河川整備基金助成事業
「ウイルス遺伝子マーカーを利用した
河川水中の糞便汚染源解析法の開発」
助成番号：
26-1263-011
山梨大学大学院総合研究部
准教授 原本 英司
平成
26 年度
様式６･２ １．調査・研究 ［概要版報告書］ 助成番号 助成事業名 所属・助成事業者氏名
26-1263-011
ウイルス遺伝子マーカーを利用した
河川水中の糞便汚染源解析法の開発
山梨大学大学院総合研究部
原本 英司
助 成 事 業 の 要 旨 〔目 的〕 水環境中の糞便汚染源の解析を目的として、宿主（ヒトや動物）の糞便中に特異的に排出さ れる微生物の遺伝子を測定し、宿主別の寄与度を評価する手法がある。この微生物起源解析に おいて利用される微生物遺伝子マーカーには、大腸菌に感染するウイルスであるF 特異 RNA 大腸菌ファージ（F-RNA ファージ）や、ヒトや動物に感染するウイルスなどがあるが、現在 最も主流なものはバクテロイデスである。F-RNA ファージは、4 種類の遺伝子群（I～IV 群） それぞれが宿主特異性を有するとされているが、一方で宿主特異性に問題があるとの報告もあ り、糞便汚染源解析への利用可能性についてはさらなる検討を要する。 本事業では、現在主流の微生物遺伝子マーカーであるバクテロイデスに加えて、ウイルス系 の微生物遺伝子マーカーであるF-RNA ファージを用いることでより詳細な河川水中の糞便汚 染源解析が可能となるかを評価するため、糞便汚染源試料からの微生物遺伝子マーカーの検出 特性を把握し、さらに、複数の河川流域を対象に糞便汚染源の解析を試みた。 〔内 容〕 糞便汚染源試料として、山梨県内において、下水流入水と下水2 次処理水、コミュニティプ ラント排水を受容する河川水、畜産飼育施設の上下流地点の河川水）を採取した。プラック法 で検出されたF 特異大腸菌ファージ（F ファージ）のプラックを単離し、定量 PCR によって F-RNA ファージの遺伝子群を同定した。また、試料を濃縮し、ヒト、ブタおよび反芻動物に 特異的なバクテロイデスを定量PCR によって検出した。 微生物遺伝子マーカーを用いた糞便汚染源解析の有効性を評価するため、富士川（1 地点）、 多摩川（3 地点）および利根川（1 地点）で採取した河川水（119 試料）を濃縮し、3 種類のバ クテロイデスを定量PCR によって測定した。 〔結 果〕 糞便汚染源試料から単離したF ファージのプラックを同定した結果、ヒト糞便汚染源である 下水流入水、下水2 次処理水およびコミュニティプラント排水中の F-RNA ファージの遺伝子 群の検出結果には共通した傾向は認めらなかった。また、畜産飼育施設の上流と下流の河川水 中で優占する遺伝子群の平均濃度に大きな差はなかった。この結果より、F-RNA ファージの 遺伝子群の同定法は、ヒトおよび動物糞便による河川水の汚染の影響を評価する上で有用では ないと判断された。 糞便汚染源試料中の3 種類の宿主特異的なバクテロイデスを検出した結果、下水流入水と下 水2 次処理水、コミュニティプラント排水からはヒトバクテロイデスが他のバクテロイデスよ りも3～4 log 程度高い平均濃度で検出された。また、畜産飼育施設の下流に位置する地点の河 川水からはブタバクテロイデスが高い平均濃度で検出され、下流地点よりも約3 log、ヒトバク テロイデスよりも約2 log 高い値であった。これらの結果より、糞便汚染源解析におけるヒト およびブタバクテロイデスの有効性が示唆された。 微生物遺伝子マーカーとしてバクテロイデスを用い、異なる流域特性を有する3 河川（5 地 点）を対象とした河川水中の糞便汚染源解析を試みた。その結果、流域特性に呼応した宿主の バクテロイデスが検出される傾向が認められ、都市河川ではヒトバクテロイデスが優占してお り、畜産の盛んな流域ではブタおよび反芻動物バクテロイデスがヒトバクテロイデスよりも優 占していることが明らかとなった。本事業で適用を試みたウイルス系の微生物遺伝子マーカー の有効性は低いことが示唆されたものの、現在主流のバクテロイデスを用いることで、国内河 川においても高精度の糞便汚染源解析源解析が可能となることが示された。 調査対象水系・河川 富士川水系・富士川、多摩川水系・多摩川、利根川水系・利根川 データベースに登 録するキーワード 部門 大分類 中分類 小分類 調査部門 環境 水環境 健康項目 ※データベースに登録するキーワードは、本冊子 P.44 の表から代表的なものを一つ記入して下さい。様式６･３ １．調査・研究 ［自己評価シート］ 助成番号 助成事業名 所属・助成事業者氏名
26-1263-011
ウイルス遺伝子マーカーを利用した
河川水中の糞便汚染源解析法の開発
山梨大学大学院総合研究部
原本 英司
