身に着けよう！微生物検査の基本スキル
用手法による同定法
日本大学医学部附属板橋病院 谷道由美子 東京都臨床検査技師会 微生物検査研究班研修会 2018.05.18グラム陽性球菌
カタラーゼ試験 コアグラーゼ試験 PYR試験 ランスフィールド分類 胆汁溶解試験 オプトヒンテスト CAMPテストグラム陰性桿菌
確認培地による同定 （腸内細菌科） 抗血清スライド凝集試験グラム陽性球菌の同定
グラム陽性球菌 カタラーゼ（+） カタラーゼ（－） 6.5％NaCL(+） or グルコース発酵 6.5％NaCL(ｰ） or グルコース非発酵 コアグラーゼ（+） コアグラーゼ（ｰ） 6.5％NaCL（＋） or 胆汁エスクリン（＋） 6.5％NaCL（－） or 胆汁エスクリン（－） 溶血性 α溶血 β溶血 γ溶血 オプトヒン(+) 胆汁溶解(+) オプトヒン(ｰ)胆汁溶解(ｰ) バシトラシン(+) バシトラシン(ｰ) CNS S. aureus γ-Streptococcus α-Streptococcus S. pneumoniae S. pyogenes S. agalactiae Enterococcus sp. Micrococcus sp. CAMPテスト(＋) CAMPテスト(ｰ) β-Streptococcusカタラーゼ試験
目的：過酸化水素分解酵素（カタラーゼ）の産生の有無を検査 原理：過酸化水素を加水分解する菌は発泡する 方法：3％過酸化水素水に被検菌を爪楊枝等で混合する 陽性 ・Staphylococcus 属 ・Micrococcus 属 ・Bacillus 属 ・Corynebacterium 属 ・Listeria monocytogenes 注意点：血液成分によって偽陽性になる 判定：陽性･･･気泡が発生 陰性･･･無反応（数十秒後の微細な気泡は陰性とする） 陰性 ・Streptococcus 属 ・Enterococcus 属 ・Clostridium 属 ・Lactobacillus 属 ・Arcanobacterium/Trueperellaコアグラーゼ試験
（試験管法）
目的：遊離コアグラーゼの検出 原理：コアグラーゼは菌が増殖過程に菌体外に分泌されるタンパク質で、ヒ トや動物の血漿中に含ませるプロトロンビン類似物質(CRF)に作用し て血漿凝固を起こさせる。 方法：試験管にウサギ血漿0.5mLを分注し被検菌を混濁させる。37℃で3時 間培養後、試験管を傾けフィブリン形成の有無を確認する。陰性の場 合は24時間まで延長し判定する。 注意点・ウサギプラズマ ❛ 栄研 ❜（栄研化学）は乾燥プラズマの溶解に滅菌生理 食塩水7mLを用いるが、BHI brothを用いると微弱産生菌の検出も可能 との報告がある。 ・長時間37℃におくと凝固物が再び溶解する場合がある。 ・反応時間が24時間を超えると非特異的な凝固がみられることがある。 判定：陽性･･･血漿凝固あり、またはフィブリン形成あり 陰性･･･血漿凝固なし、またはフィブリン形成なしコアグラーゼ試験
（ラテックス凝集）
目的：クランピング因子とプロテインAの検出 原理：2種類あり ①フィブリノーゲンとクランピング因子、プロテインAに対する抗体(IgG) をラテックス粒子に感作させた試薬を用いた凝集法 ②フィブリノーゲン、クランピング因子、プロテインA、およびS. aureus の莢膜多糖体血清型5 と血清型8 に対するモノクローナル抗体を感作さ せたラテックス粒子を用いた凝集法 方法：メーカー添付書に従い実施する。 ①・スタフォレックス（三菱化学）・スタフィロLA（デンカ生研） ・PS ラテックス（栄研化学）②・Pastrex Staph plus（BioRad）
・ドライスポットスタフィテクトプラス（関東化学） 注意点：①は陰性コントロールが無く②は陰性コントロール有 まれにS.aureus で凝集が認められない株がある 判定：陽性･･･凝集が認められる 陰性･･･凝集が認められない
コアグラーゼ陽性菌
菌種 コアグラーゼ ラテックス PYR 分離源S. aureus subsp. aureus + + － ヒト・動物
S. intermedius + ⅾ + ハト
S. pseudintermedius + － + イヌ・ネコ・ヒト
