーゼ活性は、pRLTK 由来のウミシイタケルシフェラーゼの発光量をコントロールとして発光量を相対的に評価した。Maf 3´-UTR のルシフェラーゼ活性は、同プラ スミドに組み込まれているホタルルシフェラーゼの発光量をコントロールとして相対的に評価した。 ELISA

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え、1 時間室温でインキュベートした。5 回洗浄後、Assay Diluent で 250 倍希釈したHRP-SA (BD Biosciences)を 50 µL/well 加え、30 分間室温でインキュベートし、7 回洗浄した。TMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL)を加え、暗所で 30 分間、室温で発色させた。2N の H2SO4 25 µL/well で反応を停止し、450 nm の吸光度をマイクロプレートリーダー (Bio-Rad)で測定した。 IL-6、 IL-10 の ELISA は BD OptEIA ELISA Set （BD Biosciences）を用い、メーカー規定のプロトコル通りに操作した。

免疫組織化学染色

マウスから大腸を摘出し、内容物をPBS で洗浄した。5 mm 大に輪切りにした大腸をFrozen section compound (Leica)に浸し、液体窒素で凍結した。凍結した大腸を CM3050 S で 10 µm にセクショニングし、組織切片を 1 時間風乾した。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するため、組織切片を0.5% 過酸化水素 / メタノールに浸し、さらにBiotin blocking system (Dako)で内因性ビオチンをブロッキングした。 TN blocking buffer (ParkinElmer)でブロッキング後、ビオチン化抗 CD169 (clone: M7、フローサイトメトリーの項で記載した抗体と同様) および抗α-SMA ウサギ IgG (clone: ab5694, abcam)で標識した。TSA Biotin System (ParkinElmer)を用いてビオチン化抗体を増感した。二次標識はCy3-streptavidin (The Jackson Laboratory)およびAlexa Fluor 488-抗ウサギ IgG (Invitrogen)を用いて染色した。組織切片を

Fluorsave Reagent (Merck)/ DAPI (1 µg/ml)でマウントし、カバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡 BZ-X700 で蛍光を観察した。

ウエスタンブロット

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抗体 (2000 倍希釈で使用、Dako)を加え、室温で 1 時間インキュベートした。Super signal west pico を用いて発色させ、LAS4000mini で検出した。撮影後、抗体除去バッファー (2% SDS, 100 mM 2-メルカプトエタノール, 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.7))にメンブレンを浸し、50˚C, 70rpm, 30min 震盪した。再度ブロッキング処理し、 HRP- anti-GAPDH (2000 倍希釈で使用、MBL)で 30 分間標識後、内在性コントロールを検出した。統計処理グラフに示すデータは SD もしくは SEM を記載した。2 群間の比較には Mann-Whitney U test を用いた。2 群以上の比較には one-way もしくは two-way ANOVA を使用した。全ての解析において、p 値<0.05 の時に有意差ありと判定した。

表1：使用機器

機器メーカーカタログ番号

BD FACSVerse 6 color Flow Cytometer BD Bioscience 651154

BD FACSVerse Upgrade Kit - 6 color to 8 color BD Bioscience 651160

FACS Aria II BD Bioscience

マイクロプレートリーダー　モデル680 BIO RAD

Cell Sorter SH800S Sony

StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376598

3130xL Genetic Analyzer for Fragment Analysis Applied Biosystems A30469

Veriti Dx Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti 200

autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545

NanoDrop 2000 超微量紫外可視分光光度計 Thermo Scientific ND-2000

GloMax-20/20 Promega E5311

CM3050 S Leica

ImageQuant LAS4000mini GEヘルスケア

BZ-X700 Keyence

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表2：使用した試薬（ここに記載のないものは本文中に記載する）

