NEBNext Direct
Target Enrichment Technology
次世代シーケンサー用
遺伝子パネル
be INSPIRED
drive DISCOVERY
NEBNext Direct
ワークフロー
ターゲット領域の濃縮と
NGS
ライブラリー調製
T T ターゲット遺伝子 ゲノムDNA ビオチンプローブ Streptavidin bead 3′adaptor 5′UMI adaptor 断片化 変性&プローブ・ ハイブリダイゼーション 3′末端の平滑化 dAテーリング 3′アダプター・ ライゲーション 5′末端平滑化 5′UMIアダプター・ ライゲーション アダプター開環 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ A T A T A 3′ 5′ A 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ イルミナ・シーケンサー用ライブラリー PCR増幅 3′ 5′ 5′ 3′ サンプル・インデックス（PCR中に付加） A T A オフターゲット配列を除去 ビオチンプローブは DNAトップ鎖とボトム鎖の 両方のターゲット領域に ハイブリダイズ （図はトップ鎖のみ表示） プローブを起点に 5′→ 3′へDNAを合成 ループを切断して アダプターを開環 分子バーコード（Unique Molecular Identifier） の付加により正確な
発現解析と定量が可能
NEBNext Directはゲノム中のターゲット領域を濃縮してライブラリー調製を行い、ディープシーケンスを行うための遺伝子パネルです。
New England BiolabsとDirected Genomics社が共同して開発した、ターゲット領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いた濃縮 方法により、低頻度変異の検出が可能となりました。本手法はマルチプレックスPCRを用いた濃縮方法よりも広いターゲット領域の濃 縮と、高いカバレッジを示すライブラリー調製が可能であり、ターゲット濃縮からライブラリー調製まで１日以内で完了します。
特長
• エンリッチメント試薬、ライブラリー調製試薬、インデックスプライマーが付属 • ニッキング酵素によりDNA断片化、高価な断片化機器は不要 • 独自のプローブによりターゲットの全領域をカバー • 3′オフターゲット領域の除去により、高いオンターゲット率を実現 • UMI付加によりPCR duplicateを除去、高解像度の解析が可能 • 最少10 ngのDNAより高品質のライブラリーを調製• FFPE DNAやctDNAサンプルにも対応
• On-Beadsワークフローのため、オートメーションに最適
NEBNext Direct
：ターゲット領域を濃縮して
ライブラリー調製を行う遺伝子パネル
Hybridization-Based PCR-Based Alternative
37 kb Competitor Custom Panel B 37 kb Competitor Custom Panel A NEBNext Direct 37 kb Cancer HotSpot Panel 23 kb Oncology Panel 51.1 kb Solid Tumor Panel 20 kb Cancer Research Panel (Selector Probe) 35 kb Cancer Panel (Extension Ligation) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Bases > 25% Mean Coverage (%)
NEBNext Direct
は他の濃縮方法よりもターゲット領域を均一にカバー
NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel（NEB #E7000）と各社がん遺伝子パネルを用いて調製したライブラリーをIllumina MiSeqでシーケンスしたところ、他社パネルと比較して
NEBNext Directパネルがより高いCoverage Uniformityを示した。シーケンス・リードを各ターゲット領域にマッピング、領域毎のカバレッジを求め、平均カバレッジ（Mean Coverage）の25%以上でカバーされている領域をY軸に示した。インプットDNAとして24 HapMapサンプルの混合物、DNA量として各社推奨量を用いた。濃縮およびライ ブラリー調製は各社推奨プロトコールに従った（N = 2）。
3
種類のパネルを提供
• Cancer HotSpot Panel
• BRCA1/BRCA2 Panel
• Custom Ready Panel
NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel
NEBNext Direct Cancer HotSpot Panelは、がんに関連する50遺伝子の190か所のホットスポット領域を濃縮してライブラリー調製するた めの遺伝子パネルです。ターゲット領域の総サイズは37 kbであり、COSMIC（がんの体細胞変異のデータベース）に集積された18,000 以上の変異が含まれています。
特長
• 独自のプローブにより50遺伝子、190領域を高効率かつ均一 でカバー • 10 ng – 1 µgのDNAよりライブラリー調製• 分解が進んだFFPE DNAやctDNAサンプルにも対応
NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel
の
ターゲット遺伝子
ABL1 EGFR GNAQ KRAS PTPN11
