修 士 学 位 論 文

修 士 学 位 論 文

題 名

人為選択実験によるアカショウジョウバエ の低温耐性に関する研究

指導教授 田村浩一郎 教授

令和 2 年 1 月 9 日 提出

首都大学東京大学院

理学研究科 生命科学専攻 学籍番号 18846409

氏 名 近藤 朋希

学位論文要旨（修士（理学））

論文著者名 近藤 朋希

人為選択実験によるアカショウジョウバエの低温耐性に関する研究

東南アジアの熱帯に分布していたアカショウジョウバエは、現在、温帯である西日 本でも生息が確認されている。先行研究の結果から、(1)アカショウジョウバエの日本 集団は台湾から移住し、その際に低温耐性が向上したと推測されている。(2)アカショ ウジョウバエの低温耐性の向上について、成虫を 20℃で数日間置くと、低温耐性が 向上する低温順化が知られている。(3)低温順化の際、複数系統間で発現量が異なる遺 伝子群に大きな違いがあることが分かっている。これらのことは、低温耐性の向上に 寄与する遺伝子セットは特定のものに限られず、複数存在している可能性を示唆する。

そこで本研究では、台湾のアカショウジョウバエ集団に低温耐性を向上させる複数の 遺伝子セットが存在するという仮定の下、これらの遺伝子セットに対して同時に自然 選択が働いた場合、特定の遺伝子セットが常に固定するとは限らず、どの遺伝子セッ トが固定するかは機会的に決まると考え、この仮説を検証することを目的とした。そ のためのアプローチとして、台湾産の系統から実験集団を構築し、1℃の低温による 人為選択を行うことで、実際に低温耐性が向上するか検証し、人為選択の効果がみら れた遺伝子群が人為選択集団間で共通しているか、あるいは異なっているかを調べた。

台湾で採取された 250 系統 1000 個体の実験集団を作成し、6 世代継代した後、そ こから人為選択集団と対照実験集団をそれぞれ5集団ずつ作成した。各人為選択集団 では成虫約2000匹ずつ1℃に22～26時間置き、約半数が生き残った条件の集団から 約1000個体を次世代の親として継代した。対照実験集団では低温処理を行わないで 約1000個体を次世代の親とした。継代前、継代11、21、31世代目の実験集団につい

て、Pool-seqを用いて全ゲノム配列を決定し、集団ごとの塩基多様度や、集団間のFst を求め、人為選択によって実験集団の遺伝的構成がどのように変化したか調べた。

31世代の間、毎世代人為選択を行いながら継代した結果、13世代目以降、人為選 択集団は対照実験集団に比べて低温処理後の生存率が有意に高くなった。Pool-seqに よって全ゲノム配列を決定し、10 kbセグメント単位で塩基多様度（π）を計算した 結果、人為選択集団と対照実験集団間の全セグメント平均値に有意な差はみられなか った。このことから、人為選択集団においてボトルネックのような集団サイズの急激 な変化は認められず、集団サイズを維持したまま継代が行われたことが示唆された。

次に、12,586タンパク質コード領域の塩基配列を用いて11世代目、21世代目、31世

代目における集団間のFstを計算し、近隣結合法を用いて集団間の系統関係を調べた 結果、いずれの世代においても人為選択集団が単系統にまとまった。また、継代した 世代数が多いほど、対照実験集団間および人為選択集団と対照実験集団の間の距離は 大きくなるのに対し、人為選択集団間の距離は小さくなることが分かった。このこと から、対照実験集団では継代により集団ごとに分化がランダムに進んだのに対し、人 為選択集団では選択の効果により各集団の遺伝的構成が収斂したと考えられた。

また、31世代目において、遺伝子ごとに人為選択集団と対照実験集団との間でFst を求め、人為選択集団と対照実験集団間の分化が相対的に大きい遺伝子を特定した。

その結果、平均して人為選択集団と対照実験集団の分化の程度が大きかった 60遺伝 子が強く人為選択の影響を受けた遺伝子として推定された。また、人為選択集団ごと にそのような遺伝子を特定した結果、110遺伝子が 5人為選択集団で共通して人為選 択の影響を受けた遺伝子として推定された。一方で、同様の操作を対照実験集団のみ で行った結果、5対照集団で共通して分化が大きい遺伝子は発見されなかった。これ らの結果を統計的に解析した結果、人為選択集団では5集団で共通してアレル頻度が 変化した遺伝子が有意に多いことがわかった。このことから、人為選択の効果は5集

団間で同一の遺伝子に及ぶ傾向が強いことが示唆された。強く人為選択がはたらいた と考えられる 60遺伝子と、5 人為選択集団に共通して選択の効果が見られた 110遺 伝子の中で低温耐性に関与する候補遺伝子を探索した結果、先行研究で示唆された脂 肪酸の生合成プロセスに関与する6遺伝子が同定された。この内、ELOVL、CG31523、

CG31522 はいずれも脂肪酸伸長の経路に関与する遺伝子であり、これらの遺伝子は細

胞膜に存在するC16脂肪酸を減少させる効果をもつと考えられる。一方で、細胞膜中の C16脂肪酸が増加するとショウジョウバエの低温耐性を向上することがわかっている。

よって、本研究で同定された脂肪酸伸長遺伝子は発現量が減少するような変異をもって いるか、それらの遺伝子の周囲に存在する発現量調節領域に対して人為選択が働いた可 能性がある。

学位論文要旨（修士（理学））

論文著者名 近藤 朋希

Research on cold tolerance in Drosophila albomicans by artificial selection experiments