S. schleiferi subsp. coagulans + － + イヌ・ネコ
S. hyicus ⅾ － － ブタ・ニワトリ
S. lugdunensis － + + ヒト
S. schleiferi subsp. schleiferi － + + ハト・イヌ・ネコ・ヒト
Manual of clinical microbiology 10thedition より一部抜粋および改変 +：90％以上陽性 －：90％以上陰性 ｄ：11～89％が陽性
PYR試験
目的：ピロリドニルアリルアミダーゼ (PYR) の産生の有無を検査する 原理：PYR産生菌はL-ﾋﾟﾛﾘﾄﾞﾆﾙ-βﾅﾌﾁﾙｱﾐﾄﾞを分解しβﾅﾌﾁﾙｱﾐﾝを生成する 方法：試薬(p-ｼﾞﾒﾁﾙｱﾐﾉｼﾝﾅﾑｱﾙﾃﾞﾋﾄﾞ)と結合すると紫色に発色する 注意点：検査には非選択培地を用いる 判定：陽性･･･濃ピンク～紫色を呈する 陰性･･･無色～薄いピンク 陽性 ・Streptococcus pyogenes ・Enterococcus 属 ・NVS(Abiotrophia/Granulicatella) ・Citrobacter 属 陰性 ・Streptococcus agalactiae ・Streptococcus equisimilis ・Streptpcoccus bovis group ・Streptococcus anginosus groupなど多くの連鎖球菌 ・Salmonella 属 ・Escherichia coli
ランスフィールド分類
目的：レンサ球菌（主に溶連菌）を群別により分類する 原理・方法： 細胞壁多糖体を血清型により分類したもの。 抗血清を用いたラテックス凝集法の検査キットが市販されてる。 メーカー添付書に従い実施する。 判定：凝集が認められた血清型を陽性と判定する 菌種 ランスフィールド分類 PYR Streptococcus pyogenes A + Streptococcus agalactiae B －Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis G・C・A －
Streptococcus canis G －
Streptpcoccus anginosus group A・C・G・F・凝集(－) －
Enterococcus spp. D +
胆汁溶解試験
目的：肺炎球菌とそれ以外のα-streptococcus属を鑑別 原理：肺炎球菌は胆汁成分により自己融解する 方法：①試験管法･･･2mL生理食塩水に被検菌を濃厚に浮遊させ2等分する。 片方に10％デオキシコール酸Na溶液を数滴滴下。もう片方に生理 食塩水を数滴滴下し、35℃、30分反応させる。 ②迅速推定法･･･血液寒天培地上の被検菌のｺﾛﾆｰに2％デオキシコール 酸Na溶液を1滴滴下。35℃、10～15分反応させる。 注意点：試験管法の場合コンタミネーションに注意(透明化が不十分になる) 判定：①陽性･･･デオキシコール酸Naを添加した試験管が透明化 陰性･･･変化なし ②陽性･･･ｺﾛﾆｰ消失 陰性･･･変化なしオプトヒンテスト
方法：被検菌を血液寒天培地に塗布し5µgオプトヒンディスクを置く 35℃、5％CO2環境下で一晩培養後、阻止円径を計測する 注意点 • 稀にオプトヒン耐性株がある。 • 各メーカーの添付書の培養条件に「CO2環境下」の記載がない。 • 判定基準がメーカーによって異なる。 • 好気条件下の培養では S. pseudopneumoniae の判定ができない。 • 判定が紛らわしい場合は胆汁溶解試験を実施する。 判定：陽性･･･阻止円径≧14mm ⇒ 肺炎球菌 陰性･･･阻止円径＜14mm ⇒ 肺炎球菌以外のα-streptococcus属 目的：肺炎球菌とそれ以外のα-streptococcus属を鑑別 原理：肺炎球菌はオプトヒンに対して感受性を示すオプトヒンテスト
※メーカーによる比較 メーカー ディスク直径 含有量OP 培養条件 判定基準 栄研化学 6.5mm 5µg 35～37℃ 18～24時間 陽性：≧13mm 陰性：≦12mm 日水製薬 8mm 10µg 35～37℃ 16～24時間 陽性：≧18mm 陰性：≦14mm 15～17mmの場合 イヌリン分解能、胆汁 溶解試験等で総合的に 判定する 日本BD 6mm 5µg 35±2℃ 24時間 陽性：≧14mm 陰性：＜14mm 阻止円6～14mmの間 は胆汁溶解能が認めら れた場合肺炎球菌と推 定。 炭酸ガス培養では発育 促進するが阻止円が小 さくなる。 柄澤利子：臨床と微生物 vol44：525-529.2017. より引用CAMPテスト