助 成 事 業 実 施 成 果 の 自 己 評 価 〔計画の妥当性〕 本事業では、現在世界的に広く使用されている微生物遺伝子マーカーであるバクテロイデス に加えて、ウイルス系の微生物遺伝子マーカーであるF-RNA ファージを用いることでより詳 細な河川水中の糞便汚染源解析が可能となるかを評価することを目的とした。糞便汚染源試料 の解析では、下水や畜産排水などの流域の糞便汚染源の代表的な試料を採取して測定すること ができた。また、アーカイブ試料を効果的に活用することにより、複数の流域の河川水を対象 とした糞便汚染源解析を実施することができた。 本事業で得られた知見は、糞便汚染に関する微生物指標として大腸菌や大腸菌群のみ測定し ている現行の水質管理法では得られないものであり、微生物学的に安全な水環境の構築に大き く貢献できるものであり、妥当な研究テーマであったと言える。 〔当初目標の達成度〕 複数のヒト糞便汚染源試料およびブタ糞便汚染源試料を採取することができた点、アーカイ ブ試料を活用して単一の流域のみならず、流域特性の異なる複数の流域における糞便汚染源解 析を実施できた点より、当初の目標は十分に達成できたと言える。一方で、ウシやカモなどの 他の動物の糞便汚染源試料は採取することができなかった点は反省材料である。また、ウイル ス系の遺伝子マーカーであるF-RNA ファージが、事業開始当初に期待していた通りには有効 とは判断されなかったことは想定外の結果であった。 〔事業の効果〕 本事業の成果の一部は、2015 年 8 月に日本大学にて開催予定の国際会議「Water and Environment Technology Conference 2015」において発表予定である。また、今後、本事業 の成果を中心に取りまとめ、国際学術雑誌に投稿する予定である。〔河川管理者等との連携状況〕 本事業においては特に該当なし。
1. はじめに
ノロウイルスやクリプトスポリジウムに代表される水系感染性の病原微生物は、汚染さ れた水や食品などを介して経口感染し、下痢や嘔吐、発熱などの様々な症状を引き起こし、 感染者の糞便中に高濃度に排出される。下水あるいは下水処理水を受容する河川水や海水 に感染力を有する病原微生物が含まれる場合、水道水の飲用や親水行為での誤飲、海産物 の喫食などを通じてヒトへの再感染を引き起こす可能性がある。この水系感染リスク につ いては、水環境中での病原微生物の存在実態に関する知見が不足している ことが起因とな り、十分には明らかにされていない。 水環境中の病原微生物の由来としては、ヒトのみならず、流域内に生息する動物から排 出される糞便も想定される。病原微生物には、ヒトのみに感染するもの、特定の動物のみ に感染するもの、ヒトと動物の両方に感染する人獣共通感染型のものが存在する。そのた め、病原微生物によるによる水系感染リスクを評価する上で、水環境中の病原微生物のヒ トへの感染性の有無を明らかにすることは非常に重要である。 水環境中の糞便汚染源の解析を目的として、ヒトやウシ、ブタなどの宿主の糞便中に特 異的に排出される微生物の遺伝子を測定し、宿主別の寄与度 を評価する手法がある。この 微生物起源解析（Microbial source tracking）において利用される微生物遺伝子マーカーとし ては、細菌であるバクテロイデスや大腸菌に感染するウイルスである F 特異 RNA 大腸菌 ファージ（F-RNA ファージ）、ヒトや動物に感染するウイルス（アデノウイルスやポリオ ーマウイルス、アイチウイルスなど）などが挙げられる。これらの中で、宿主特異性に問 題がある事例も報告されているものの、バクテロイデスが最も広く用いられている。また、 4 種類の遺伝子群（I～IV 群）に分類される F-RNA ファージは、詳細な糞便汚染源解析に は適さないものの、遺伝子群の組み合わせによっては十分な糞便汚染源解析が可能となる ことが示唆されている。 本事業では、現在主流の微生物遺伝子マーカーであるバクテロイデスに加えて、ウイル ス系の微生物遺伝子マーカーとして F-RNA ファージを用いることにより、河川水中の糞便 汚染源解析を試みた。まず、糞便汚染源となる試料（下水、コミュニティプラント排水お よび畜産排水）からの微生物遺伝子マーカーの検出特性を把握し、その後、異なる流域特 性を持つ河川水（富士川、多摩川および利根川）中の微生物遺伝子マーカーを測定するこ とにより、糞便汚染源を解析した。2. 調査方法