Drosophila albomicans, which used to be distributed in the tropical zone of Southeast Asia, has now been found in the temperate zone of western Japan. The results of previous studies suggest that (1) the Japan population of D. albomicans migrated from Taiwan and cold tolerance was improved by natural selection. (2) Regarding the improvement of cold tolerance in D. albomicans, it is known that cold acclimation improves cold tolerance when adults are kept at 20 ℃ for several days. (3) Larger variation of gene expression upon cold acclimation among strains. These findings suggest that there may be more than one gene set contributing to the improvement of cold tolerance. The objective of this study was to test the hypothesis that multiple sets of genes that improve cold tolerance exist in the D. albomicans population in Taiwan, and that if natural selection acts on these gene sets at the same time, a particular gene sets will not always be fixed, and which gene sets will be fixed will be determined on an opportunistic basis. As an approach for this purpose, an experimental population was constructed from strains from Taiwan, and by performing artificial selection at a low temperature of 1 ℃, it was verified whether cold tolerance actually improved, and whether the gene sets in which the effect of artificial selection was observed was common or different between the artificial selection populations.

An experimental population of 1000 individuals from 250 strains collected in Taiwan was created, and after passing through 6 generations, an artificial selection population and a control experimental population were created from each of 5 populations. In each artificial selection population, about 2000 adults were kept at 1 ℃ for 22 ~ 26 hours, and about 1000 adults from a population with about half of the surviving conditions were passaged as the parents of the next generation. In the control experimental population, about 1000 individuals were used as parents of the next generation without cold treatment. The entire genome of the experimental population was sequenced using Pool-seq before passage, at passages 11, 21, and 31, to determine the nucleotide diversity (π) of each population and the Fst between populations, and to determine how artificial selection altered the genetic makeup of the experimental population.

As a result of successive culture with artificial selection every generation for 31 generations, the survival rate after cold treatment of the artificial selection population was significantly higher than that of the control experimental population after 13 generations. When the entire genome was sequenced by Pool-seq and the nucleotide diversity (π) was calculated in 10 kb segment units,

there was no significant difference in the mean value of all segments between the artificial selection population and the control experimental population. This suggests that the population size of the artificial selection population was maintained without any abrupt changes in the population size, such as bottlenecks. The sequence of the 12,586 protein coding region was then used to calculate the Fst among the populations in generations 11, 21, and 31, and the phylogenetic relationships among the populations were examined using the neighbor-joining method. The artificial selection populations were grouped into a single lineage in each generation. It was also found that the greater the number of generations passaged, the greater the distance between the control and artificial selection populations, and the smaller the distance between artificial selection populations. This suggests that the genetic composition of the artificial selection population converged due to the effect of artificial selection, whereas in the control experimental population, the differentiation proceeded randomly through on generations.

In addition, Fst was determined for each gene between the artificial selection population and the control experimental population in the 31 generation, and genes with relatively large differentiation between the artificial selection population and the control experimental population were identified. As a result, it was estimated that 60 genes with a large degree of differentiation between the artificial selection population and the control experimental population on average were strongly affected by artificial selection. As a result of identifying such genes in each artificial selection population, 110 genes were estimated as genes affected by artificial selection in common in 5 artificial selection populations. On the other hand, when the same procedure was performed only in the control experimental population, no highly differentiated genes were found in the five control populations. Statistical analysis of these results showed that in the artificial selection population, there were significantly more genes with allele frequencies common to the five populations. This suggests that the effect of artificial selection tends to extend to the same gene in five populations. Among 60 genes that were strongly affected by artificial selection and 110 genes that were commonly affected by selection in 5 artificial selection populations, 6 genes that were involved in the process of fatty acid biosynthesis suggested in previous studies were identified. Of these, ELOVL, CG31523, and CG31522 are genes involved in the fatty acid elongation pathway, and these genes are thought to have the effect of reducing C16 fatty acids present in the cell membrane. On the other hand, an increase in C16 fatty acids in the cell membrane has been shown to improve cold tolerance in D. albomicans. Therefore, it is possible that the fatty acid elongation genes identified in this study have mutations that reduce the expression level, or artificial selection may have affected the expression level control regions surrounding these genes.

1

目次

序論 ・・・

2

4

14

18

23

24

25

表 ・・・

30

図 ・・・

40

付表 ・・・

59

2

序論

地球上の生物は、その進化の過程で様々な環境に適応するために必要な形質を獲得 しており、自然選択は適応形質の獲得プロセスに大きな役割を果たしている(Darwin 1859)。生物の進化は常に長い時間をかけて起きるとは限らず、短期間で急速におきる 場合がある。その一例として、19世後半にイギリスで起こったオオシモフリエダシャ クの工業暗化があり、数十年で98%の個体が暗化したことが知られている(Kettlewell 1955)。このような急速な進化は、地理的分布の急速な拡大としても観察されることが ある。

テングショウジョウバエ亜群に属するアカショウジョウバエは、元来東南アジアの 熱帯地域に分布していた(Kitagawa et al. 1982)。しかし1980年代に急速に分布域を拡大 し、現在、温帯である西日本でも生息が確認されている(図1, Fujino et al. 2006)。変温 動物の生理状態は気温の変化による影響を受けやすいため、昆虫が低温環境に適応す るためには低温耐性の獲得が必要である(Lee and Denlinger 2010)。実際に、西日本のア カショウジョウバエ集団は東南アジアの熱帯地域の集団よりも低温耐性が高いことが 知られている(Isobe et al. 2013)。この西日本のアカショウジョウバエ集団は、複数の遺 伝子を用いたアロザイム解析により台湾の集団と近縁であり、台湾のアカショウジョ ウバエの一部が西日本に移住したと考えられている(図2, Ohsako et al. 1994)。このこと から、アカショウジョウバエが台湾から西日本へ移住する際に、低温耐性が向上する 急速な進化が起こったことが予想される。

