序 文
深在性真菌症の診断が原因真菌を感染巣から直 接分離することで確定することは他の感染症と同 様である．しかし本症を発症する宿主では全身状 態が悪く出血傾向が存在したりするため，積極的 に侵襲的検査を施行し難く，従って原因真菌を分
離・同定することが困難な場合が多い．そこでわ が国の臨床現場では，真菌抗原検出法や （1→3） -
β- D-グルカン（
β-グルカン）測定法などが広く用いら れ，補助診断法としての一定の評価を受けてい る
1）2）．
血漿
β-グルカン測定法は 1995 年にわが国の生 化学工業（株）により初めて発表されたリムルス 反応を応用した深在性真菌症の診断法
3）4）である．
その後，前処理法や測定方法の異なるキットが順
アルカリ処理―発色合成基質カイネティック法による血漿中（1→3） - β -D-グルカン測定における非特異反応出現とその対策
川崎医科大学呼吸器内科
吉田耕一郎 二木 芳人 毛利 圭二 宮下 修行 小橋 吉博 松島 敏春
（平成 15 年 10 月 29 日受付）
（平成 16 年 4 月 20 日受理）
臨床検体を用いて，アルカリ処理―発色合成基質カイネティック法による血漿中（1→3）-β-D-グルカ ン（β-グルカン）測定における非特異反応の出現状況を調査し，その対策を考案した．対象は 2002 年 1 月から 3 月の期間に川崎医科大学附属病院で血漿中β-グルカンが測定された患者 232 例の血漿 584 検 体．β-グルカンの一種である laminaran oligosaccharides をβ-グルカン測定系に添加することによりリム ルス反応を抑制する系を用いてβ-グルカン値を測定した．この系による測定で算出された数値はβ-グル カン以外の妨害因子による非特異反応の結果と判定できる．また，本法の反応タイムコースの吸光度変 化率から独自に設定した非特異反応インデックスを用いて，反応タイムコースが非特異反応の影響を受 けているか否かの識別を試みた．非特異反応は検討した 156 検体中，81 検体（51.9％）に認められた．こ のうち過半数で非特異反応は 9.9pg!ml の低値に留まっていた．一方，非特異反応インデックスについて は，非特異反応の有無を識別するカットオフ値を 0.5 と設定した場合，感度 88.9％，特異度 73.7％，陽性 適中率 93.5％，陰性適中率 60.9％ の成績が得られ有用であると考えられた．非特異反応インデックスの 使用により，アルカリ処理―発色合成基質カイネティック法の問題点であった非特異反応検出はおおよ そ判別可能であり，非特異反応に由来した偽陽性による不必要な抗真菌療法を回避できると思われる．
しかし，今後は本法の非特異反応検出の根本的問題解決に向け，さらに検討が行われなければならない．
〔感染症誌 78：435〜441，2004〕
要 旨
別刷請求先：（〒701―0192）岡山県倉敷市松島 577 川崎医科大学呼吸器内科 吉田耕一郎
fungal infection, serodiagnosis,（1→3）- β-D-glucan, non-specific reaction Key words：
次開発され，現在では 5 種類のキットが臨床応用 可能となっている．臨床で主に用いられているも のにファンギテック G テスト MK
5）（アルカリ処 理―発色合成基質カイネティック法；アルカリ処 理―カイネティック法，生化学工業（株） ，東京）
と
β-グルカン テストワ コ ー
6）7）（希 釈 加 熱―比 濁時間分析法；比濁法，和光純薬工業 （株） ，大阪）
の 2 種類がある．各々，測定手技や感度，特異度 などに特徴を有しており，検体によっては測定値 や定性結果に乖離が認められ
8），臨床判断に混乱 を招く原因となることがある．私たちの研究はこ のような臨床的問題点がきっかけとなっている．
私たちはこの原因の一つとして，
β-グルカン測定 における非特異反応出現の有無に焦点を合わせ検 討を重ねてきた
9）10）．その結果，アルカリ処理―カ イネティック法では
β-グルカン以外の非特異反 応が高頻度に出現することが明らかとなり，この ために両者の測定結果に乖離が生じている可能性 を主張してきた．ただし，現時点では高グロブリ ン血症の患者から採取された検体や溶血検体で非 特異反応の見られることが知られている