目的：細菌のサイクリックAMP(cAMP)因子の産生の有無を検査する 原理：cAMP因子産生菌はS. aureusが産生するβ-ヘモリジンと相乗的に作 用してヒツジ赤血球の溶血を増強させる 方法：ヒツジ血液寒天培地の中央にS. aureus (β-ヘモリジン産生株)と一直 線に塗布。さらにS. aureus に触れないように被検菌を直角に一直線 に塗布。35℃で一晩培養後判定。注意点：Staphylococcus aureus ATCC 25923を用いるとよい α-ﾍﾓﾘｼﾞﾝ産生の強いS. aureus では判定が紛らわしい場合がある 判定：陽性･･･矢じり状の溶血帯の増強あり 陰性･･･溶血帯の増強無し 陽性 ・Streptococcus agalactiae ・Listeria monocytogenes 陰性 ・S. agalactiae 以外の溶連菌
CAMP反応とCAMP抑制反応
L. monocytogenes S. agalactiae Arcanobacterium haemolyticum S. aureus ATCC25923 CO2環境下一晩培養後CAMP反応とCAMP抑制反応
L. monocytogenes S. agalactiae Arcanobacterium haemolyticum S. aureus ATCC25923 冷蔵で一晩放置後腸内細菌同定のフローチャート
IPA(＋) H2S(＋)H2S(－) ・Providencia spp.・Morganella morganii
・Proteus spp. H2S(＋) H2S(－) ・Salmonella spp. ・Salmonella Typhi ・Citrobacter freundii ・Edwardsiella tarda ・Klebsiella spp. ・Serratia spp. ・Enterobacter spp. ・Escherichia coli ・Shigella spp. ・Citrobacter spp. ・Salmonella ParatyphiA ・Yersinia spp. ・Plesiomonas shigelloides VP(－) VP(＋) IPA(－)
①
②
③
④
確認培地（多目的培地）
TSI培地・KL培地・IKL培地 SIM培地 LIM培地 微生物検査ナビ第2版 栄研化学 より画像引用IPA（+）H
2
S（+）の菌
選択枝：Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Proteus penneri
(H2S産生30％）白糖分解菌は？
P. vulgaris
P. vulgaris P. penneri
インドール(+)菌は？
※鑑別のポイント
IPA H2S インドール 白糖分解 P. vulgaris + + + + P. mirabilis + + － － P. penneri + d － + SIMIPA（+）H
2
S（+）の菌
TSIInd Mot VP Cit Ly Orn
斜面 高層 GAS H2S
P. vulgaris A A + + + + － － － －
P. mirabilis K A + + － + ｄ + － +
P. penneri A A ｄ ｄ － + － － － －
TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn
乳糖 白糖 Glu GAS H2S
P. vulgaris 2 97 100 85 95 98 95 0 15 0 0
P. mirabilis 2 15 100 96 98 2 95 50 65 0 99
P. penneri 1 100 100 45 30 0 85 0 0 0 0
K：アルカリ化 A：酸性化 ｄ：株によって異なる
シモンズクエン酸(+)菌は？
IPA（+）H
2
S（－）の菌
選択枝：Providencia spp.