試薬メーカーカタログ番号

MicroAmp® Optical Adhesive Film ABI 4311971

MicroAmp® Optical 96Well Reaction plate Applied Biosystems N8010560

Dispase BD Bioscience 354235

Cell Strainer, 70mm BD Bioscience 352350

OptEIAAssay Diluent BD Biosciences 555213

BD Pharm Lyse Lysing buffer (10x conc.) BD Bioscience 555899

6well Clear TC-Treated Microplates Corning 3516

60mm 無処理ディッシュ Corning 430589

HBSS (10X), calcium, magnesium, no phenol red GIBCO 14065056

96-Well Half-Area Microplates Greiner 675061

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Invitrogen 4337455

TRIzol LS Reagent Life Technologies 10296010

Immobilon P Merck IPVH00010

デキストラン硫酸ナトリウム MW36,000～50,000 MPBiomedicals 591-18791

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530

QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104

QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162

RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104

miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004

cOmplete、EDTAフリー、プロテアーゼ阻害剤カクテル Roche 11873580001

グリコーゲン Roche 10901393001

Liberase TL Roche 5401020001

D-MEM High Glucose Wako 043-30085

マレイン酸ジエチル Wako 059-02052

MEMα (L-グルタミン、フェノールレッド含有) Wako 135-15175

Penicillin-Streptomycin Solution (×100) Wako 168-23191

RPMI-1640 (L-グルタミン、フェノールレッド含有) Wako 183-02023

デキストラン硫酸ナトリウム5000 Wako 196-13401

Recombinant Murine IL-4 Peprotech 214-14

Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05

Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910

FuGENE® 6 Transfection Reagent Promega E2691

GoTaq DNA Polymerase Promega M3001

DNaseI Worthington biochemical LS002139

DNaseI Sigma DN125-1G

Collagenase Iis Sigma C1764

臭化ヘキサジメトリン (polybrene) Sigma H9268-5G

リポポリサッカリド大腸菌055:B5由来 Sigma L2880-10MG

Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227

SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34579

Nunc イージーディッシュ (60 mm, 100 mm) Thermo Scientific 150462, 150464

Lipofectamine 3000 Thermo Scientific L3000001

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO FSQ-301

THUNDERBIRD SYBR qPCR mix TOYOBO QPS-201

DNA Blunting kit タカラ 6025

Gel/PCR Purification Mini Kit (100) チヨダサイエンス FAGCK 001

Total RNA Extraction Column チヨダサイエンス FARBC-C50

HEPES ナカライテスク 17557-94

MG132　(Z-Leu-Leu-Leu-H) ペプチド研究所 3175-v

7-AAD Biolegend 420403

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表3：ジェノタイピング PCR に使用したプライマー

表4：フローサイトメトリー解析に使用した抗体

表5：プラスミド構築に使用したプライマーセット

Gene name Sequence (5'→3')

Maf WT Fwd CTGCCGCTTCAAGAGGGTGCAGC

Rev TCGCGTGTCACACTCACATG

Maf targeted Fwd TGTTCACGTTCGAGCTTTC

Rev GATTAAGTTGGGTAACGCC

Nrf2 Fwd TGGACGGGACTATTGAAGGCTG

lacZ GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG

Rev GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG

Gene name Sequence (5'→3')

Nrf2 Fwd ATAGGTACCCGCCCTCAGCATGATGGACT Rev GGCCGCTAGCCTAGTTTTTCTTTGTATCTG Ccl8プロモーター　Fwd ATAGGTACCTTCATTTCTATGTTTCAGAATCCCTG Rev TAATCTCGAGTGTTGAAGGCAAAGATTTTGGAGTGAAG Ccl8プロモーター mut1　Fwd CCAGTGGGACTGCTTCCTCCAGAAGAGAGGTTTCAGATGCTTGCCC Rev GGGCAAGCATCTGAAACCTCTCTTCTGGAGGAAGCAGTCCCACTG Ccl8プロモーター mut2　Fwd AGATTTTAGCATCTTATTCTGAAGAGACTGCCTTCCAGCTGCCGGGA Rev TCCCGGCAGCTGGAAGGCAGTCTCTTCAGAATAAGATGCTAAAATCT Ccl8プロモーター mut3　Fwd ATCTCATGATCTGATGACTATCTCTTCTAACAAAGATCTTGCTTTCA Rev TGAAAGCAAGATCTTTGTTAGAAGAGATAGTCATCAGATCATGAGAT Slpiプロモーター Fwd AGCAGGTACCAGGACACCACAGCTCCACGC Rev TAATCTCGAGCAGGGGAGCTCTGATGACCA