11）もの の， その原因物質の実態はまだ確認されていない．
深在性真菌症発症のハイリスク患者において血 漿中
β-グルカン値を，モニタリングしておき，早 期診断のために用いられることも多い．この際，
治療は遅滞なく開始されなければならないが，非 特異反応検出による
β-グルカン偽陽性のための 不必要な抗真菌療法は避けなければならない．
私たちは血漿中
β-グルカン測定方法を検討す ることにより，アルカリ処理―カイネティック法 における非特異反応出現頻度を明らかにし，さら に臨床現場で簡便に非特異反応の存在を認知する 方法について検討した．
材料と方法
1．対象患者と検体
2002 年 1 月から 3 月までの 3 カ月間に川崎医 科大学附属病院で深在性真菌症を疑われて，もし くは治療効果判定目的で血漿中
β-グルカンが測 定された患者 232 例，584 血漿検体を対象とした．
男性 120 例，女性 112 例， 年齢は 1 歳から 92 歳迄，
平均 62.7±17.0 歳であった．非特異反応の出現が
確認された症例では基礎疾患，真菌感染症の有無 など臨床背景を調査した．臨床経過が深在性真菌 症として合致し，組織あるいは無菌検体で原因真 菌が確認されたものを確定診断例と判断した．ま た，臨床経過が深在性真菌症として合致し，真菌 抗原陽性， もしくは開放性材料で原因真菌が分離，
または塗沫陽性であったものを疑い例と判断し た．
2．
β-グルカン測定
アルカリ処理―カイネティック法の添付文書に 記載された操作手順に従って，血漿中の
β-グルカ ンを測定した．基準値はアルカリ処理―カイネ ティック法の添付文書の記載に従い 20pg
!ml と した．
3．非特異反応識別
β
-グ ル カ ン の 一 種 で あ る laminaran oligosac- charides（LO）を 10
µg
!ml の濃度で反応系に添加 することにより，リムルス反応が完全に停止し，
β
-グ ル カ ン の 検 出 さ れ な い こ と が 知 ら れ て お り
12），私たちが以前の検討
9）で用いた CM カード ランと同様の効果が得られる．すなわち LO 添加 下で本法の測定下限値である 3.9pg
!ml 以上の測 定値が算出された場合には，β-グルカン以外の非 特異反応が出現した結果と判定できる．今回，私 たちは対象検体のうち 20pg
!ml 以上の測定値を 示した検体について，LO 添加によりリムルス反 応を停止させ， 非特異反応出現の有無を検討した．
4．非特異反応タイムコース判別の試み （非特異 反応インデックスの設定）
非特異反応の出現する検体ではカイネティック
法で測定する本法の反応タイムコース初期の吸光
度変化率が大きいことが知られており，非特異反
応出現の有無はタイムコースを観察することで確
認可能である
13）．しかし，肉眼による吸光度変化
率の確認は困難な場合が多く，また，臨床現場で
の反応タイムコース観察作業は煩雑であり実際的
ではない． そこで私たちは 30 分の全反応時間のう
ち，反応初期の 0.5〜3.5 分の吸光度変化率に着目
し，本法の通常の演算時間である 7.0〜30.0 分の吸
光度変化率と比較することとした．各々の吸光度
変化率は演算対象時間の各測定時点の時間を独立
変数とし，各時点の吸光度を従属変数として最小 自乗法により求めた回帰曲線の傾きで表した．反 応タイムコースを図示して非特異反応を観察した 論文
11）は既にあるが，私たちの方法のように吸光 度変化率を数値化して論じた報告はこれまでにな い．Fig. 1 に示した様に非特異反応のない場合に は 7.0〜30.0 分 の 吸 光 度 変 化 率（A）が 0.5〜3.5 分の吸光度変化率（B）を上回る．これに対して非 特異反応が認められる場合には 0.5〜3.5 分の吸光 度変化率（B）が 7.0〜30.0 分の吸光度変化率（A）
を上回ることとなる．これを基に独自に B
2!A の 計算式を考案し，この計算式で求められる数値を 非特異反応インデックスと呼称することとした．
本インデックスを非特異反応タイムコースの判別 に用い， カットオフ値を仮に 0.5 以上， 1.0 以上，
1.5 以上， 2.0 以上， 2.5 以上の 5 段階で設定した．
各々のカットオフ値における感度，特異度，陽性 適中率，陰性適中率を算出し，本インデックスが 非特異反応の出現を示す指標として使用できるか 否か，あるいはどの程度の値を基準値として設定