低温耐性の向上の大きな要因として、低温順化が知られている(Salt 1961)。アカショ ウジョウバエの場合、卵から常時25℃で生育した成虫を20℃に数日間置くと1℃に十 数時間置いた後の生存率が大きく向上することが分かっている(Isobe et al. 2013)。そこ で、先行研究では、アカショウジョウバエの複数系統を用いたトランスクリプトーム 解析により、低温順化により発現が変動する遺伝子を調べてみたところ、系統間で大

3

きく異なることがわかった(図3, Kimura 2018 修士論文)。このことは、低温耐性の向 上に寄与する遺伝子セットは特定のものに限られず、複数存在している可能性を示唆 する。

一方、生物の急速な進化を説明するモデルとして、集団中にすでに多型として存在 している複数の適応的な対立遺伝子が同時に自然選択を受けることによって起きる soft selective sweepsが、知られている(Messer & Petrov 2013)。西日本に移住したアカシ ョウジョウバエの台湾集団中にも、低温耐性に寄与する複数の遺伝子セットが存在 し、それらが急速な分布域拡大に寄与した可能性がある。

そこで本研究では、台湾のアカショウジョウバエ集団に低温耐性を向上させる複数 の遺伝子セットが存在すると仮定し、これらの遺伝子セットに対して同時に自然選択 が働いた場合、特定の遺伝子セットが常に固定するとは限らず、どの遺伝子セットが 固定するかは機会的に決まると考え、この仮説を検証することを目的とした。

そのためのアプローチとして、台湾のショウジョウバエ系統から複数の実験集団を 構築して低温耐性による人為選択を行う方法を用いた。具体的には、台湾で採集され た250系統のアカショウジョウバエ単一雌系統から5実験集団を構築し、毎世代1℃

での低温耐性による人為選択を行い、実際に低温耐性が強化されるか検証し、人為選 択の効果がみられた遺伝子群が人為選択集団間で共通しているか、あるいは異なって いるかを調べた。複数の人為選択集団間で選択が働いた遺伝子セットが異なっていた 場合、台湾の集団に低温耐性を向上させる複数の遺伝子セットが存在している可能性 があることが示唆される。一方で、複数の人為選択集団で共通した遺伝子セットに対 して人為選択が働いた場合、その遺伝子セットに含まれる遺伝子は低温耐性の向上に 関する重要な遺伝子を含むと考えられるため、それらの遺伝子を特定することで原因 遺伝子の解明に寄与できることが期待される。

4 材料と方法 ショウジョウバエ系統

アカショウジョウバエ（Drosophila albomicans）

テングショウジョウバエ亜群 （Drosophila nasuta subgroup） に属するアカショウジョ ウバエの 250 単一雌由来系統を用いた。これらの系統は、2016年に台湾の桃園市復興 區で採取された。

実験集団の作製

アカショウジョウバエ250単一雌系統各系統から、オス、メス各2個体を取り出し、合 計1000個体の実験集団を構築し、集団内の遺伝子頻度を安定化させるため6世代継代 した。実験集団は30×16×12 cm（L×W×H）のポリプロピレン製容器に750～800 ml のスタンダード培地（エビオス32 g、トウモロコシ72 g、グルコース80 g、プロピオン

酸2.4 ml、ボーキニン7 ml、寒天5.6 g、水800 ml）を入れたケージ培地に入れ、25℃、

12時間明暗で飼育した。実験集団から、対照実験集団5集団、人為選択実験集団5 集 団、合計10 集団を実験集団と同様の条件で構築した。その際、個体数を数える方法と しては、あらかじめ100個体の重量を測定した結果を基に、2 mgを1個体として重量 を測定することによって概算する方法を用いた。対照実験集団の各集団を、CP1(Control

Population 1)、CP2、CP3、CP4、CP5 とした。人為選択集団の各集団を SP1(Selection

Population 1)、SP2、SP3、SP4、SP5とした。

継代方法と低温耐性の測定 対照実験集団

集団ごとに、約1000個体の親バエをケージ培地に入れ、この日を1世代のサイクル における1日目とした。25℃の恒温室で3日間産卵させ、4日目にケージから親バエを

5

取り出し、液体窒素で凍らせた後、−80℃の冷凍庫で保管した。産卵させたケージは7~9

日間 25℃の恒温室に置いた。11 日目にケージ内の新生成虫を二酸化炭素麻酔後に取り

出し、約3000個体を約1500個体ずつ100 mlのスタンダード培地の入った500 ml角型

ボトル（Corning 431432）2本に入れた。12日目、13日目にも同様の手順で、約1500個 体ずつ11日目に使用したボトル2本内に追加して新生成虫を入れた。成虫を入れたボ

トルは20℃のインキュベーターに5～7日間入れた。18日目に、一方のボトル内の成虫

のうち約2000個体を後述する低温耐性実験に用い、もう一方のボトル内の成虫を50 ml のスタンダード培地の入った新しいボトルに移し、20℃のインキュベーターに4日間入 れた。22日目(次世代のサイクルにおける1日目)に、ボトル内から成虫約1000個体を 次世代の親として新たなケージ培地に入れた。

人為選択集団

集団ごとに、約1000個体の親バエをケージ培地に入れ、この日を1世代のサイクル における1日目とした。25℃の恒温室で3日間産卵させ、4日目にケージから親バエを 取り出し、液体窒素で凍らせた後、−80℃の冷凍庫で保管した。産卵させたケージは7~9