2.1 調査対象地点および試料の採取 糞便汚染源試料からの微生物遺伝子マーカーの検出特性を評価するため、2011 年 3 月 30 日～2012 年 2 月 22 日に計 12 回、山梨県内の下水処理場において下水流入水と下水 2 次処 理水をアーカイブ試料として用いた。また、2014 年 8 月 20 日～9 月 8 日に計 3 回、甲府盆 地内の河川 3 地点（流川（高橋）、鎌田川（万年橋）および貢川（沖田橋））において河川 水を採取した。高橋（上流側）と万年橋（下流側）の間には畜産飼育施設が立地しており、 万年橋の河川水は畜産飼育施設からの排水の影響を強く受けていると考えられる。沖田橋の上流には複数のコミュニティプラントが立地しており、河川水にはコミュニティプラン トからの排水が多く含まれていると判断した。 微生物遺伝子マーカーを用いた糞便汚染源解析法を適用する河川水として、2011 年 3 月 ～2012 年 2 月に計 12 回、富士川（富士橋）において採取した河川水をアーカイブ試料と して使用した。同じ期間中、多摩川の 3 地点（羽村取水堰、稲城大橋および二子橋）にお いて採取した河川水も使用した。さらに、2011 年 5 月～2012 年 4 月に週 1 回以上の頻度で 計 71 回、利根川（利根大堰）において採取した河川水も使用した。 採取した試料は、滅菌済みのポリ容器に入れて冷蔵状態で輸送し、測定作業の直前まで 冷蔵保存した。 2.2 バクテロイデスの測定 試料中のバクテロイデスは、陰電荷膜破砕型濃縮法 1、2）をベースとした手法によって濃 縮した。直径 47mm または 90mm の陰電荷膜（混合セルロース膜、孔径 0.45μm、Merck Millipore）で試料（100～2,000mL）をろ過した。試料の種類によっては、F-RNA ファージ やウイルスの回収率を向上させるため、終濃度が 2.5mol/L となるように試料に MgCl2溶液 を 添 加 し た 。 ろ 過 後 の 陰 電 荷 膜 を フ ィ ル タ ー ホ ル ダ ー か ら 剥 が し 、PET 溶 液 （ 0.2g/L Na4P2O7･10H2O、0.3g/L C10H13N2O8Na3･3H2O、0.1mL/L Tween 80）10mL とフットボール型 撹拌子を入れた遠沈管（容量 50mL）内で激しく撹拌して膜を数 mm 四方以下に破砕した。 スポイトを用いて溶液の全量を新しい遠沈管に移し入れた後、元の遠沈管に PET 溶液 5mL を添加して同様の操作を繰り返した（計 15mL）。その後、遠沈管を遠心（2,000×g、10 分、 4℃）し、上清をスポイトで除去した後、全量が 1mL となるように沈渣に適量の PBS（－） を添加して濃縮液を得た。
この濃縮液から200µL を分取し、QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）を用いた DNA 抽出操 作に供することで DNA 抽出液 200µL を得た。PCR チューブ 1 本あたり、DNA 抽出液 5µL と PCR 反応液 20µL を混合し、Thermal Cycler Dyce Real Time System（TP800、Takara Bio） を用いた定量 PCR に供した。PCR 反応液は Premix Ex Taq（Probe qPCR）（Takara Bio）を 用いて調整し、3 種類の宿主（ヒト、ブタおよび反芻動物）それぞれに特異的なプライマ ー（終濃度 400nmol/L）とプローブ（終濃度 200nmol/L）は表 2.1 に記載のものを使用した。 反応条件は、95℃で 30 秒の加熱の後、95℃5 秒と 60℃30 秒から成る PCR 反応を 45 サイ クル繰り返した。また、検量線作成用の標準試料として、増幅領域の塩基配列を有する人 工合成プラスミド（Takara Bio）を TE バッファーで 10 倍段階希釈したものを使用した。 水試料、標準試料、ネガティブコントロール（PCR-grade water）共に、PCR チューブ 2 本 を反応に供した。
表 2.1 バクテロイデスのプライマーおよび Taqman MGB プローブ
Host Function Sequence (5’-3’) Reference Human Forward primer GGCGGTCTTCCGGGTAAA 3
Reverse primer CACACTTCTGCGGGTCTTTGT TaqMan MGB probe FAM-TGGCCGACTGCTC-NFQ-MGB
Pig Forward primer GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT 4 Reverse primer ACCTCATACGGTATTAATCCGC
TaqMan MGB probe FAM-TCCACGGGATAGCC-NFQ-MGB
Ruminant Forward primer GCGTATCCAACCTTCCCG 5 Reverse primer CATCCCCATCCGTTACCG