Maf 3'-UTR Fwd GTCCGGAATTCGACGCCTACAAGGAGAAATACGAG

Rev ATAAGAATGCGGCCGCCGTCACGCGTGGTTAGTTAGTA

抗体　（終濃度）メーカークローン名

anti-CD16/32 (2.5µg/ml, Fc-blockerと表記) Biolegend,Tonbo Biosciences 93 もしくは 2.4G2

anti-CD8a ( 0.5 µg/ml) Biolegend 53-6.7 anti-CD36 (1.0 µg/ml) Biolegend 72−1 anti-CD3e (2.0 µg/ml) Biolegend 145-2C11 anti-CD11b (0.5 µg/ml) Biolegend M1/70 anti-CD11c (1.25 µg/ml) Biolegend N418 anti-CD19 (2.0 µg/ml) Biolegend 6D5 anti-CD45.2 (2.0 µg/ml) Biolegend 104 anti-CD64 (2.0 µg/ml) Biolegend X54-5/7

anti-CD115 (2.0 µg/ml) Biolegend AFS98

anti-CD206 (2.0 µg/ml) Biolegend C068C2

anti-F4/80 (2.0 µg/ml) Biolegend CI:A3-1

anti–Ly-6C (0.8 µg/ml) Biolegend HK1.4

anti–Ly-6G (2.0 µg/ml) Biolegend 1A8

anti–Siglec F (2.0 µg/ml) Biolegend E50-2440

anti-CD45.1 (2.5 µg/ml) Biolegend,Tonbo Biosciences A20

anti–MHC class II (MHC II) (3 µg/ml) eBioscience M5/114

anti–MHC class I (2 µg/ml) BD Biosciences AF6-88.5

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表6. qRT-PCR に用いたプライマー配列 Gene name Sequence (5'→3')

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以前の研究で、骨髄細胞を GM-CSF 存在下で培養した細胞（BMDC）は、Maf を発現せず、LPS 刺激しても CCL8 を産生しないことを確認している 17,26_{。この細胞} に、Maf を強制発現させることで CCL8 産生能を獲得するか検討した。レトロウイルスベクターを用いて、BMDC にコントロールプラスミドもしくは Maf 発現プラスミドをトランスフェクションし、さらに LPS 刺激した際の遺伝子発現を定量した。その結果、Maf を強制発現させた BMDC では、LPS 刺激に伴う CCL8 発現レベルが、コントロールと比較して 600 倍に亢進した（図 3e）。これらの実験結果は、Maf 発現が、マクロファージのCCL8 産生に必要十分であることを明確に示している。また、ここまでの結果より、Maf は CD169+_{マクロファージの分化には必須ではないが、} マクロファージの機能制御に重要な役割を担っていることが明らかとなった。 Maf は CCL8 発現を転写レベルで促進する

Maf は Maf recognition element, (MARE:5´-TGCTGA (G/C) TCAGCA-3´ もしくは half-MARE; 5´-AT rich- TGCTGA(G/C)- 3´)に結合し、標的遺伝子の発現を制御する

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伝子群には、Ccl8、Fgl2、Mmp13 や Il10 などが含まれていた（図 5a,b）。これらの遺 伝子に共通する機能について遺伝子オントロジー解析をした結果、Maf 標的遺伝子 には炎症関連遺伝子が多く含むことが分かった（図5c）。一方、Tnf, Arg1 など典型 的なM1/M2 マーカーの発現は両群で同程度だった（図 5d,e）また、Maf が発現を抑 制する遺伝子には、Slpi や Slc7a11 (xCT コーディング遺伝子), Cxcl1 など炎症の回復 期や慢性期に発現が亢進する遺伝子が数多く含まれていた（図5f）29-32_{。我々は、こ} のような遺伝子の多くが、酸化ストレス応答のマスター転写因子Nrf2 の制御下にあることに着目した（図 5g）。最近、Nrf2 は、酸化ストレス応答以外にも、組織保護や抗炎症作用に関与することが明らかになってきた 33,34,35_{。これらの報告と我々の} 解析は、Maf が、炎症関連遺伝子の発現を正に制御する一方で、組織保護・抗炎症遺伝子の発現を負に制御することを示唆する。Slpi や xCT 以外に、他の Nrf2 標的遺伝子の発現を Maf が抑制するか検討した。代表的な Nrf2 標的遺伝子として知ら