日間 25℃の恒温室に置いた。11 日目にケージ内の新生成虫を二酸化炭素麻酔後に取り

出し、約4500個体を100 mlのスタンダード培地の入った500 ml角型ボトルに入れた。

12日目、13日目にも同様の手順で、成虫約4500個体を新たなボトル培地に入れ、集団 ごとに合計 3 本のボトル培地を作製した。成虫を入れたボトル培地は 20℃のインキュ ベーターに5～7日間入れた。18日目に、3本の各ボトルから2000個体ずつを後述する 低温耐性実験に用いた。22日目(次世代のサイクルにおける1日目)に、低温耐性実験で 生存した成虫の内、最も長い時間 1℃に晒したボトルから、約 1000 個体を次世代の親 として新たなケージ培地に入れた。そのボトル培地内の生残った成虫が約 1000匹に満 たなかった場合、次に長い時間1℃に晒したボトル培地から不足分の成虫を取り出し追

6 加した。

低温耐性実験 1℃への暴露

50 mlのスタンダード培地の入ったボトルに成虫約1000個体を入れ、断熱材を底に敷

いたステンレス製の缶の中に横向きで5本並べ、ボトルの底側から温度のムラを低減す るためにファン（直径5 cm、5 V）を設置した。ボトルの入ったアルミ缶を、インキュ ベーターの中央に設置し、インキュベーターのプログラム運転を開始した。プログラム 運転では、20℃で1時間、1℃付近に低下するのに約30分、1℃で16～26時間、20℃に 上昇するのに約30分、20℃で2日間の行程を自動で行った。その際、インキュベータ ー内の温度が1℃付近で安定したら、センサーの表示温度が1℃になるように、手動で キャリブレーションを行った。本実験では、インキュベーター内の温度が 1±0.5 ℃に なってから、温度が20 ℃に戻り始めるまでの時間を1 ℃に晒した時間とした。1 ℃に 晒した時間について、対照実験集団では、1世代目、5世代目、13～31世代目では22時 間、4世代目、11世代目では20時間、7世代目、10世代目では18時間、8世代目、9 世代目では16時間とした。人為選択集団では、1世代目は18、20、22、24時間、2、6、

11、12世代目は18、20、22時間、3世代目は18時間、4、7、10世代目は16、18、20

時間、5世代目、13～24世代目は20、22、24時間、8、9世代目は14、16、18時間、25

～31世代目は22、24、26時間とした。各世代において、対照実験集団で1 ℃に晒した

時間を用いて対照実験集団と人為選択集団間の生存率を比較した。

生存率の測定

低温処理後、インキュベーター内の温度が20 ℃に戻ってから1日後に、全てのボト ルを縦向きにして20 ℃で1日間静置した。その間、低温処理によって死亡したハエは

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培地に付着した。翌日、ボトル内の生存成虫を50 mlのスタンダード培地の入った新た なボトル培地に移すことにより、元のボトル培地に付着した死体を取り除いた。生存成 虫の入ったボトル培地は縦向きで1日間置いた。低温処理後の合計3日間を、生存成虫 のリカバリーとした。リカバリーが終了したボトル内の成虫を二酸化炭素麻酔後に取り 出し、重量を測定し、生存率を計算した。この際、低温耐性実験の前後により1個体あ たりの体重が変化するため、予備的実験で測定した値（0.898）を用いて補正した。

ショウジョウバエ成虫ＤＮＡ粗抽出

0世代目の実験集団1集団および11世代目、21世代目、31世代目の対照実験集団と 人為選択集団の各5集団ずつを用い、−80℃で冷凍保存されていたショウジョウバエ成 虫1000匹（約2 g）を氷上、乳鉢でHomogenizing Buffer (100 mM Tris-EDTA pH7.5, 60

mM NaCl) 10 mlを加えよくすりつぶした。Homogenizing Buffer 10 mlを、乳棒を洗浄し

ながら加え、四つ折りのガーゼで絞り、絞り汁を50 mlファルコンチューブに回収した。

Homogenizing Buffer 20 mlを10 mlずつ2回に分けて乳鉢、ガーゼを洗浄しつつ絞り、

絞り汁を 50ml ファルコンチューブに加えた。8,000g、5 分間遠心し、上清を捨てた。

Lysis Buffer (4M Urea, 100mM Tris-EDTA pH7.5, 60mM NaCl) 4.5 mlで沈殿を懸濁し、15 mlファルコンチューブに移した。10% SDS 0.5 ml、20 mg/ml proteinase K水溶液 50µlを 加え、ボルテックスした。ホモジネートを55℃、１時間インキュベートした後、氷冷し た。ホモジネートにTE飽和フェノール5 mlを加え、よく混合した。8,000 g、5分間遠 心し、上層を新しい15 mlファルコンチューブに回収した。フェノールによる抽出をも う１回繰り返した後、TE飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（25:24:1）

5 mlを加え、よく混合した。8,000 g、5分間遠心し、上層を新しい15 mlファルコンチ ューブに回収した。DWで4.5 mlにメスアップし、3M 酢酸ナトリウム（pH5.2）0.5 ml を加えた。イソプロパノール5 mlを加えて混合し、室温で 15 分間静置した。DNAの

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沈殿をピペットチップですくい、1.5 ml チューブに移した。DNAの沈殿を 70%エタノ

ール1 mlで2回洗浄した後、風乾し、TE 1 mlに約24時間かけて溶解した。得られた

DNA粗抽出液の中、100 µlを用い、High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche)を用 いて精製し、ゲノムDNA試料とした。