Morganella morganii
Proteus penneri
（H2S非産生70％）Providencia spp. M. morganii
Providencia spp.
インドール(+)菌は？※鑑別のポイント
IPA H2S インドール Cit Providencia + － + + M. morganii + － + － P. penneri + d － － SIMIPA（+）H
2
S（－）の菌
TSIInd Mot VP Cit Ly Orn
斜面 高層 GAS H2S
P. rettgeri K A ｄ － + + － + － －
M. morganii K A + － + + － － － +
P. penneri A A ｄ ｄ － + － － － －
TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn
乳糖 白糖 Glu GAS H2S
P. rettgeri 5 15 100 10 0 99 94 0 95 0 0
M. morganii 1 0 99 90 20 95 95 0 0 1 95
P. penneri 1 100 100 45 30 0 85 0 0 0 0
K：アルカリ化 A：酸性化 ｄ：株によって異なる
Manual of clinical microbiology 8thedition より一部抜粋
IPA（－）H
2
S（+）の菌
選択枝：Salmonella Typhi
1)Salmonella spp.
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
1) Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
Edwardsiella tarda
インドール(+)菌は？※鑑別のポイント
Citrobacter freundii
リジン(－)菌は？Salmonella Typhi
Salmonella spp.
しっかり性状を覚える
SIMIPA（－）H
2
S（+）の菌
TSIInd Mot VP Cit Ly Orn 斜面 高層 GAS H2S S. Typhi K A － +ｗ － + － － + － Salmonella spp. K A + + － + － + + + C. freundii A A + + － + － + － － E. tarda K A + + + + － － + + TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn 乳 糖 白 糖 Glu GAS H2S S. Typhi 1 0 100 0 97 0 97 0 0 98 0 Salmonella spp. 1 1 100 95 95 1 95 0 95 98 97 C. freundii 78 89 100 78 78 33 89 0 78 0 0 E. tarda 0 0 100 100 100 99 98 0 1 100 100
Manual of clinical microbiology 8thedition より一部抜粋 K：アルカリ化 A：酸性化 ｄ：株によって異なる 菌種 性状 特徴 ･Salmonella Typhi • 3類感染症 • 運動性(+) • H2S産生量は微量 • オルニチン(－) • Vi抗原（+） • O9群（+） ･Salmonella spp. • 運動性（+） • ガス産生 • オルニチン（+） • O抗原とH抗原の組み合 わせにより多数の血清 型が存在 ･Salmonella Paratyphi A • 3類感染症• 運動性（+） • H2S産生菌は10％ • ガス産生 • オルニチン（+） • O2群（+）
Salmonella 属の性状
TSI SIM VP Cit Ly
IPA（－）H
2
S（－）の菌
選択枝：Klebsiella spp.
Serratia spp.
Enterobacter spp.
Escherichia coli
Shigella spp.
Salmonella Paratyphi A
2）Citrobacter spp.
Yersinia spp.
Plesiomonas shigelloides
VP(＋)
VP(－)
IPA（－）H
2
S（－）
VP（+）
の菌
選択枝：Klebsiella spp.
(K. pneumoniae、K. oxytoca)Serratia spp.
(S.marcescens)Enterobacter spp
.(E.aerogenes、E. cloacae)※鑑別のポイント
運動性(－)菌は？ リジン(－)菌は？ インドール(+)菌は？E. aerogenes とS. marcescens の鑑別は？
どんな培地を使えばいい？
Klebsiella spp.
Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae
IPA（－）H
2
S（－）
VP（+）
の菌
TSIInd Mot VP Cit Ly Orn 斜面 高層 GAS H2S K.pneumoniae A A + － － － + + + － K.oxytoca A A + － + － + + + － S.marcescens A A d － － + + + + + E.aerogenes A A + － － + + + + + E.cloacae A A + － － + + + － + TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn 乳糖 白糖 Glu GAS H2S K.pneumoniae 98 99 100 97 0 0 0 98 98 98 0 K.oxytoca 100 100 100 97 0 99 0 95 95 99 0 S.marcescens 2 99 100 55 0 1 97 98 98 99 99 E.aerogenes 95 100 100 100 0 0 97 98 95 98 98 E.cloacae 93 97 100 100 0 0 95 100 100 0 96
Manual of clinical microbiology 8thedition より一部抜粋 K：アルカリ化 A：酸性化 ｄ：株によって異なる
IPA（－）H
2
S（－）
VP（－）
の菌
選択肢：Escherichia coli
Shigella spp.
Salmonella Paratyphi A
Citrobacter spp.（C. koseri )
Y. enterocolitica、Y. pseudotuberculosis
Plesiomonas shigelloides
※鑑別のポイント
オキシダーゼ(+)菌は？ シモンズクエン酸(+)菌は？ リジン(+)菌は？P. shigelloides
P. shigelloides
E. coli
C. koseri
IPA（－）H
2
S（－）
VP（－）
の菌
TSIInd Mot VP Cit Ly Orn 斜面 高層 GAS H2S E. coli A A + － + + － － + d Shigella spp. K A － － d － － － － d S. ParatyphiA K A + － － + － － － + C. koseri ｄ A + － + + － + － + P. shigelloides K A － － + + － － + + TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn 乳糖 白糖 Glu GAS H2S E. coli 95 50 100 95 1 98 95 0 1 90 65 Shigella spp. 0-2 0-1 100 0-3 0 0-50 0 0 0 0 0-98 S. ParatyphiA 0 0 100 99 10 0 95 0 0 0 95 C. koseri 50 40 100 98 0 99 95 0 99 0 99 P. shigelloides 80 0 100 0 0 100 95 0 0 100 99
Manual of clinical microbiology 8thedition より一部抜粋 K：アルカリ化 A：酸性化 ｄ：株によって異なる
Shigella 属の性状の違い ①
亜群 血清型（O抗原） Ａ群 1～13血清型 Ｂ群 6種類の型抗原と3組の群抗原の組み合わせにより決定 Ｃ群 1～18血清型 Ｄ群 血清型は一つ（Ⅰ相、Ⅱ相あり） ※血清型の分類亜群 乳糖 白糖 Glu GAS H2S Ind Mot VP Cit Ly Orn
A S. dysenteriae － － + － － d － － － － － B S. flexneri － － + － － d － － － － － C S. boydii － － + － － d － － － － － D S. sonnei (＋) (＋) + － － － － － － － + 既存の血清型で分類できない 新血清型赤痢が1985年以降、 129例（輸入例115例、国内例 14例）報告されている +：90％以上陽性 －：90％以上陰性 (＋)：遅れて陽性 ： 菌株（血清型）によって反応が異なることがある
Shigella 属の性状の違い ②
菌種 性状 特徴 ･S. dysenteriae ･S. flexneri ･S. boydii • 3類感染症 (直ちに届出) • S. dysenteriae： 血清型1のみが志賀毒 素(Stx1)を産生する • S. flexneri 血清型6 S. boydii 血清型13と 14は少量のガス産生株 あり • S. sonnei ：乳糖白糖 遅分解（2日目以降に 遅れて分解） ･S. sonnei または S. flexneriYersinia spp. の培養温度による性状の違い
温度 TSI
Ind Mot VP Cit Ly Orn 斜面 高層 GAS H2S Y. enterocolitica 37℃ A A － － d － － － － + 25℃ + + Y. pseudo-tuberculosis 37℃ K A － － － － － － － － 25℃ + － Shigella spp.(D群以外) K A － － d － － － － － ※Shigella 属と性状が似ているが鑑別は容易 ・Yersinia 属は遅発育菌（至適発育温度25～28℃） ・ウレアーゼ陽性（Yersinia pestisは陰性）