れるHmox1, Nqo1 発現レベルを定量したところ、これらの遺伝子は Maf+/-_{BMDM お}

よびMaf-/-_{BMDM で差が見られなかった（図 5h）。このことは、Maf が全ての Nrf2} 標的遺伝子制御には関与しないことを示唆する。続いて、Maf の欠損とそれに伴う Nrf2 標的遺伝子の発現亢進が、酸化ストレスに対する抵抗性を上昇させるか検討した。Maf+/-_{および} _Maf-/-_{BMDM に tBHP で酸化} ストレスを与えた際の生存率を検討した。この結果、Maf-/-_{BMDM は酸化ストレス} に抵抗性を持つことが分かった（図5i）。この結果も、Maf による特定の Nrf2 標的遺伝子の転写抑制機能を反映したものと考えられた。組織保護遺伝子の発現はMaf が競合的に抑制する

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反対に、Nrf2 が Maf の転写活性を阻害し、急性炎症応答遺伝子の発現を抑制するか、Nrf2-/-_{マウスの骨髄から誘導した}_{BMDM を用いて検討した。これまでの報告で、} マレイン酸ジエチル（DEM）による酸化ストレス刺激は、Nrf2 を活性化し、その遺伝子発現を亢進することが知られている 37_{。図} _{6d に示すように、Nrf2}+/- _{BMDM で} はDEM 刺激による Slpi, Slc7a11 発現レベルが亢進するが、Nrf2-/-_{BMDM では DEM} で刺激しても、これらの遺伝子発現が亢進しなかった（図6d）。一方で、Nrf2+/-_{およ} びNrf2-/-_{BMDM の、LPS 刺激に伴う Maf 標的遺伝子 Ccl8 や Il10 発現レベルは同程} 度であった（図6e）。以上の結果は、マクロファージにおいて、Maf は Nrf2 の転写活性を拮抗的に抑制するが、Nrf2 は Maf の転写活性を抑制しないことを明確に示している。 Maf の発現量に応じてマクロファージの形質が変化する 我々は前項の実験で、DEM による酸化ストレス刺激が、 Maf 発現レベルおよび Maf タンパク質発現量を減弱することに着目した（図 7a）。この結果は、酸化ストレスが、Nrf2 を活性化すると同時に、Maf の活性を抑制することを示唆する。Nrf2 が制御する組織保護・抗酸化ストレス応答は、炎症収束期における組織修復に重要な役割を担う 38_{。このことから我々は、炎症回復期における大腸}_CD169+_{マクロファー} ジでは、酸化ストレス刺激下で Maf による Nrf2 の抑制が解除され、組織保護的形質に転換することを想定した。この仮説を証明するため我々は、DEM 刺激による Maf 発現低下が、マクロファージの形質の変化に関与するか検討した。野生型 BMDM を、DEM 刺激した後に LPS 刺激し、Maf ならびに Nrf2 の標的遺伝子発現レベルを定量した。DEM によりあらかじめ Maf を抑制した BMDM では、Ccl8, Il10 など Maf 制御下にある急性炎症応答遺伝子の発現上昇が抑制された一方で、Nrf2 制御下にあ

るSlpi, Slc7a11 の発現が劇的に亢進した（図 7b）。この変化が、主として Maf に依

(22)