Pool-seqによる集団ゲノム配列決定

0世代目の実験集団および11世代目、21世代目、31世代目の対照実験集団と人為選択 集団の各5 集団ずつ合計31集団のゲノム DNA試料を専門業者（マクロジェン・ジャ パン）に委託し、Illumina HiSeq X Ten（90 Gbスケール）またはNovaSeq6000（100 Gb スケール）を用いて、集団ごとに配列決定（Pool-seq）を行った。

配列データ解析

Pool-seqリードのクオリティコントロールトリミング

Pool-seqによって得られた各リード（断片配列）についてbase quality が20未満の末

端をfastp プログラム(Chen et al. 2018)を用いて削除（トリミング）し、解析時間短縮の

ため、データの先頭から得られた全リードの約40%にあたる340,000,000 リードを選択 し、一定化した。

マッピングとマッピング・クオリティのコントロール

トリミング後の各リードを、BWAプログラム(Li & Durbin, 2009)を用いてNG3 系統 のリファレンスゲノム配列(Nozawa 未発表)に対して相同部位の検索（マッピング）を 行い、samファイルとして出力した後、Samtoolsプログラム(Li et al. 2009)を用いてbam ファイルに変換した。また、Picardプログラム(http://broadinstitute.github.io/picard/)を用い て、重複したリードの除去を行った。その後、Samtoolsプログラム(Li et al. 2009)を用い

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て、マッピング・クオリティ値20未満のリードの除去後、mpileupファイルへの変換を 行った。PoPoolationプログラム(Kofler, Orozco-terWengel, et al. 2011)を用いて、挿入／欠 失（インデル）の除去、各サイトにおけるカバレッジを250以下にするためのサブサン プリングを行った。

タンパクコード領域の配列データ（CDS）は、Popoolation2 (Kofler, Pandey, et al. 2011) を用いて、抽出した。

塩基多様度(π)とFSTの計算

集団ごとの配列データを用い、塩基多様度(π)(M. Nei & Li, 1979)をPopoolationプロ グラムを用いて10 kbセグメントごと、およびCDS領域ごとに計算した。また、アリル 頻度による集団間のFSTをPopoolation2プログラム(Kofler, Pandey, et al. 2011)を用いての 計算した。各プログラムによる計算のためのコマンドを付表1に示した。

近隣結合法による集団間系統樹の推定

FSTはHT(全集団における期待ヘテロ結合度)と、HS(各分集団における期待ヘテロ結合

度)から、 (HT-HS) / HT で求められる（Nei 1987）。ここでHTは人為選択の効果により遺 伝子ごとに異なるが、HSは人為選択集団、対照実験集団ともに集団サイズを一定に保っ たことから一定であると期待できる。そこで、Popoolation2 プログラムによって遺伝子 ごとに得られたFSTの値からFSTの遺伝子平均を計算する際、以下の等式を用いた。

1

1 − F_ST=H_T

H_S (1) 1

1 − F̅̅̅̅̅_ST=H̅̅̅̅_T H_S

̅̅̅̅= (H_T H_S)

̅̅̅̅̅̅̅

= ( 1 1 − F_ST)

̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅

(2)

10 F_ST

̅̅̅̅̅ = 1 − 1

( 1

1 − F_ST)

̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ (3)

ここでF̅̅̅̅̅_STは遺伝子ごとのFSTの平均値を示す。

このF̅̅̅̅̅の値を用いて、集団間の関係を示す系統樹を近隣結合法(Saito and Nei, 1987)によ_ST って推定した。近隣結合法の計算にはMEGA7 (Kumar et al. 2016)を用いた。

簡易化した合意系統樹の枝長の推定

近隣結合法によって遺伝子ごとに推定した二分岐系統樹は遺伝子ごとに樹形が同一 にはならないため、集団の分化の程度を遺伝子間で共通の尺度で測ることができない。

そこで、内部枝は人為選択集団と対照実験集団を分ける1本だけに簡易化した多分岐の 合意系統樹(図 5 A)について、各人為選択集団と各対照実験集団につながる外部枝と人 為選択集団と対照実験集団の間の内部枝の長さを以下の式で推定した。Dijは集団iとj 間のFSTとする。i = 1, 2, 3, 4 or 5の場合は対照実験集団、i = 6, 7, 8, 9, or 10の場合は人 為選択集団を示す。対照実験集団の外部枝の平均枝長(bC)、人為選択集団の外部枝の平 均枝長(bS)、内部枝長(bXY)、各集団の外部枝(bi)を以下の等式を用いて計算した。

𝑏_𝐶 = 1

20 ∑ 𝐷_𝑖𝑗

𝑖<6,𝑖<𝑗

₍₄₎

𝑏_𝑆= 1

20 ∑ 𝐷_𝑖𝑗

5<𝑖,𝑖<𝑗

₍₅₎

𝑏_𝑋𝑌= 1

25(∑ ∑ 𝐷_𝑖𝑗

𝑗>5 𝑖<6

− 25𝑏_𝑐− 25𝑏_𝑆) (6)

1 ≤ 𝑖 ≤ 5の場合 𝑏_𝑖 =1

5(∑ 𝐷_𝑖𝑗

10

𝑗=6

− 5𝑏_𝑆− 5𝑏_𝑋𝑌) ₍₇₎

6 ≤ 𝑖 ≤ 10 の場合 _{𝑏𝑖 =}¹

5(∑ 𝐷_𝑖𝑗

5

𝑗=1

− 5𝑏_𝑆− 5𝑏_𝑋𝑌) (8)