するのが妥当であるかを検討した．
成 績
1．血漿中
β-グルカン値
232 例から各々に単回もしくは複数回採取され ていた 584 検体を測定した．159 例（324 検体）で は 1 度も基準値以上の陽性結果を示さなかった．
他方，73 例では少なくとも 1 回以上陽性結果を示 していた．この 73 例から採取されていた検体は 260 検体であり，このうち基準値未満の測定値を 示したものは 101 検体，20pg
!ml の基準値以上の 測定値を示したものは 159 検体であった．
2．LO 添加による非特異反応識別試験
アルカリ処理―カイネティック法の基準値 20 pg
!ml 以上の測定値を示した 159 検体のうち，LO 添加による非特異反応識別試験を施行可能であっ たものは 156 検体（73 例）であった．このうち 75 検体において LO 添加時測定値は 0〜3.8pg
!ml の 範囲内にあり，アルカリ処理―カイネティック法 の測定下限値以下の数値であった．しかし，残り の 81 検体（51.9％，42 例）では LO 添加時にも測
Fig. 1 The absorbance changing rate A（7.0―30.0 minutes）is larger than the absor-bance changing rate B（0.5―3.5 minutes）in the reaction time without non-specific reaction, while the absorbance changing rate B is lager than absorbance changing rate A in the reaction time course with non-specific reaction.
Table 1 details of 81 samples with non-specific reaction
＞ 20.0 pg/mL 10.0―19.9
pg/mL 3.9―9.9
pg/mL Value of non-
specific reaction
16 16
49 Number of samples
11（68.8%）
7（43.8%）
17（34.7%）
Number of samples with discrepancy in qualitative result between value measured without LO and true values of β-glucan.（%）
定下限値 3.9pg
!ml を上回る数値を呈しており，非 特異反応の出現が確認された．このうち非特異反 応分よる測定値が 3.9〜9.9pg
!ml の範囲であった ものは 49 検体（60.5％），10〜19.9pg
!ml の範囲で あったものが 16 検体 （19.8％） ，基準値の 20pg! ml 以上を上回っていたものが 16 検体（19.8％）で あった．
真の
β-グルカン値は実測値から非特異反応算 出分を差し引いて求めることができる．Table 1 に示した様に，非特異反応出現によって実測値と 真の
β-グルカン値の定性結果に乖離が生じたも のは，非特異反応算出分の数値が 3.9〜9.9pg
!ml にあった 49 検体中 17 検体，34.7％，10〜19.9pg
!ml の範囲であった 16 中 7 検体，43.8％，20pg! ml 以上を上回っていた 16 中 11 検体，68.8％ であっ た．
非特異反応が検出された 42 例（81 検体）の内訳 は男性 23 例，女性 19 例であった．年齢は 25〜85 歳，平均 66.9±12.9 歳であった．基礎疾患は血液疾 患 11 例， 膠原病 8 例 COPD4 例， 固形癌 3 例，
糖尿病 3 例，心疾患 3 例， 腎不全 3 例， 肝硬変 2 例，
陳旧性肺結核 2 例，その他 5 例と多岐にわたって いた（重複あり） ．また，42 例中，11 例で真菌感 染症の存在が確認，もしくは疑われた．その内訳 は確定診断例では侵襲性肺アスペルギルス症 1 例，慢性壊死性肺アスペルギルス症 2 例，疑い例 では尿路カンジダ症 2 例，肺カンジダ症 2 例，創 部カンジダ症 1 例，カンジダ感染症 3 例であった．