ることから、我々は、プロテアソーム経路が関与する可能性を考えた。そこで、 DEM 刺激した BMDM に、プロテアソーム阻害剤 MG132 を添加し、Maf のタンパク質発現量をウエスタンブロットで評価したところ、MG132 は DEM による Maf のタンパク量減少を阻害した（図8a）。DEM 刺激による Maf 発現の低下は、mRNA レベルでも見られることからDEM 刺激による Maf タンパク質の発現低下には、プロテアソーム以外にも、転写抑制や転写後調節といった、何らかの調節機構が関与している可能性がある。T 細胞に発現する Maf がマイクロ RNA（miRNA）-155 によって負の制御を受けることが報告されていることから39,40_{、マクロファージにお} いても、同様の機序が働いている可能性を考えた。しかし、予想に反して、DEM 刺激したBMDM の Mir155 の発現を PCR で定量したが、定常状態と比較して発現 の亢進は見られなかった（図8b）。マクロファージでは、miR-155 以外のマイクロ RNA が Maf の分解に関与する可能性を考え、BMDM において、DEM 刺激により発現が変化するmiRNA を miRNA-seq により網羅的に解析したところ、定常状態と比べて10 倍以上亢進する miR-129 を同定した（図 8c,d）。さらに、miR-129 が Maf mRNA に直接結合して遺伝子発現を抑制するか、ルシフェラーゼアッセイにより検討した。miRNA は、mRNA の 3´-UTR 領域に結合し、mRNA の分解を促進する 39,40_{。ルシフェラーゼ遺伝子の下流に} _{Maf mRNA の 3´-UTR 領域を組み込んだレポ} ーターベクターを作製し、miRNA とともに、細胞株 HEK293T にトランスフェクションした。miR-129 導入は、コントロール miRNA を導入した場合と比較して、ルシフェラーゼ活性が有意に減少した（図8d）。この結果は、miR-129 が Maf mRNA の3´-UTR に結合し、mRNA 発現抑制や、分解に寄与することを示す。以上より、酸化ストレスがMaf タンパク質発現を 1) miRNA による mRNA の転写後調節と、 2）翻訳された Maf タンパク質のプロテアソーム経路による分解という、2 つの過程で抑制することを示す。腸炎の進展に伴いマクロファージの形質が変化する我々は、ここまでの研究で、Maf の発現量に応じてマクロファージが形質転換することを、in vitro で証明した。そこで次に、同様の現象が腸管マクロファージで も見られるか検討した。DSS 誘導腸炎モデルを用い、マクロファージの遺伝子発現を定量することで、炎症時におけるマクロファージの形質を調べた。腸炎の急性期である4 日目には、Ccl8 発現が亢進していた。一方、腸炎の回復が開始する 8 日目には、定常状態と比較してMaf の発現が減弱し、それに伴って Ccl8 発現の低

下と、Slpi, Slc7a11 発現の亢進が見られた（図 9a）。この結果は、腸炎の急性期に

(23)

(24)

(25)

のであり、マクロファージの形質変化がどのように制御されているのか、という免疫学上の中心課題に一つの答えを提示したものである。 Maf による腸管マクロファージの形質変化 Maf は、広範囲の細胞種に発現し、細胞や組織の分化に重要な役割を担うことが知られていた。例えば、Maf は、水晶体形成や、C57BL/6 マウスの胎仔肝における 2 次造血に重要な役割を担うことが報告されている48_{。また}_{Aziz らは、Maf と、も} う一つのlarge Maf である MafB が、マクロファージの自己複製を阻害していることを突きとめ、Maf がマクロファージの分化にも何らかの役割を担うことを示した49,50_。我々は、本研究で、Maf が、Nrf2 の転写活性を拮抗的に阻害することで、炎症経過に伴うマクロファージの形質変化を制御する、という新機能を発見した。この Nrf2 は、もともと抗酸化ストレス応答遺伝子の発現を促進し、組織保護に中心的な役割を担うことが知られていたが、最近、炎症性サイトカインの産生を抑制することで、抗炎症にも積極的に関与することが明らかになってきた 34_{。したがって} _Maf の阻害は、急性炎症を抑制すると同時に、マクロファージの性質をNrf2 優位な形質に転換することで、様々な慢性炎症疾患の治療に貢献できる可能性がある。

