根粒菌の3型分泌エフェクターによるマメ科植物の
共生菌制御機構の解明
著者
日下部 翔平
学位授与機関
Tohoku University
学位授与番号
11301甲第19371号
URL
http://hdl.handle.net/10097/00127817
博士論文（要約）
根粒菌の 3 型分泌エフェクターによるマメ科植物の共生菌制御機構の解明
令和元年度
東北大学大学院生命科学研究科
生態システム生命科学専攻
日下部 翔平
博 士 論 文 の 要 約 【 背 景 ・ 目 的 】
マ メ 科 植 物 と 根 粒 菌 の 共 生 の 過 程 で は 、 宿 主 の 根 か ら 分 泌 さ れ る フ ラ ボ ノ イ ド や 、 根 粒 菌 の 分 泌 す る 、 根 粒 形 成 を 誘 導 す る 働 き を も つ シ グ ナ ル 分 子 で あ る Nod factor (NF)を 介 し た 相 互 認 識 反 応 が 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。し か し 近 年 、NF を 介 し た 相 互 認 識 系 に 加 え 、根 粒 菌 の 3 型 分 泌 系 (Type Ⅲ secretion system : T3SS ） を 介 し た 、 よ り 厳 密 な 相 互 認 識 系 が 明 ら か に な り つ つ あ る 。T3SS と は 病 原 菌 が 宿 主 細 胞 に エ フ ェ ク タ ー と 総 称 さ れ る タ ン パ ク 質 を 打 ち 込 む 際 に 用 い る タ ン パ ク 質 分 泌 系 で あ り 、 こ の 分 泌 系 は 多 く の 根 粒 菌 に も 保 存 さ れ て い る 。 広 域 宿 主 性 を 持 つ 根 粒 菌 Bradyrhizobium elkanii USDA61 株 (USDA61 株 )は 少 な く と も 10 種 類 の 構 造 の NF を 分 泌 す る こ と が で き 、複 数 の 宿 主 植 物 に 対 し て 根 粒 を 形 成 す る こ と が で き る 。し か し 、一 般 的 に USDA61 株 を 含 む 広 域 宿 主 性 の 根 粒 菌 は 窒 素 固 定 活 性 が 低 い 傾 向 に あ り 、 宿 主 植 物 に と っ て 不 都 合 な 根 粒 菌 で あ る と 考 え ら れ る 。 USDA61 株 は Rj4 遺 伝 子 型 の ダ イ ズ 系 統 や リ ョ ク ト ウ の KPS1 系 統 に 対 し て 共 生 不 和 合 性 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て お り 、 こ れ ま で の 研 究 か ら 、 USDA61 株 の T3SS エ フ ェ ク タ ー が こ の 共 生 不 和 合 性 の 要 因 と な っ て い る こ と が 明 ら か と な っ て い る 。こ の 結 果 は 、宿 主 植 物 が NF の 認 識 系 と は 独 立 に 、T3SS エ フ ェ ク タ ー の 認 識 に よ っ て 不 都 合 な 共 生 者 を 排 除 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。し か し 、T3SS エ フ ェ ク タ ー の 認 識 に よ る 共 生 菌 制 御 の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム は 明 ら か に な っ て い な い 。 こ の メ カ ニ ズ ム の 解 明 を 促 進 す る た め に 本 研 究 で 着 目 し た の が 、 マ メ 科 の モ デ ル 植 物 と し て 実 験 系 の 整 備 が 進 め ら れ て い る ミ ヤ コ グ サ (Lotus japonicus)で あ る 。そ こ で 本 研 究 で は 、USDA61 株 と ミ ヤ コ グ サ の リ ソ ー ス を 用 い た 解 析 か ら 、T3SS エ フ ェ ク タ ー を 利 用 し た 宿 主 の 共 生 菌 制 御 機 構 の 詳 細 な 解 析 を 試 み た 。 【 結 果 ・ 考 察 】 1) ミ ヤ コ グ サ と の 共 生 に お け る USDA61 株 の T3SS の 影 響 の 調 査 お よ び エ フ ェ ク タ ー の 探 索 ミ ヤ コ グ サ に 対 す る USDA61 株 の T3SS の 影 響 を 確 認 す る た め に 、 ミ ヤ コ グ サ の 実 験 系 統 MG-20 (Miyakojima)、 Gifu (B-129) お よ び 、 パ キ ス タ ン 由 来 の 類 縁 実 験 系 統 Lotus burttii に 対 し て USDA61 野 生 株 及 び T3SS 破 壊 株 (BErhcJ 株 )の 接 種 実 験 を 行 い 、 根 粒 の 着 生 状 況 の 観 察 を 行 っ た 。 