AKT1 ERBB2 GNAS MET RB1
ALK ERBB4 HNF1A MLH1 RET
APC EZH2 HRAS MPL SMAD4
ATM FBXW7 IDH1 NOTCH1 SMARCB1
BRAF FGFR1 IDH2 NPM1 SMO
CDH1 FGFR2 JAK2 NRAS SRC
CDKN2A FGFR3 JAK3 PDGFRA STK11
CSF1R FLT3 KDR PIK3CA TP53
CTNNB1 GNA11 KIT PTEN VHL
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Percent Reads Mapped to Targets
Fresh frozen DNA
1 2 3 4 5
FFPE DNA
1 2 3 4 5
DNA Source (100 ng) Cell free DNA
1 2 3 4 5
セルフリー
DNA
や
FFPE DNA
にも対応
100 ngの各DNAサンプルから調製したライブラリーをシーケンス、リー ドをターゲット領域にマッピングしたところ、すべてのサンプルにおいて 高いマッピング率が示された。 0.5 1.0 1.5 2.0 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 Target GC No rmali zed C ov er age
GC
含量によらず各領域を均一にカバー
100 ngのDNAサンプルから調製したライブラリーをシーケンス、リードをターゲット領域に マッピングしてGC含量毎のカバレッジをY軸に示したところ、GC含量によらずに均一であ ることが示された。オーダーインフォメーション
製品名 製品番号 容量 希望小売価格NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel
E7000S 8 rxns ¥224,000
E7000L 24 rxns ¥656,000 E7000X 96 rxns ¥1,450,000
* 各サイズに応じたインデックス・プライマーが付属
E7000S：8種類、E7000L：24種類、E7000X：96種類
NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panelは、BRCA1/BRCA2遺伝子の全エクソン領域を対象とした遺伝子パネルです。高いcoverage uniformity により、生殖細胞と体細胞の低頻度変異の検出を可能とします。
特長
• BRCA1/BRCA2遺伝子の全エクソン領域（100%）を濃縮 • 10 ng – 1 µgのDNAよりライブラリー調製 • 生殖細胞と体細胞の低頻度変異の検出が可能• 分解が進んだFFPE DNAやctDNAサンプルにも対応
NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panel
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Aligned Percent of Reads (%) Reads mapped to targets 10 ng 100 ng 1 µg
様々なインプット量から高効率で
BRCA1/BRCA2
遺伝子を濃縮可能
インプット量の異なるヒトゲノムDNA（10 ng、100 ng、1 µg）から濃縮とライブラリー 調製を行い、シーケンスリードを全ゲノムにアライメントもしくはBRCA1/BRCA2遺 伝子にマッピングしたところ、高効率でBRCA1/BRCA2遺伝子が濃縮されているこ と が 示され た。 イルミナMiSeqにて2 × 75 bpのシ ー ケンスを行 った。PCR duplicateはUMIでフィルターをした。アライメントはBWA-MEMで行った。Millions of Reads 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 300 400 500 0 100 200 600 700 800 900 1,000
Mean De-duplicated Target Coverage Depth
10 ng 25 ng 50 ng 100 ng 200 ng 500 ng
生殖細胞と体細胞の変異解析が可能
インプット量の異なるヒトゲノムDNAから濃縮とライブラリー調製を行い、シーケン スリード数に対する平均深度をプロットした。イルミナMiSeqにて2 × 75 bpのシー ケンスを行った。PCR duplicateはUMIでフィルター、アライメントはBWA-MEMで 行った。オーダーインフォメーション
製品名 製品番号 容量 希望小売価格
NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panel
E6627S 8 rxns ¥102,400
E6627L 24 rxns ¥288,000 E6627X 96 rxns ¥1,100,000
* 各サイズに応じたインデックス・プライマーが付属
E6627S：8種類、E6627L：24種類、E6627X：96種類
NEBNext Direct Custom Ready Panel
NEBNext Direct Custom Ready Panelは約850遺伝子*より必要な遺伝子のみを選択できるカスタム・エクソーム・パネルです。選択した 遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブによりターゲット領域を濃縮してライブラリー調製をすることが可能です。また個々のカ スタムパネルはNEBでライブラリー調製とシーケンスによる性能評価を行い、成績書と共にお届けするため、信頼性の高いパネルをご 利用いただけます。 * 2018年１２月時点での遺伝子数