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図2. Maf は CD169+_{マクロファージの分化・局在を制御しない} (a-d) 図に示す組織に存在する免疫細胞の構成比をフローサイトメトリー解析した。Maf+/-_{キメラマウスおよび} _Maf-/-_{キメラマウスは、骨髄細胞を移植後}_{2 ヶ月の 2} 次移植キメラマウスで解析した。Maf を欠損した場合でも、各組織における免疫細 胞およびCD169+_{マクロファージの存在率は、変化しない。}_Maf+/-_{および}_Maf-/-_{キメ} ラマウス各 3 匹のうち、代表的な図を表示した。B; B 細胞、T; T 細胞、Mo; 単球、Neu; 好中球、Eos; 好酸球、Mφ; マクロファージを意味する。(e) 大腸に存在する7AAD-_CD11b+_Ly6G-_Ly6C-_CD64+_{マクロファージの内の} _CD169+_{マクロファー} ジの存在率（左）と細胞数（右）の平均値とSD をグラフに示した。Maf の欠損 は、CD169+_{マクロファージの細胞数にも影響しない。}_{n.s., not significant, Student’s} t-test. (f) 免疫組織化学染色によって、大腸の CD169（赤）、筋肉細胞のマーカーα-SMA（緑）、核（青）を蛍光染色した。Maf の欠損は CD169+_{マクロファージの局在} に影響しない。x20, スケールバーは 100µm を示す。2 回の独立した実験のうち、代表的な写真を掲載した。(g) 大腸に存在する 7AAD-_CD11b+_Ly6G-_Ly6C-_CD64+_{マク} ロファージを、CD169+_{および}_CD169-_{に分け、図に示すそれぞれの表面マーカー発} 現をフローサイトメトリー解析した。灰色：アイソタイプ抗体で染色したMaf+/-_マクロファージ、赤：図示する抗体で染色したMaf+/-_{マクロファージ}_{, 青：Maf}-/-_{のマ} クロファージを示す。Maf の欠損はマクロファージの表面マーカー発現に影響しな

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0 7 0 100 200 300 400 Days CCL8 (ng/ml)

a

Maf

+/-Maf-/-_{colon macrophages}

0 3 6 9 Ccl8 CD169- _CD169+ * 0 1 2 3 Maf CD169- _CD169+ * Fol d c ha nge CCL8 ELISA Serum C C L8 ( ng/ml) DSS day0 day7

b

* * n.s.

Maf-/-_{chimera mouse}

Maf +/-0 40 80 120 Ccl8 0 5000 10000 15000 20000 Il6 LPS

-

+

* * * * n.s. Maf +/-Maf-/-_BMDM

c

0 10 20 30 40 Maf 0 300 600 900 Ccl8 LPS

-

+

LPS

-

+

コントロール Maf 強制発現 BMDC -40 (h) ↑ ウイルス感染 ↓ RNA抽出 5 0 ↑ LPS

e

LPS

-

+

Fol d c ha nge Fol d c ha nge * * Fol d c ha nge 0 50 100 150 Il10 0 1 2 3 CD169 0 10 20 30 Maf Maf+/- _Maf-/- _LPS

-

+

_LPS

-

+

- + 0 1 2 3 4 CCL8 (ng/ml) LPS - + 0 1 2 3 IL-10 (ng/ml) LPS 0 - + 2 4 6 8 10 IL-6 (ng/ml) LPS

CCL8 ELISA IL-10 ELISA IL-6 ELISA

(31)

図3. Maf は CD169+_{マクロファージの機能を制御する}

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(33)

図4. Maf は CCL8 の発現を直接制御する

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0 3 6 9 Cxcl1 * Microarray of BMDM a -8 -4 0 4 8 12 Maf Maf +/-Maf -/-Slpi Ccl8 IL10 Slc7a11 (xCT) Vegfa Mmp13 Cxcl1 Fgl2 Maf-/-_BMDM Maf +/-0 50 100 150 Slpi 0 50 100 150 Slc7a11 Fol d cha nge * * 0 5 10 15 Slpi 0 2 4 6 Slc7a11 Fol d cha nge Nrf2-/-_BMDM Nrf2 +/-* * 0 50 100 150 0 100 200 300 400 500 600 Maf-/-_BMDM Maf +/-Sur vi va l ( % ) tBHP (µM) 0 20 40 60 80 100 Ccl8 0 20 40 60 Fgl2 0 20 40 60 80 Il10 LPS - + - + - + LPS - + - + Fol d cha nge Maf-/-_BMDM Maf +/-+ - LPS - + - + 0 10 20 30 Cxcl1 + -* b f g i * * *