3．非特異反応タイムコース検索の試み 非特異反応を示す 81 検体が採取された 42 例か らは，非特異反応のない検体も含め計 155 検体が 採取されていた．このうち測定値が 20pg! ml 未満
であったため，LO 添加による非特異反応識別試 験が施行されなかったものは 55 検体で，残りの 100 検体には LO 添加非特異反応識別試験が行わ れていた．この 100 検体を対象とし，インデック スによる非特異反応タイムコースの判別を試みた 結果を Table 2 に示し，設定したインデックスの カットオフ値別に非特異反応タイムコース判別の 感度，特異度，陽性適中率，陰性適中率を Table 3 に示した．今回設定した最小のカットオフ値 0.5 の場合，感度 88.9％，特異度 73.7％，陽性適中率 93.5％，陰性適中率 60.9％ の成績であり，最大の カットオフ値 2.5 では感度 43.2％， 特異度 100％，
陽性適中率 100％，陰性適中率 29.2％ が算出され た．
考 察
血漿
β-グルカン測定はわが国の深在性真菌症 診療において欠かすことの出来ない検査法であ る．1995 年にファンギテック G テスト
4）（過塩素 酸処理―エンドポイント測定法， 生化学工業 （株） ， 東京）の臨床応用が始まったが，この方法は測定 原理から ST 合剤の影響を受ける上，操作がやや 煩雑
13）で大量検体処理には不向きであった．アル カリ処理―カイネティック法はこの点を克服し，
改良型測定キットとして開発された．しかし，本 法は優れた感度を有するものの非特異反応の出現 頻度が高く
9）10），臨床経過と合致しない偽陽性が しばしば認められる
9）とされてきた． 現時点では非 特異反応の原因物質が十分に解明されていないた め，臨 床 現 場 に お い て ア ル カ リ 処 理―カ イ ネ ティック法で測定された
β-グルカン値の評価に 混乱が生ずる場合もある．
今回の検討では非特異反応は 51.9％ に確認さ
Table 2 Results of the distinguish of non-specific reaction by applying the non-specific reaction index.
Number of samples that qualitative results change from positive into
negative by subtraction of non- specific reaction values Number of samples
with Non-specific raction Number of
samples Non-specific
reaction index
1 9
23
＜ 0.5
4 14
15 0.5 ≦ , ＜ 1.0
5 8
9 1.0 ≦ , ＜ 1.5
3 6
7 1.5 ≦ , ＜ 2.0
1 9
11 2.0 ≦ , ＜ 2.5
21 35
35 2.5 ≦
Table 3 The sensitivities, specificities and predictive values at each cut off values of the non-specific reaction index
Negative predictive
value Positive
predictive value Specificity
Sensitivity Cut off value
60.9%
93.5%
73.7%
88.9%
0.5
39.5%
93.5%
78.9%
71.6%
1.0
34.0%
94.3%
84.2%
61.7%
1.5
31.5%
95.7%
89.5%
54.3%
2.0
29.2%
100.0%
100.0%
43.2%
2.5
れた．これは以前，私たちが報告
9）した成績 34.9％
を上回る頻度であった．非特異反応の検出頻度は 母集団に含まれる症例によりある程度変化するも のと考えられる．しかし，今回の検討に用いた検 体は臨床現場で血漿中
β-グルカン測定目的に採 取された全ての血漿であり，母集団は意図的に選 択されたものではない．従って，この成績は日常 診療におけるアルカリ処理―カイネティック法の 非特異反応出現率の高さを示す結果と言える．過 半数の検体において非特異反応算出分は 9.9pg
