外 陰 部 所 見 が 正 常 な 男 子 例 に お け る
Human
Papillomavirus
DNAの
検 出
札幌 医科大学泌尿器科学教室
岩 澤 晶 彦 熊 本 悦 明 広 瀬 崇 興 恒 川 琢 司
(平成2年2月19日 受付) (平成2年3月28日 受理)
Key words : normal genitalia, human papillomavirus, DNA, hybridization
要 旨
一 般 正 常 男 子 群 の 内 外 性 器 に お け るHuman papillomavirus (HPV)のscreeningを 行 う場 合,外 陰
部 所 見 が 正 常 な す べ て の 症 例 か らのsamplingは 不 可 能 に 近 い.そ こでsampling対 象 群 と して,泌 尿 器
科 外 来 で 症 例 数 が 比 較 的 多 い 慢 性 前 立 腺 炎 症 例 を 選 び,Vira Type TM (Life Technologies Inc.)を 用
い てHPVDNAの 検 出 を試 み た. 177例 の 亀 頭 ・冠 状 溝smearに お け るHPV陽 性 率 は3.4%と 低 頻 度 で あ った が,臨 床 所 見 は な く,無 症 候 性 感 染 と考 え られ た.ま た,尿 道smearを 検 討 し得 た86例 で は,HPVは 検 出 さ れ な か っ た. HPV陽 性 例 に つ い て,数 週 間 後 に 亀 頭 ・冠 状 溝smearと 尿 道smearに お け るHPVの 再 検 索 を 行 っ た.検 査 可 能 で あ った5症 例 に お い て,HPVは 亀 頭 ・冠 状 溝 お よ び 尿 道 と もに 検 出 さ れ ず,自 然 消 失 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 序 文 Human Papillomavirus (以 下HPVと 略 す) は,性 器 癌 の 発 生 に 関 与 す る ウ イ ル ス と し て 注 目 さ れ て い る が,正 常 男 子 の 亀 頭 ・冠 状 溝 お よ び 正 常 女 子 の 子 宮 頸 管 に もHVPが 検 出 さ れ た 報 告1)2) が あ り,無 症 候 性 感 染 の 存 在 が 考 え ら れ て い る. し か し な が ら,HPVの 検 出 に お い て,Southern
blot hybridization法3)お よ びin situ
hybridiza-tion法4)は 操 作 が 煩 雑 で 熟 練 を 要 し,結 果 が 出 る
ま で 時 間 が か か り,ま た 一 度 に 多 数 の 検 体 を 処 理
で き な い た めscreeningに は 不 適 で あ る.と こ ろ
が 近 年,子 宮 頸 部 のHPV感 染 に 対 す る 簡 易 的 検
査 法 で あ るVira Type TMお よ びVira Pap TM (Life
Technologies Inc.)の 報 告 が 散 見 さ れ る5)6). そ こ で 我 々 は,正 常 男 子 群 の 亀 頭 ・冠 状 溝 と 尿 道 に お け るHPVのscreeningを 行 うた め,Vira Type TMを 用 い てHPVの 検 出 お よ び そ のDNA 型 を 同 定 し た. 対 象 と方 法 外 陰 部 所 見 が 尖 圭 コ ン ジ ロ ー マ な ど の 病 変 を 認 め な い 正 常 な 男 子 群 の 代 表 と し て,177例 の 慢 性 前 立 腺 炎 症 例 を 対 象 と し た.な お,STD (sexually trasmitted diseases)関 連 症 例 は,HPVの 感 染 機 会 も 多 い と 考 え ら れ る た め,一 般 正 常 男 子 群 の 代 表 と し て 対 象 に す る に は ふ さ わ し く な い と 判 断 し,今 回 の 対 象 と し な か っ た. 採 取 部 位 と し て,最 初 に 陰 茎 の 亀 頭 ・冠 状 溝 か ら綿 棒 に て 上 皮 細 胞 を 擦 過 し,次 に 尿 道 粘 膜 か ら 同 様 に 採 取 し た.各 々 の 検 体 は,collection tubeに 入 れ,-20℃ 以 下 で 保 存 し た.177例 の 対 象 症 例 の うち 亀 頭 ・冠 状 溝smearと 尿 道smearの 両 者 を 採 取 で き た も の が86例,亀 頭 ・冠 状 溝smearの み 採 取 し た も の が91例 で あ っ た. 別 刷 請求 先 (〒060) 札 幌 市 中央 区 南1条 西16丁 目 札 幌 医科 大 学 泌尿 器 科 学教 室 岩 澤 晶 彦