USDA61 株 の 接 種 の 結 果 、MG-20 で は 根 粒 が 形 成 さ れ た の に 対 し 、L. burttiiで は 多 数 の 無 効 根 粒 が 形 成 さ れ 、Gifu で は 根 粒 の 形 成 が ほ ぼ 観 察 で き な か っ た 。ま た 、MG-20 及 び L. burttii に お い て 形 成 さ れ た 根 粒 で は 、 中 心 部 の 茶 色 へ の 変 色 が 観 察 さ れ た 。 一 方 で 、 BErhcJ 株 の 接 種 で は 、 3 つ す べ て の 系 統 で 赤 色 の 成 熟 根 粒 の 形 成 が 確 認 さ れ た 。 DsRed 標 識 し た USDA61 株 の 接 種 の 結 果 、 MG-20 で は 根 粒 全 体 か ら 菌 の 蛍 光 が 確 認 さ れ た の に 対 し 、L. burttii で は 菌 の 蛍 光 が 一 か 所 に 留
め ら れ て い る 状 況 が 観 察 さ れ 、Gifu で は わ ず か に 形 成 さ れ る バ ン プ か ら も 菌 の 蛍 光 は 観 察 さ れ な か っ た 。こ れ ら の 結 果 か ら 、USDA61 株 の T3SS エ フ ェ ク タ ー が エ フ ェ ク タ ー 誘 導 性 免 疫（ effector triggered immunity : ETI） を 誘 導 し 、 Gifu で は 根 粒 菌 の 侵 入 を 阻 害 す る 反 応 が 、L. burttiiで は 根 粒 の 成 熟 阻 害 の 反 応 が 誘 導 さ れ 、MG-20 と L. burttiiの 2 つ の 系 統 で は 根 粒 の 早 期 老 化 様 の 反 応 が 誘 導 さ れ 、 結 果 と し て 老 化 根 粒 の 特 徴 で あ る 茶 色 く 変 色 し た 根 粒 が 観 察 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
ミ ヤ コ グ サ に ETI を 誘 導 す る T3SS エ フ ェ ク タ ー を 同 定 す る た め 、USDA61 株 の 既 知 の T3SS エ フ ェ ク タ ー 破 壊 株 の 接 種 試 験 を 行 っ た 結 果 、nopMの 破 壊 株 (BEnopM 株 )に お い て L. burttiiと MG-20 で 観 察 さ れ る 根 粒 の 早 期 老 化 が 抑 制 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た 。 BEnopM 株 の 接 種 に よ り 、 MG-MG-20 で は BErhcJ 株 と 同 等 の 成 熟 根 粒 数 を 示 し た が 、L.burttiiで は 茶 色 へ の 変 色 は 認 め ら れ な く な っ た も の の 多 数 の 無 効 根 粒 が 形 成 さ れ 、Gifu へ の 接 種 で は 根 粒 は 形 成 さ れ な か っ た 。こ の 結 果 か ら 、 NopM が 根 粒 の 早 期 老 化 を 誘 導 す る エ フ ェ ク タ ー で あ る こ と 、 及 び NopM が 根 粒 の 成 熟 阻 害 と 根 粒 菌 の 侵 入 阻 害 に は 関 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。 そ こ で iTRAQ 法 を 用 い て T3SS エ フ ェ ク タ ー タ ン パ ク 質 を 網 羅 的 に 同 定 し 、そ れ ら の 破 壊 株 を 用 い た 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、Gifu に 侵 入 阻 害 を 誘 導 す る エ フ ェ ク タ ー 候 補 と し て NopF が 同 定 さ れ た 。 NopF の 破 壊 株 (BEnopF 株 )を Gifu に 対 し て 接 種 し た 結 果 、L. burttii と 同 様 に 多 数 の 無 効 根 粒 が 形 成 さ れ 、 DsRed 蛍 光 標 識 し た 菌 株 の 接 種 か ら 、 BEnopF 株 が 侵 入 阻 害 を 回 避 で き る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 BEnopF 株 を 接 種 し た Gifu で は 成 熟 根 粒 の 形 成 が ほ ぼ 認 め ら れ ず 、か つ 早 期 老 化 様 の 根 粒 が 観 察 さ れ た こ と か ら 、Gifu は 根 粒 の 成 熟 阻 害 と 早 期 老 化 の 反 応 も 有 し 、 そ れ ら が NopF と は 異 な る エ フ ェ ク タ ー に よ り 誘 導 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 USDA61 株 の nopF遺 伝 子 を ミ ヤ コ グ サ 根 粒 菌 Mesorhizobium loti