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人為選択集団で共通して選択がはたらいた遺伝子の同定

人為選択集団に共通して人為選択がはたらいた遺伝子の同定を以下の方法で行った。

① 相対的な内部枝長とπ比を用いた同定

マッピング、およびクオリティーコントロールを行った後、CDSの中でマップされ たリード数（カバレッジ）を塩基座ごとに数え、31世代目における全実験集団で30

～250のカバレッジがあるサイトが50パーセント以上あった4,410遺伝子のみを用 い、人為選択集団で共通して人為選択がはたらいた遺伝子を探索した。ここで、十 分なカバレッジを持つサイトが 50 パーセントの遺伝子のみを用いた理由は、カバ レッジが極端に低いサイトでは塩基多様度(π)の計算時に分散が大きくなり、その ような塩基が大部分を占める遺伝子では塩基多様度(π)の正確な評価ができないた めである。また、十分なカバレッジを持つサイトが 50 パーセント以上ある遺伝で は、このカバレッジを満たさないサイトについても塩基多様度(π)の計算に使用し た。

人為選択がはたらいた遺伝子とするための基準として、人為選択集団と対照実験 集団の分化の程度を系統樹上で両集団間の内部枝の長さを全ての枝長の総和で割っ た内部枝長比（Interior branch ratio: IBR）と、人為選択集団の平均塩基多様度（π）

に対する対照実験集団の平均塩基多様度の比（π比）の二つの基準を用い、二つの 基準に共通して上位10%であった遺伝子を候補遺伝子とした。

② 各人為選択集団で対照実験集団と分化の程度が相対的に大きかった遺伝子の同定 とその共通部分の抽出

人為選択集団ごとに対照実験集団との分化の程度が大きかった遺伝子を同定し、そ れらの遺伝子の中で、全人為選択集団間で共通する遺伝子を調べた。同様に、比較対 象として、特定の対照実験集団と他の対照実験集団との間で分化の程度が大きかった

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遺伝子を同定し、それらの遺伝子の内、全対照集団間で共通する遺伝子を調べた。

31世代目における配列データの中からカバレッジが30～250である塩基座が50％以

上あった4,410遺伝子を用いて、人為選択集団と5対照実験集団で星形系統樹（図4 B）

に基づき、各枝長を計算した。

各遺伝子において注目する人為選択集団の集団をi (i = 1, 2, 3, 4, or 5)、対照実験集団 の集団をj (j = 6, 7, 8, 9, and 10)とし、Dijを集団iとj間のFSTとすると、ある星形系統樹 における、人為選択集団iの外部枝(bsi)、対照実験集団jの外部枝(bcj)は、それぞれ以下 の等式(9)、(10)を用いて計算した。また、対照実験集団の外部枝の平均枝長(bC)は、等式 (4)で計算した。

𝑏𝑠_𝑖 =1

5(∑ 𝐷_𝑖𝑗

10

𝑗=6

− 5𝑏_𝐶) ₍₉₎

𝑏𝑐_𝑗=1

5(∑ 𝐷_𝑗𝑘

𝑗<𝑘

+ 𝐷_𝑖𝑗− 4𝑏_𝑐− 𝑏_𝑖) ₍₁₀₎

全枝長に対するbiの比(bsi ratio)を、特定の人為選択集団と対照実験集団との相対的な 分化の程度を表す値として以下の式で求めた。

𝑏𝑠_𝑖 𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜 = 𝑏𝑠_𝑖

∑¹⁰_𝑗=6𝑏𝑐_𝑗 + 𝑏𝑠_𝑖 (11)

また、対照集団のみを用いた星形系統樹に基づいた対照実験集団jの外部枝長(bcj)は、

以下の等式を用いて計算した。また、全枝長に対するbcjの比(bci ratio)を、対照実験集 団jとその他の対照実験集団kとの相対的な分化の程度を表す値として、以下の式で求 めた。

𝑏𝑐_𝑗=1

4(∑ 𝐷_𝑗𝑘

𝑗≠𝑘

− 4𝑏_𝑐) ₍₁₂₎

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対照実験集団のみを用いた星形系統樹の全枝長に対する対照実験集団 j の枝長(bcj)の 比の値を、対照実験集団jと他の対照実験集団との相対的な分化の程度を表す値(bcj ratio) として用いた。全人為選択集団における遺伝子ごとのbsi raitoの平均を計算し、その値

が0.029以上の遺伝子は434であり、全4410遺伝子の9.8%であった。これは、前の相

対的な内部枝長とπ比を用いた同定で用いたそれぞれの基準である上位 10%に近い値 であったため、この値を参考にして、bsi raitoが0.03より大きい遺伝子を人為選択集団 i で人為選択がはたらいた遺伝子とし、全人為選択間で共通した遺伝子を抽出した。ま た、5対照実験集団のみを用いた星形系統樹では人為選択集団と5対照実験集団を用い た星形系統樹よりも全枝長が 1 人為集団の外部枝長分短くなることから、補正値 1.2

(6/5)を用いて補正基準値を0.036とした。bcj ratioが0.036より大きい遺伝子を対照実験

集団jで他の対照実験集団と分化の程度が大きい遺伝子とし、全対照集団間で共通した 遺伝子を抽出した。

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結果

人為選択集団と対照実験集団の各世代における低温耐性の比較

人為選択集団に対する選択の効果を検証するため、人為選択集団と対照実験集団の 各世代における低温処理後の生存率を比較した(図 5)。各世代において、人為選択集 団の生存率と対照実験集団の生存率の間で平均値の差をt検定によって比較した結 果、人為選択集団では9世代目に有意水準5%で生存率が高く、13世代目以降では18