Table 1 HPV DNA detection procedure of Vira TypeTM
1. Add sample preparation reagent (proteinase) to a collection tube
2. Incubate at 37•Ž for 1 hour
3. Add sample diluent (DNA degeneration) 4. Spot the mixture on a nylon membrane 5. Cover the membrane with the overlay
6. Add prehybridization reagent to the membrane and incubate at 60•Ž for 30 minutes
7. Add hybridization reagent and incubate at 60•Ž for 2 hours
8. Wash the membrane three times
9. Add RNase reagent and incubate at 37•Ž for 15 minutes
10. Wash the membrane three times
11. After baking the membrane, expose it to X-ray film with intensifying screens at -70•Ž
HPVの 検 出 はHPV DNA Typig Kitで あ る
Vira TypeTMを 用 い てDot blot hybridization法
に よ り行 っ た.測 定 方 法 はTable 1に 示 し た プ ロ
ト コ ー ル の 如 く施 行 し た.最 初 に,採 取 し た 検 体
か らDNAを 抽 出 す る た め,検 体 調 整 試 薬 をtube
内 に 加 え る.次 に,抽 出 し た 検 体DNAを ア ル カ リ
溶 液 に 浸 し て1本 鎖 に し た 後,そ の 変 性DNAを
nylon membraneに 濾 過 し,membrane上 に 固 定
す る.Probeのrnembraneに 対 す る 非 特 異 的 吸 着
を お さ え る た め にprehybridizationを 行 い,
HPV DNAと 相 補 的 な32Pに 標 識 さ れ たRNA
Probeとhybridizationを 行 う.そ の
後,hybridi-zationし な か っ たRNA ProbeをRNA ase試 薬
に て 洗 浄 し,最 後 にautoradiographyを 行 い, HPV DNAの 存 在 の 有 無 を 決 定 す る.以 上 の 測 定 方 法 は,時 間 と し て はautoradiographyま で の 数 時 間,autoradiographyの 数 日,ま た 検 体 数 と し て は,一 度 に 数 十 検 体 の 測 定 が 可 能 な た め,比 較 的 短 時 間 に 多 数 の 検 体 を 処 理 す る こ と が で き る .な お,Probe RNAに は,6型 と11型(HPV 6/11型), 16型 と18型(HPV 16/18型),お よ び31型 と33型 と 35型(HPV 31/33/35型)の3種 類 の 混 合Probeを 用 い た. 成 績 正 常 男 子177例 の 亀 頭 ・冠 状 溝smearに お け る HPV陽 性 例 は,6例(3.4%)で あ っ た(Table 2) , そ の 陽 性 例 のDNA型 は,6/11型 が3例(1.7%), 16/18型 が1例(0.6%),31/33/35型 が2例(1 .1%)
で あ っ た.Fig.にHPV6/11型 をProbeと し
てhybr-idizationを 施 行 し たAutoradiographを 示 す .ま
た,尿 道smearを 検 討 し 得 た86例 で は,HPVは 検
Fig. Autoradiograph of dot blot hybridization using Vira TypeTm in glans and sulcus coronarius of penis. The probe was "P-labeled HPV 6/11 RNA. The positive control was in slot A-1 and the negative control was in slot B-1. The subjects in slot B-2 and D-2 were positive for HPV 6/11 DNA.