に 導 入 し た 菌 株 (M. loti-nopF株 )を 作 成 し Gifu に 接 種 し た 結 果 、 根 粒 が ほ ぼ 形 成 さ れ な く な る こ と が 確 認 さ れ た 。M. loti-nopF株 の L. burttii と MG-20 へ の 接 種 で は 顕 著 な 阻 害 反 応 は 認 め ら れ な い こ と か ら 、NopF が M. loti に お い て も 根 粒 菌 の 侵 入 阻 害 を 誘 導 で き る こ と 、 ま た 根 粒 の 成 熟 阻 害 と 早 期 老 化 が NopF と は 異 な る エ フ ェ ク タ ー で 誘 導 さ れ る こ と が 確 認 さ れ 、 USDA61 株 の 接 種 に 対 す る 3 つ の ETI が そ れ ぞ れ 異 な る エ フ ェ ク タ ー に よ っ て 誘 導 さ れ る こ と が 示 さ れ た (図 )。 図 . 本 研 究 で 明 ら か と な っ た T3SS エ フ ェ ク タ ー タ ン パ ク 質 を 介 し た 共 生 過 程 の 免 疫 防 御 反 応 の モ デ ル
2) ミ ヤ コ グ サ の リ ソ ー ス を 活 用 し た USDA61 株 と の 共 生 に 関 与 す る 宿 主 側 因 子 の 探 索
M. loti-BenopF株 は Gifu に 対 し て 根 粒 菌 の 侵 入 阻 害 の み を 誘 導 で き る こ と か ら 、 こ の 菌 株 を 用 い る こ と に よ り 根 粒 菌 の 侵 入 阻 害 に 関 与 す る 宿 主 因 子 の み に 着 目 し た 解 析 が 可 能 と な っ た 。 そ こ で Gifu×MG-20 の 組 み 合 わ せ で 作 成 さ れ た 組 換 え 近 交 系 統 (RILs)の 70 系 統 に 対 し て M. loti-BenopF 株 を 接 種 し 、表 現 型 の 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、根 粒 を 形 成 す る MG-20 型 の 系 統 と 、根 粒 を 形 成 し な い Gifu 型 の 系 統 に 分 類 す る こ と が で き 、 こ の 表 現 型 情 報 を 用 い て QTL 解 析 を 実 施 し た 結 果 、 3 番 染 色 体 上 に 1 遺 伝 子 支 配 を 示 唆 す る 有 意 な LOD 値 の ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 こ の 領 域 に 組 換 え を 持 つ RILs を さ ら に 18 系 統 選 抜 し 、 こ れ ら の 選 抜 系 統 に 対 し て M. loti-BenopF 株 の 接 種 試 験 を 行 っ た 結 果 、 候 補 領 域 を 3 番 染 色 体 の ペ リ セ ン ト ロ メ ア 領 域 に 位 置 す る 約 422 kbp の 領 域 に 絞 り 込 む こ と が で き た 。 候 補 領 域 が 組 換 え の 起 こ り に く い 領 域 に 位 置 し て い る た め 、 ゲ ノ ム ワ イ ド 関 連 解 析 か ら 候 補 遺 伝 子 を 同 定 す る こ と を 目 的 と し 、 101 の ミ ヤ コ グ サ 野 生 系 統 に 対 し て USDA61 株 を 接 種 し 、表 現 型 の 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、ミ ヤ コ グ サ 野 生 系 統 の 中 に も 根 粒 を 形 成 し な い Gifu 型 の 系 統 、 無 効 根 粒 を 多 数 形 成 す る L. burttii型 の 系 統 、 根 粒 を 形 成 す る MG-20 型 の 系 統 が 観 察 さ れ た 。 現 在 、 こ の ミ ヤ コ グ サ 野 生 系 統 の 系 統 間 差 情 報 を 用 い た ゲ ノ ム ワ イ ド 関 連 解 析 か ら 、 候 補 遺 伝 子 の 同 定 を 進 め て い る 。 【 ま と め 】 本 研 究 に よ り 、 宿 主 植 物 が T3SS エ フ ェ ク タ ー の 認 識 に よ っ て 不 都 合 な 根 粒 菌 を 排 除 す る 機 構 と し て 、 こ れ ま で 報 告 の あ っ た 侵 入 阻 害 の 反 応 に 加 え て 、 侵 入 後 も 複 数 の タ イ ミ ン グ で 根 粒 菌 の 共 生 を 排 除 す る 免 疫 防 御 機 構 を 備 え て い る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 複 数 の 免 疫 防 御 反 応 が 、 そ れ ぞ れ 異 な る T3SS エ フ ェ ク タ ー に よ っ て 誘 導 さ れ る こ と を 明 ら か に し た 。
