● シンポジウム 2 神経保護と神経再生
要 旨
現在，出血性梗塞に対する有効な治療法はなく，ワルファリンによる出血性梗塞の増大は致命的であるた め，その治療法の確立が不可欠である．抗血小板薬であるシロスタゾールは神経保護作用および血管内皮細胞 保護作用を含む様々な保護作用を有することが知られているが，ワルファリン服用患者には慎重投与とされて いる．本研究では，シロスタゾールが tight junction proteins および VE-cadherin を増強することで，ワルファリ ンによる出血性梗塞の増悪を抑制することを明らかにした．また，末梢からの出血時間も延長させなかったこ とから，本研究が臨床に応用できる可能性も示唆された． （脳循環代謝 25：57∼61，2014） キーワード : 出血性梗塞，抗凝固薬，ワルファリン，シロスタゾール，タイトジャンクション
1．ワルファリン抗凝固療法
脳卒中は年齢に大きく関与している．先進国におけ る高齢化によって，心原性脳塞栓症の主な原因である 非弁膜症性心房細動による脳梗塞患者数は 2030 年ま でに 2 倍になることが予測されている1, 2）． 非弁膜症性心房細動による脳梗塞の予防のための標 準的な治療として，経口抗凝固薬の投与は臨床上広く 認められており，とくに高血圧，糖尿病，不整脈や脳 梗塞の罹患歴がある患者において，その使用が強く勧 められている3, 4）． ビタミン K のアンタゴニストであるワルファリン は，非弁膜症性心房細動患者の心原性脳塞栓症予防の 第一選択薬として，臨床上広く用いられている． 一方，他の新規経口抗凝固薬，とくにダビガトラン やリバロキサバンはワルファリンに比べて出血合併症 が比較的少ないが5, 6），特異的なアンタゴニストがな く，出血が起こった際にその作用を軽減することがで きないことが臨床で用いられる上で主な懸念となって いる7）．それゆえ，ワルファリンは臨床において標準 的な経口抗凝固薬として使われ続けている． 早期の出血性梗塞は脳梗塞の合併症として生じ，虚 血障害や心原性脳塞栓症の大きさは虚血後の早期出血 性梗塞の独立したリスクファクターである8）．さらに 脳虚血後の早期出血性梗塞の深刻なサブタイプである 実質血腫は患者の転帰を悪化させる8）．しかしなが ら，現在臨床において出血性梗塞を予防するために利 用できる有効な治療法はない．出血性梗塞の主な原因 の一つとして，これまでに脳虚血の実験的研究によっ て，虚血再灌流後の血液脳関門（BBB）の透過性の上昇 が関与していることが明らかにされてきている9, 10）． ワルファリン抗凝固療法患者における出血性梗塞のリ スクに関する研究は未だあまり行われていないが，マ ウスにおいてはワルファリンの前処置が一過性脳虚血 後の出血性梗塞のリスクを増大させることが報告され ている11）．2．シロスタゾールの保護作用
シロスタゾールはホスホジエステラーゼ III 阻害作 用を有する抗血小板薬であり，脳梗塞の 2 次予防およ び末梢動脈疾患における間欠性跛行に広く用いられてワルファリン誘発出血性梗塞に対する
シロスタゾールの保護作用の検討
北庄司 輝，原 英彰
岐阜薬科大学生体機能解析学大講座薬効解析学研究室 〒 501-1196 岐阜県岐阜市大学西 1-25-4 TEL: 058-230-8100 FAX: 058-230-8126 E-mail: [email protected]いる．シロスタゾールの特徴の一つは血管内皮細胞を 潜在的に保護することである10, 12~14）．我々は過去にマ ウスにおいてシロスタゾールが BBB の破綻を防ぐこ とで，脳虚血後の出血性梗塞を減少させることを明ら かにしてきた10, 12）． そこで本研究は，脳虚血後のワルファリン誘発出血 性梗塞に対するシロスタゾールの作用を明らかにする ことを目的に検討を行った．
3．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルの作製
ワルファリンを水ビンに入れ，自由給水下でマウス を飼育し，経時的に血液を採取することで，血液凝固 能の指標である prothrombin time-international normalized ratio（PT-INR）を測定した．その結果，ワルファリン投 与開始 18 時間後に PT-INR が臨床での治療域に達した ため，今後モデルを作製する上で，ワルファリン投与 時間を 18 時間に設定した．ワルファリン投与 18 時間 後に，3 時間虚血 / 再灌流を施すことにより出血性梗 塞を引き起こし，ワルファリン誘発出血性梗塞モデル を作製した．4．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルに
対するシロスタゾールの出血に及ぼす影響
本モデルマウスを用いて，再灌流直後に梗塞体積を 変化させない量のシロスタゾール（1 または 3 mg/kg） を腹腔内に投与した．出血量はヘモグロビンアッセイ によって定量した．ワルファリン単独投与群で出血量 が増加したのに対し，シロスタゾール併用群ではそれ が抑制された（図 1A∼C）．また，7 日後までの生存率 も評価したところ，ワルファリン単独投与群よりもシ 図 1．ワルファリン誘発出血性梗塞モデルに対するシロスタゾールの効果 A：ワルファリン単独投与群（左）とワルファリンとシロスタゾール併用群（右）の脳全体写真． B：Vehicle 群（左），ワルファリン単独投与群（中）およびワルファリンとシロスタゾール併 用群（右）の脳凍結切片写真． C：ワルファリンとシロスタゾールの出血量に及ぼす影響． D：虚血 7 日後までの生存率． E：ワルファリンとシロスタゾール併用による出血時間への影響．(A–C) Data are expressed as means ± SD (##P < 0.01 vs. vehicle, ＊P < 0.05 vs. warfarin; Tukey s