世代目で5%、13代目、16世代目、17世代目で1%、その他31世代目までの全ての世

代で0.1%の水準で有意に生存率が高かった。31世代目における人為選択集団と対照実

験集団の平均生存率は、それぞれ72.7%、36.7%でその差は36％であった。また、31 世代目の人為選択集団の平均生存率は13世代目よりも有意に高くなったことから(t- test P < 0.005)、対照実験集団に比較して生存率に有意な差が出た後も低温耐性が向上 し続けたことが分かる。なお、2、3、6、12、28世代目に関しては、恒温装置のプロ グラムが上手く作動しなかったり、多くのハエがエサに付着して死んでしまったりな どの実験操作上の不具合によって、低温耐性の測定に必要な成虫個体が十分に得られ ずデータが得られなかった。

次世代シーケンシングによる塩基配列データ

Pool-seqを行った結果、全試料における全塩基数(Total read bases)の平均は

129,694,559,178、得られたリード数(Number of raw reads)の平均は858,904,365、トリミ ング後のリード数(Number of reads after trimming)の平均は322,527,606、マッピングと クオリティコントロール後のリード数(Number of reads after mapping and quality control) の平均は199,365,245であった(表 1)。

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各世代における塩基多様度(π)の人為選択集団の平均と対照実験集団の平均

0、11、21、31世代目において、塩基座当りのリード数が30から250の範囲になっ

た塩基座がコード領域の50％以上あった4,410遺伝子について人為選択集団と対照実 験集団の塩基多様度（π）を計算した(表 2)。0世代目の実験前集団における塩基多様 度(π)の平均は0.0119、11世代目における対照実験集団の塩基多様度(π)の平均は

0.0113、人為選択集団の平均は0.0113、21世代目における対照実験集団の塩基多様度

(π)の平均は0.0114、人為選択集団の平均は0.0115、31世代目における対照実験集団

の塩基多様度(π)の平均は0.0130、人為選択集団の平均は0.0130であった。各世代に おける人為選択集団と対照実験集団の塩基多様度(π)の平均値を比較した結果、全て の世代において、有意な差はみられなかった。

また、各世代の各集団における全ゲノム領域で10 kbセグメントごとに計算した塩 基多様度(π)の値を、10 kbセグメントのゲノム上ポジションに対してプロットした(図 5)。ここでは、いずれの世代においても人為選択集団と対照実験集団との間で顕著な パターンの差は見られなかった。

近隣結合法を用いた系統関係の推定

複数の人為選択集団の標的遺伝子群に対し人為選択がどのように働いたかを検証す るために、11、21、31世代目における集団全体から抽出したDNAの塩基配列データ を用い、全12,586遺伝子ごとに集団間のFstを計算し、その平均値を用いて近隣結合 法により集団間系統樹を推定した(図 6)。全ての世代において、人為選択集団と対照 実験集団がそれぞれ単系統にまとまり、分離した。すなわち、人為選択集団と対照実 験集団間には内部枝が生じ、その長さは世代を経るごとに長くなった。一方、人為選 択集団間、対照実験集団間にも内部枝があるが、31世代目においては、人為選択集団 内、対照実験集団内の内部枝は人為選択集団と対照実験集団間の内部枝に比べてかなり

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短く、人為選択集団内、対照実験集団内でそれぞれ内部枝長を合計した値（それぞれ

0.00348、0.00333）は人為選択集団と対照実験集団間の内部枝長（0.00520）には至らな

い。

簡素化した合意樹形に基づく枝長の解析

人為選択集団において人為選択の標的となった遺伝子群を調べるため、人為選択集 団内、対照実験集団内の内部枝を無くして共通する人為選択集団と対照実験集団間の 内部枝と各集団につながる外部枝だけに簡素化した合意系統樹（consensus tree）を用 い、それぞれの枝の長さを12,586遺伝子それぞれについて計算した(図 7)。

対照実験集団の外部枝長、人為選択集団と対照実験間の内部枝長は、11、21、31世 代目の間で世代を経るごとに大きくなった一方、人為選択集団の外部枝長は、11世代 から21世代目では大きくなったが、21世代目から31世代目では小さくなった(図 8)。人為選択集団間の内部枝長と対照実験集団間の内部枝長を比較した結果、全世代 において人為選択集団間の内部枝長の方が統計的に有意に小さかった(図 9)。

人為選択集団で共通して人為選択が働いた遺伝子の同定

③ 相対的な内部枝長とπ比を用いた同定

30～250のカバレッジをもつ塩基座が50パーセント以上である4,410遺伝子を用

い、人為選択集団と対照実験集団の分化の程度を系統樹上で両集団間の内部枝の長 さを全ての枝長の総和で割った内部枝長比（Interior branch ratio: IBR）と、人為選択 集団の平均塩基多様度（π）に対する対照実験集団の平均塩基多様度の比（π比）

を用いて評価し、人為選択集団で共通して選択を受けたと考えられる 78 遺伝子を 同定した(図 10)。これらの 78 遺伝子について、キイロショウジョウバエの相同配 列を用いてFlybaseIDを検索したところ、60遺伝子が同定された (表 3)。それぞれ

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の基準で値が大きかった上位10％の遺伝子を抽出していることから、二つの基準が 独立だった場合偶然に同時に基準を満たす遺伝子は 44,100×0.1×0.1 = 44.1 で、実 際に観察された78は統計的に有意に大きい(カイ2乗検定 P < 0.005)。このことは、

同定された78遺伝子が選択の効果を受けていることを示唆する。また、これらの遺 伝子はX染色体以外の染色体中の広範囲の領域に分布していた。X染色体は他の染 色体と比較して有意に同定された遺伝子が少なかった（カイ2乗検定 P < 0.005）。