1
2
3
4
A
B
C
D
Table 2 Results of HPV DNA hybridization in glans and sulcus
coronar-ius of penis, and urethra
出 さ れ な か っ た.な お,亀 頭 ・冠 状 溝smearで HPV陽 性 を 示 した 症 例 の うち,尿 道 も検 索 で き た も の は16/18型 陽 性 の1例 を 除 い た5例 で あ っ た. 次 に,HPV陽 性 例 につ い て,継 続 し てHPV が 存 在 し得 る か に つ い て 検 討 した.検 査 可 能 で あ っ た5症 例 に つ い て,HPV陽 性 と判 明 した 数 週 間 後 に 再 び 亀 頭 ・冠 状 溝smearと 尿 道smearを 採 取 してHPVの 検 索 を行 った.そ の結 果,5例 と も 亀 頭 ・冠 状 溝 お よ び尿 道 に はHPVが 検 出 さ れ な か った. 年 齢 分 布 に つ い て み る と,亀 頭 ・冠 状 溝 smear に お け るHPV陽 性 症 例 は,26歳 か ら45歳 ま で の 群 に み られ,そ の年 齢 群 に お け るHPV陽 性 率 は 6.1%で あ った.さ らに,26歳 か ら35歳,お よ び36 歳 か ら45歳 の年 齢 群 に お げ るHPV陽 性 率 は,そ れ ぞ れ9.3%,3.6%で あ った. 考 察 HPVは,従 来 疣 贅 病 変 の病 因 ウ イ ル ス と して 知 られ て い る が,宿 主 域 が きわ め て 狭 く,有 効 な 細 胞 増 殖 系 や 実 験 動 物 が 確 立 さ れ て い な い た め HPVの 研 究 は遅 れ て いた.し か し,近 年 の 分 子 生 物 学 の 進 歩 に よ りHPVの 同 定 は,主 に そ の DNAの 分 離iによ って な され て い る. HPV DNA 型 はDNAの 類 似 性 と制 限酵 素 に よる切 断 パ タ ー ン の違 い か ら,現 在 で は50種 類 以 上 の もの が 知 ら れ て い る7).ま た,HPVDNA型 は 各 疾 患 別 に調 べ られ て お り,泌 尿 器 科 領 域 に お け る 主 な も の と して,尖 圭 コ ン ジ ロー マ か ら はHPV6型 お よ び 11型 が,陰 茎 癌 か らはHPV16型 お よ び18型 が検 出 され て い る8)9). さ らに,HPVは 陰 茎 癌 の 他 に 子 宮 頸 癌 や 外 陰 癌 な どに検 出 され,性 器 癌 の発 生 に 関 与 す る ウ イ ル ス と して 注 目 され て い る10).しか し,正 常 男 子 の 亀 頭 ・冠 状 溝 お よ び 正 常 女 子 の 子 宮 頸 管 に も HPVが 検 出 され た との 報 告1)2)があ り,無 症 候 性 感 染 の 可 能 性 が 示 唆 され て い る.Conenら1)は 健 康 男 子530症 例 の 亀 頭 ・冠 状 溝smearの み に対 し てin situ hybridization法 を用 い てHPVの 検 出 を 行 った と こ ろ,31例(5.8%)にHPVを 認 め た と報 告 して い る.そ のDNA型 は,HPV6/11型 が 8例,16型 と18型 の両 方 が 認 め られ た も の が5例, 6/11型 と16型 と18型 が す べ て 認 め られ た も の が18 例 で あ っ た. そ こ で我 々は,一 般 正 常 男 子 群 と して,外 陰 部 に異 常 を 認 め な い慢 性 前 立 腺 炎 症 例 を 対 象 に,亀 頭 ・冠 状 溝 の み な らず 尿 道 の2ヵ 所 同 時 に HPV の検 索 を 行 った.亀 頭 ・冠 状 溝smearを 採 取 し得 た177例 中,HPV陽 性 例 は6例(3.4%) と Conen らの 報 告 よ り若 干 少 な か った が,や は り無 症 候 性 感 染 の 存 在 が 考 え られ た.ま た,そ のDNA型 分 布 に つ い て比 較 す る と,尖 圭 コ ン ジ ロ ー マ の原 因 と な るHPV6/11型 と,陰 茎 癌 や 子 宮 頸 癌 や 外 陰 癌 な どの悪 性 腫 瘍 に検 出 され るHPV16/18型,お よ び子 宮 頸 癌 に検 出 され るHPV31/33/35型 に は偏 りは な く,Conenら の 報 告 と 同 様 な 結 果 で あ っ た.す な わ ち,性 器 癌 の 発 生 に 関 与 す るHPV DNA型 が 陰 茎 に 無 症 候 性 感 染 し得 る こ と が判 明 した. 次 に年 齢 分 布 に つ い て 検 討 す る と,Conen ら は 16歳 か ら35歳 ま で の 性 的 活 動 の 盛 ん な年 齢 層 に多 い と報 告 し て お り,自 験 例 も同 様 な傾 向 で あ っ た (Table3).こ の こ とは,正 常 男 子 の陰 茎 に お け る HPVの 無 症 候 性 感 染 が,性 交 渉 に よ る も の と推