t-test, n = 6 to 15) . (D) ＊P < 0.05 vs. cilostazol; log-rank t-test, n = 12 or 10. (E) Data are
expressed as means ± SEM (＊＊P < 0.01 vs. Normal; Student s t-test, n = 8)
CSZ：シロスタゾール （文献 15 より改変引用）
ワルファリン誘発出血性梗塞に対するシロスタゾールの保護作用の検討 ロスタゾール併用群において有意に生存率が高かった （図 1D）．つぎに，ワルファリンとシロスタゾールの 出血に対する相互作用を検討するため，イソフルラン 麻酔下で尻尾の直径が 2.5 mm の場所の尾静脈を切開 し，湧出する血液を 30 秒ごとにろ紙で吸収し，自然 に止血するまでの時間を測定した．ワルファリン単独 投与群とシロスタゾール併用群の出血時間に有意な差 はなかった （図 1E）．
5．シロスタゾールの出血性梗塞抑制
メカニズムの検討
つぎに，シロスタゾールがワルファリンによる出血 を抑制したメカニズムの解明を目的に，BBB のバリ アー機能の一つである tight junction proteins（TJPs）に着目 し た．TJPs は 膜 貫 通 型 タ ン パ ク 質 の Claudin， Occludinおよび JAM から成り，これらのタンパク質 は ZO-1 を介して細胞内の actin に連結しており，とく に Claudin-5，Occludin および ZO-1 は BBB の重要な 構成因子である．よって今回，TJPs である Claudin-5， Occludin，ZO-1 および Adherens junction protein である VE-cadherinのタンパク量をウエスタンブロットによ り測定した．シロスタゾールは，虚血による ZO-1， Claudin-5および VE-cadherin の発現の減少を抑制した （図 2）． つぎに，過剰な発現が脳損傷後の浮腫および出血に 関与すると考えられている matrix metalloproteinase （MMP）-2 および 9 についても検討を行ったが，ワル ファリン単独投与群とシロスタゾール併用群の間に有 意な差は認められなかった（図 3）．
図 2．Tight junction proteins および VE-cadherin の発現量
ウェスタンブロッティングにより，ZO-1（A），Occludin（B），VE-cadherin（C），Claudin-5 （D）の発現量を定量した．
Data are expressed as mean ± SEM (＊P < 0.05, ＊＊P < 0.01 vs. Sham, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs.
cilo-stazol; Student s t-test, n = 8 to 9) CSZ：シロスタゾール （文献 15 より引用）
以上，シロスタゾールがワルファリンによる出血性 梗塞を抑制した機序として，MMP-2 および 9 は関与 せず，虚血による TJPs および VE-cadherin の減少を抑 制したことが示唆された．すなわち，シロスタゾール が MMP-2, 9 を介さず，直接 TJPs および VE-cadherin を保護している可能性が示唆された．
6．まとめ
本研究では，マウスを用いたワルファリン誘発出血 性梗塞に対して，シロスタゾールは脳浮腫および脳出 血を抑制し，生存期間を延長させた．さらに，シロス タゾールは出血時間を延長させることなく，BBB 構成 タンパク質を保護することを明らかにした．これらの 知見は，同様の効果がヒトにおいても認められた場 合，脳梗塞後急性期の患者，とくに抗凝固療法を受け ている患者において，シロスタゾール投与は出血性リ スクを軽減できることから，有益である可能性が示唆 された．今後，このワルファリンとシロスタゾールの 併用療法の有効性および安全性を確認するための適切 な臨床試験が行われることを期待したい． 文 献1） Go AS, Hylek EM, Phillips KA, Chang Y, Henault LE, Selby JV, Singer DE: Prevalence of diagnosed atrial fibril-lation in adults: national implications for rhythm
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図 3．MMP-2 および 9 の発現量
ウェスタンブロッティングにより，MMP-2（A），MMP-9（B）の発現量を定量した． Data are expressed as mean ± SEM (＊＊P < 0.01 vs. Sham; Student s t-test, n = 6 to 14)
CSZ：シロスタゾール （文献 15 より引用）
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