また、同定された60遺伝子のうち、脂肪酸に関連する遺伝子を探索した結果、4遺 伝子が見つかった(表 4)。

④ 各人為選択集団で対照実験集団と分化の程度が相対的に大きかった遺伝子の同定 とその共通部分の抽出

マップされたリード数が30から250の範囲にある塩基座が50％以上であった4,410 遺伝子を用いて、人為選択集団ごとに5対照実験集団との間で31世代目における分 化の程度が相対的に大きい遺伝子を同定し、ベン図で示した(図 11 A)。また、同様に 対照実験集団ごとにその他の対照実験集団との間の分化の程度が相対的に大きい遺伝 子を同定し、各対照実験集団で同定された遺伝子数をベン図で示した(図 11 B)。複数 の対照実験集団で共通して分化の程度が相対的に大きかった遺伝子は少なく、全ての 人為選択集団で共通して人為選択が働いた遺伝子はそれらよりも有意に多かった(カイ 2乗検定 P<0.0001)。このことから、人為選択の効果を受けた遺伝子は、複数の人為選 択集団で共通していたことが示唆される。すなわち、同定された遺伝子の内、5人為 選択集団で共通していた135遺伝子は、全ての人為選択集団で共通して人為選択が働 いた遺伝子と考えられる。それらをキイロショウジョウバエの相同配列を用いて

FlybaseIDを検索したところ、110遺伝子が得られた(表 5)。また、同定された110

遺伝子の内、脂肪酸に関連する3遺伝子が見つかった(表 6)。

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考察

台湾由来アカショウジョウバエ実験集団に対する人為選択の効果

アカショウジョウバエの1980 年代半ば以降の分布域の拡大の背景には、自然選択に よる低温耐性の獲得があると考えられている(Isobe et al. 2013)。本研究において、台湾 の系統を用いて構築した実験集団に対し低温耐性による人為選択を行った結果、13 世 代目以降、低温耐性が実験前に比較して有意に高くなったことが分かった（図 4）。ま た、Fstを用いた実験集団の系統関係から（図6）、人為選択集団と対照実験集団の間の 内部枝は世代を経るごとに長くなった。このことは、人為選択が人為選択集団の遺伝的 構成を変化させ、それにより人為選択集団の低温耐性を向上させたことを示唆する。台 湾由来の実験集団が人為選択により低温耐性が向上したことは、実際に台湾集団が日本 へと分布域を拡大する際の自然選択による低温耐性の獲得を再現し得ることを示唆す る。

人為選択集団における遺伝的多様性

各世代における人為選択集団と対照実験集団の塩基多様度(π)を遺伝子ごとに求め て平均値を比較した結果、いずれの世代においても人為選択集団と対照実験集団の間に 有意な差は見られなかった。このことから、人為選択集団において人為選択による集団 サイズの減少が起こらなかったことが示唆される。

限定された遺伝子に対して方向性選択がはたらいた場合、標的遺伝子の周囲も含めて 塩基多様度(π)が著しく低下することが知られており、この現象は“selective sweep”と 呼ばれている(Palaisa et al. 2004)。一方で、複数の遺伝子に対してsweepがはたらいた場 合、限定された遺伝子に対する掃引よりも多様度が減少しないことも知られている

(Przeworski et al. 2005)と呼ばれている。本研究では対照実験集団と人為選択集団間で塩基

多様度(π)のパターンに顕著な差は見られなかった(図6)。このことは、本研究における

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人為選択は特定の限定された遺伝子に対してのみはたらいたのではなく、複数の標的遺 伝子に対して同時にはたらいたことを示唆する。すなわち、すでに台湾集団中に存在し ていた変異(standing genetic variation)に対する“Soft sweep”(Hermisson and Pennings 2005) によるものであると考えられる。“Soft sweep”が台湾のstanding genetic variationに対しは たらき、西日本への移住を可能にしたと仮定すると、西日本の集団では低温耐性に関与 する複数の遺伝子の対立遺伝子頻度が台湾の集団よりも高いことが予想される。よって、

本研究によって同定された人為選択に関与すると考えられる遺伝子(表 3, 5)の対立遺伝 子頻度を台湾集団、西日本集団間で比較することで、実際に“Soft sweep”が台湾集団の 低温耐性に寄与する複数の遺伝子に対しはたらいたか検証することができると考える。

人為選択集団に対してはたらいた人為選択モデルの推定

先行研究では、アカショウジョウバエの複数系統を用いたトランスクリプトーム解析 により、低温順化により発現が変動する遺伝子を調べてみたところ、系統間で大きく異 なることがわかった(図3, Kimura 2018 修士論文)。このことは、低温耐性の向上に寄与 する遺伝子セットは特定のものに限られず、複数存在している可能性を示唆する。

複数の人為選択集団に対し人為選択が同じ遺伝子セットに対してはたらくのか、それ とも異なる遺伝子セットに対してはたらくのかを検証するために、それらの人為選択が はたらいたときに実験集団の系統樹がどのような樹形を示すかをモデルとして示す。

まず、人為選択集団に対して人為選択がはたらかなった場合、同じ集団から構築され た各実験集団は世代を経るごとに遺伝的浮動の効果によりそれぞれ分化し、対照実験集 団と人為選択集団の枝長は同程度になることが期待される(図 13 A)。次に、全ての人為 選択集団で共通する遺伝子セットに人為選択がはたらいた場合、対照実験集団と人為選 択集団が単系統でまとまり、人為選択の効果によって内部枝が長くなることが期待され る。また、共通の遺伝子セットに人為選択がはたらくことにより遺伝的浮動による人為