特長
• 約850遺伝子より必要な遺伝子を選択してカスタムパネルを デザイン • 10 ng – 1 µgのDNAよりライブラリー調製• 分解が進んだFFPE DNAやctDNAサンプルにも対応
• カスタムパネルは個別にNEBで性能評価、信頼性の高いパ ネルを提供 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Percent (%) 1 gene (3 kb) 10 gene (30 kb) 25 gene (70 kb) 50 gene (150 kb) 100 gene (280 kb) > 25% of Mean Coverage % Selected % Aligned
様々なサイズのパネルで優れた性能を発揮
様々なサイズのパネル（1、10、25、50、100遺伝子）のデータを比較した結果、 パネルのサイズに関わらず優れた性能を発揮することが示された。100 ngのDNA を使用してライブラリー調製を行い、イルミナ・ペアエンドシーケンス（150 bp × 2） で解析した。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 50 ng 100 ng DNA Input 200 ng 500 ngPercent of 2% Variants Called
25 ng
1 gene (3 kb) 10 gene (30 kb) 25 gene (70 kb) 50 gene (150 kb) 100 gene (280 kb)
様々な
DNA
インプット量とパネルサイズでも
高感度で変異検出
様々なDNAインプット量とパネルサイズのデータを比較した結果、すべてにおい て高感度で変異検出ができることが示された。24種類のHapMapサンプルを2％ のvariant allele frequency（VAF）になるように混合、各量のDNAインプットを使用 してターゲット・エンリッチメントとライブラリー調製を行った。イルミナ・ペアエン ドシーケンス（150 bp × 2）の後、Muttect and Vardict variant calling algorithmsで変 異解析した。
オーダーインフォメーション
希望小売価格 合計サイズ E6631S （8 rxn） E6631L （24 rxn） E6631X （96 rxn） 0 – 25 kb ¥122,000 ¥354,000 ¥1,179,000 26 – 50 kb ¥133,000 ¥388,000 ¥1,292,000 51 – 100 kb ¥162,000 ¥473,000 ¥1,572,000 100 – 200 kb ¥191,000 ¥557,000 ¥1,853,000 200 – 250 kb ¥220,000 ¥641,000 ¥2,134,000 250 – 500 kb ¥261,000 ¥760,000 ¥2,527,000 500 kb – 1 Mb ¥290,000 ¥844,000 ¥2,808,000 1 – 1.5 Mb ¥319,000 ¥928,000 ¥3,089,000 * 各サイズに応じたインデックス・プライマーが付属E6631S：8種類、E6631L：24種類、E6631X：96種類
納品 製造および パネル評価 ご注文 お見積り
Bed File
ご確認 確認メール お受け取りカスタムパネルお申込みの流れ
Step 1
ウェブサイトのお申込みページ（お見積り依頼フォーム）*よりお申込みください。 Page 1：約850遺伝子から必要な遺伝子を選択 Page 2：キットサイズ（8, 24, 96反応）とキット数量を入力 Page 3：ご連絡先情報を入力Step 2
フォームからお申込みいただいた後、以下内容が記載されたメールが届きます。 • 受付番号 • ターゲット遺伝子総サイズ • パネル名 • ターゲット遺伝子リストStep 3
お申込みいただいたカスタムパネルのお見積りおよびBed Fileを弊社よりお送りします。Step 4
お見積りの内容で販売店にご注文ください。Step 5
カスタムパネルの製造を行います。製造したパネルはライ ブラリー調製とシーケンスによる性能評価を行います。Step 6
販売店より納品となります（ご注文後、2 – 3週間）。 弊社ウェブサイトのお申込みページより必要な遺伝子をご選択、弊社からの見積書およびBed Fileをご確認いただいた後に、ご注文い ただく流れとなります。お申込みの詳細は弊社ウェブサイトに掲載されていますので、合わせてご参照ください。ご不明な点がござい ましたら弊社テクニカルサポートまでお気軽にお尋ねください。 お問合せ お申込み 選択リストにご希望の遺伝子がない場合には 弊社テクニカルサポートまでお問合せください。 カスタムパネルの性能評価の結果も提出 性能評価された 信頼性の高いパネルをお届けします。 * www.neb.com/CustomReadyPanelFormNEBNext Direct
カスタムパネル
New England Biolabs®, NEB® and NEBNEXT® are registered trademarks of New England Biolabs, Inc.
NEBNEXT DIRECT™ is a trademark of New England Biolabs, Inc.
DIRECTED GENOMICS™ is a trademark of Directed Genomics, LLC.
NEBNext Direct遺伝子パネルは研究用限定です。診断には使用できません