!ml 以下の低値に留まっていたが，このうち非特異 反応が
β-グルカン判定結果に影響を及ぼした検 体は 34.7％ と少なからず認められた．さらに 20 pg
!ml 以上の高い非特異反応を呈したものは 16 検体と少なかったものの，このうち非特異反応が
β-グルカン判定結果に影響を及ぼしていた検体は 68.8％ と高率であった．それゆえ，非特異反応が検 出される検体を見極めることは臨床上，重要であ ると考えられる．
非特異反応の検出される検体ではタイムコース
初期に吸光度変化率の大きくなることが知られて
いる．従来，アルカリ処理―カイネティック法の
β-グルカン値算出演算時間は 2.0〜30.0 分に設定
されていたが，タイムコース初期にみられる非特
異反応の影響を除外する目的で，2000 年 9 月から
キットの製造発売元である生化学工業（株）によ
り演算時間が 7.0〜30.0 分に変更されている．私た
ちの以前の検討でも演算時間の変更により非特異
反応出現率は減少した（未発表データ）が，この
問題を解決に至らしめるまでの成績は得られな
かった．今回，私たちが考案した非特異反応イン
デックスも反応タイムコース初期の吸光度変化率
の大きさに着目して設定した．すなわち実際の
β-
グルカン値算出への関与はないものの，非特異反
応をよく反映する 0.5〜3.5 分の吸光度変化率の大
きさを二乗することで強調し，この値と通常の演
算時間 7.0〜30.0 分の吸光度変化率との比を非特
異反応インデックスと設定している．このイン
デックスにカットオフ値を設け，非特異反応を示
すタイムコースの判別を行った．今回，仮に設定
し た 5 つ の カ ッ ト オ フ 値 の う ち 0.5 で は 感 度 88.9％，特異度 73.8％ であ り 評 価 で き る 成 績 で あった．また，本インデックス考案の目的は非特 異反応タイムコースを判別することであるから，
高い陽性適中率が要求されることとなる．カット オフ値 0.5 と設定した場合，陽性適中率は 93.5％
と優れた結果が得られていた．一方，陰性適中率 は 60.9％ であったが，実測値から非特異反応算出 分を差し引くことにより定性結果が陽性から陰性 に覆ったものは 1 検体のみであり，カットオフ値 0.5 で検出できなかった非特異反応の大部分は
β- グルカン値の判定に影響を及ぼしていなかった．
以上のことから，私たちが考案した非特異反応イ ンデックスはカットオフ値を 0.5 に設定した場 合，非特異反応タイムコースの判別に有用である と考えられた．非特異反応の原因物質が完全には 解明されていない現状で，アルカリ処理―カイネ ティック法を用いて
β-グルカンを測定する場合，
ベッドサイドで本インデックスを参考として使用 することにより，
β-グルカンの偽陽性による不必 要な抗真菌療法の開始を防止できる可能性が高ま ると考えられる．
私たちの用いた非特異反応インデックスの計算 式およびカットオフ値が，臨床現場で非特異反応 タイムコースを判別するのに最適か否かは，さら に大規模な検討を行い検証する必要がある． また，
インデックスを用いた非特異反応タイムコース判 別法はアルカリ処理―カイネティック法における 非特異反応出現の根本的な問題解決にはつながら ない．
β-グルカン測定法の改善や，既に一部で検討 され始めた標準品の見直し
14），また基準値の再考 などは今後， 十分に検討されるべき領域であろう．
文 献
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Countermeasures Against Non-specific Reactions in the Measurement of
β-glucan in Plasma by Alkaline Treatment, Chromogenic Automated Kinetic Assay
Koichiro YOSHIDA, Yoshihito NIKI, Keiji MOHRI, Naoyuki MIYASHITA, Yoshihiro KOBASHI, Toshiharu MATSUSHIMA
Division of Respiratory Diseases, Department of Medicine, Kawasaki Medical School