Table 3 Age distribution of HPV DNA positive cases of normal men in glans and sulcus
測 され た.な お,Conenら は76歳 以 上 の老 年 層 に もHPV陽 性 を2例 認 め て い るが,そ れ は 免 疫 機 能 が 低 下 して いた た め と述 べ て い る. と ころ で,HPVは 陰 茎 の 亀 頭 ・冠 状 溝 以 外 に 陰 茎 包 皮 や 尿 道 粘 膜 お よ び精 液 に も存 在 して い る こ とが 知 られ て い る.す な わ ち,Katelarisら11) は 正 常 男 子55例 の 陰 茎 包 皮 と尿 道 粘 膜 よ りHPVを そ れ ぞ れ31%,18%検 出 して お り,ま たOstrow ら 12) は 疣 贅 状 表 皮 発 育 異 常 症 と疣 贅 疾 患 の 患 者 の精 液 よ りHPVを 検 出 して い る.今 回 の検 討 で は,尿 道 smearを 採 取 で きた86例 に はHPVが 認 め られ な か つた.そ の なか に は亀 頭 ・冠 状 溝smearで 陽 性 で あ っ た5例 が 含 ま れ て お り,HPV感 染 は 尿 道 まで 広 範 囲 に 及 ぼず,局 所 的 に存 在 して い る もの と考 え られ た. HPV陽 性 の5症 例 につ い て,数 週 間 後 にHPV 感 染 の存 続 の 有 無 を検 討 した と ころ,ど の症 例 も 亀 頭 ・冠 状 溝 と 尿 道 か ら はHPVが 検 出 さ れ な か った.し か し,Conenら はHPV6/11型 と16型 お よ び18型 が 陽 性 の3例 に つ い て,6ヵ 月 後 に HPVの 検 索 を 行 った と こ ろ,1例 が16型 と18型 が 陽 性 で あ った と報 告 して い る.同 様 の 検 索 を正 常 女 子 の子 宮 頸 管 につ い て 行 った 報 告13)では,6 ヵ月 後 に 同 じDNA型 が 維 持 され て 存 在 して い た もの が30%に 認 め られ て い る.し か し,自 験 例 に お い てHPV感 染 は,長 時 間 に わ た り維 持 され ず, Vira TypeTMの 検 出感 度 を 考 慮 す る と 自然 消 失 し た もの と考 え られ た.す な わ ち,HPVはhost の 抵 抗 力 に よ り自然 消 失 す る に も か か わ らず,一 般 男 子 の 数%に 蔓 延 して い る こ とか ら,STDと して 無 症 候 性 交 差 感 染 に よ り,一 般 男子 に 広 が っ て い る可 能 性 が推 測 され た. と こ ろ で,今 回 正 常 男 子 群 の対 象 と して 慢 性 前 立 腺 炎 症 例 を選 んだ が,そ の 前 立 腺 分 泌 液 か ら一 般 細 菌 以 外 に,ChlamzydiaやUreaplasma が 分 離 され た 報 告14)15)があ る.し か し,HPVが 検 出 され た 報 告 は な く,す くな く と もHPVが 慢 性 前 立 腺 炎 の 原 因 に は な って い な い と考 え られ るた め,正 常 男 子 群 と して 選 択 し た こ とは 問 題 な い と考 え た. 我 々がHPVの 検 出 に用 い たVira Type TMは, 感 度 お よ び 特 異 性 に す ぐ れ て お り,電 気 泳 動 の 必 要 も な く測 定 方 法 が 簡 便 で あ る.ま た,一 度 に あ る 程 度 多 量 の 検 体 を 処 理 で き,測 定 時 間 も比 較 的 短 時 間 で 終 え る こ と が で き る.以 上 の 点 でVira TypeTMはHPV感 染 のscreeningに 優 れ た 検 査 法 と 考 え ら れ る.さ ら に,Vira TypeTMは7種 類 の 型(HPV6,11,16,18,31,33,35) の Probe
を 混 合 し たDetection kitで あ るVira PapTMと 異
な り,typingが で き る た め,臨 床 的 に 正 常 な 内 外 性 器 に お け るHPV感 染 の 意 義 が よ り一 層 明 確 に な る も の と 思 わ れ る. 今 後 は,症 例 数 を 増 や す と 同 時 に,正 常 男 子 の み な ら ず,sexual partnerで あ る 正 常 女 子 の 子 宮 頸 部 に お け るHPVのscreeningを 検 討 す る 予 定 で あ る. 謝 辞:稿 を終 え るに あた り,Vira TypeTMを 提 供 して頂 き ま した東 レ(株),お よ び検 体採 取 に御協 力 頂 き ま した 札 幌 泌 尿 器科 医院 ・郷路 勉 先 生,生 垣 皮 膚泌 尿 器 科 医院 ・ 生 垣 舜 二先 生 に深 謝致 し ます. 文 献
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