GO Term P Value Benjamini

defense response 3.67E-13 1.07E-09

immune response 1.61E-10 2.35E-07

inflammatory response 1.12E-09 1.09E-06 positive regulation of immune system process 3.08E-09 2.25E-06 c * 0 2000 4000 6000 8000 Nos2 Maf+/- _Maf -/-Fol d cha nge 0 20 40 60 Il1b 0 0.5 1 1.5 2 Tnf 0 10000 20000 30000 Arg1 0 3000 6000 9000 Fizz1 0 3000 6000 9000 Chil3 Fol d cha nge

Maf+/- _Maf-/- _Maf+/- _Maf-/- _Maf+/-_Maf-/- _Maf+/- _Maf-/- _Maf+/- _Maf

(35)

図5. Maf は Nrf2 の転写活性と拮抗する

(a) LPS 刺激した Maf+/-_{BMDM および Maf}-/-_{BMDM の遺伝子発現をマイクロアレイ解} 析し、シグナル値を散布図で示した。赤で示すプロットは Maf-/-_{BMDM で発現が低} 下した遺伝子、青で示すプロットは Maf-/-_{BMDM で発現が亢進した遺伝子を意味す} る。2 倍以上発現が変動した遺伝子を記載した。 (b,f,g,h) 図に示した遺伝子型の BMDM における、LPS 刺激 5 時間後の遺伝子発現を qRT-PCR で定量した。Maf +/-BMDM もしくは Nrf2+/-_{BMDM において、未刺激の BMDM の遺伝子発現に対する相} 対値を縦軸に示した。Slc7a11 は xCT のコーディング遺伝子。Hmox1 は HO-1 のコ

(36)

0 10 20 30 40

Slpi

0 10 20 30

Slc7a11

DEM 0h 5h 24h 0h 5h 24h 0 100 200 300

Ccl8

0 200 400 600

Il10

LPS 0h 5h 24h 0h 5h 24h DEM LPS Nrf2-/-_BMDM Nrf2

+/-d

* * * * n.s. n.s. n.s. n.s. ARE consensus sequence

TGA (G/C) NNN GC MARE consensus sequence

TGC TGA (G/C) TCA GCA

(37)

図6. Maf は Nrf2 活性と拮抗するが、 Nrf2 は Maf を抑制しない

(38)

(39)

図7. Maf 発現量の減少によりマクロファージが形質転換する

(40)

0 40 80 120 5 10 15 20 5 10 15 20 Naive D E M 5h miR-129 0 100 200 300 Mir129 DEM 0 5 24 (h) Luc

Luc- Maf 3’UTR Reporter

+1 +2018 +2031

(41)

図8. Maf はプロテアソームおよび miRNA によって分解される (a) 100µM DEM および 10µM MG132 を添加し、5 時間培養した野生型 BMDM におけるタンパク質発現量をウエスタンブロットで確認した。DEM 刺激に伴う Maf 発現量の減弱は、MG132 によってキャンセルされる。写真は 2 回の独立した実験のうち、代表的なデータを記載した。(b) DEM 刺激した野生型 BMDM の miR-155 発現を qRT-PCR で定量した。DEM は miR-155 発現レベルを促進しない。縦軸には未刺激の BMDM に対する相対値を示した。n.s., not significant, one-way ANOVA. 2 回の独立した実験のうち、代表的なデータを記載した。(c) 100µM DEM 刺激した野生型 BMDM におけるmiRNA 発現レベルを microRNA-sequencing 解析した。直線より外側は DEM 刺激後 5 時間で 3 倍以上発現が変化した miRNA を示す。(d) DEM 刺激した野生型 BMDM における miR-129 発現を qRT-PCR で確認した。DEM 刺激によって miR-129 発現が亢進する。縦軸には未刺激の BMDM に対する相対値を示した。 (e) Maf 3´-UTR 上に存在する miR-129 結合配列を、microRNA.org で検索した結果（上）。miRNA ミミックをHEK293T 細胞に導入した際の Maf 3´-UTR レポータープラスミドのルシ フェラーゼ活性を示した（下）。Maf mRNA の 3´-UTR 上の 2 箇所に miR-129 が結合

し、Maf mRNA 発現を抑制する。 (b,d,e) 平均値と SD をグラフに示した。解析は

(42)

(43)

図9. 大腸マクロファージは Maf 発現の減少により形質を変える

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第6 章参考文献

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