TaqMan MGB probe FAM-CTTCCGAAAGGGAGATT-NFQ-MGB 2.3 F-RNA ファージの測定
Salmonella enterica serovar Typhimurium WG49 を宿主菌に用いたプラック法を用い、試料
中の F 特異大腸菌ファージ（F ファージ）を測定した。シャーレ上に形成した F ファージ のプラックを 1 試料あたり最大 8 個単離し、滅菌 MilliQ 水 500µL に溶解した。
このプラック溶解液の一部（通常は 10µL）を分取して RNA を加熱抽出（95℃5 分）し た後、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies）を用いた逆転写反 応に供し、cDNA 溶液（通常は 20µL）を得た。cDNA 溶液から 2µL ずつ分取し、PCR 反応 液 23µL と混合して F-RNA ファージの 4 種類の遺伝子群（I～IV 群）それぞれに特異的な 定量PCR（表 2.2、表 2.3）6、7）を実行した。PCR 装置には Thermal Cycler Dyce Real Time System （TP800、Takara Bio）を使用した。プラックには大量のファージ RNA が含まれるため、 Ct 値（蛍光強度が指数関数的に増加しているサイクル数）が 30 以上の場合には、プラッ クを形成する主要なファージを検出できていないと 判断した。 I～IV 群のいずれの F-RNA ファージの遺伝子群に対しても 30 未満の Ct 値が得られない 場合には、以下に示す手順により F 特異 DNA 大腸菌ファージ（F-DNA ファージ）の検出 を試みた。プラック溶解液から加熱抽出（95℃5 分）によって得られた DNA 抽出液 2µL とPCR 反応液 23µL を混合し、F-DNA ファージに特異的なプライマー8）を用いた定量PCR9） を実行した。この PCR 反応においては、Ct 値の確認（30 未満）と共に、増幅産物の融解 温度（Tm 値）が F-DNA ファージに特異的（約 81℃）であることも確認した。 F-RNA ファージの 4 種類の遺伝子群および F-DNA ファージのいずれにも分類されなか ったプラックは、未分類として扱った。 各試料におけるF-RNA ファージの各遺伝子群および F-DNA ファージの存在濃度（単位： Plaque-forming units（PFU）/L）は、プラック法で算出した F ファージの濃度に、単離プラ ック数に対する各ファージのプラック数の割合を乗じることで算出した。
表 2.2 F-RNA ファージのプライマーおよび TaqMan プローブ 6） Genogroup Function Sequence (5’–3’)
I Forward primer GTCCTGCTCRACTTCCTGT Reverse primer CGGCTACCTACAGCGATAG
TaqMan probe FAM-CAWGGTAGCGTCTCGCTAAAGACATTA-BHQ-1 II Forward primer TCTATGTATGGATCGCACTCG
Reverse primer GTAGGCAAGTCCATCAAAGTC
TaqMan probe FAM-TGCTGTCCGATTTCACGTCTATCTTCA-BHQ-1 III Forward primer GYGGTGCYACAACRACGAAT
Reverse primer GWGGSGTACACKCTTGCG
TaqMan probe FAM-TACGGYCATCCGTCCTTCAAGTTTG-BHQ-1 IV Forward primer GACWGGTCGGTACAAAGTKG
Reverse primer ARCTTCACCTCGGGAARTC
TaqMan probe FAM-CGGATGAAGGCACTGTCCTGAATC-BHQ-1 表 2.3 F-RNA ファージのプライマーおよび TaqMan MGB プローブ 7） Genogroup Function Sequence (5’–3’)
I Forward primer ATCCATTTTGGTAACGCCG Reverse primer TGCAATCTCACTGGGACATAT
TaqMan MGB probe FAM-TAGGCATCTACGGGGACGA-NFQ-MGB II Forward primer TTACTGTCGTTCCTGTTAGCAATG
Reverse primer CRCCTGACGCACGATAACT
TaqMan MGB probe FAM-ACGGCGTCGCTGAGTGGCTTTC-NFQ-M GB
III Forward primer TAAATCCCACYAACGGYGTTGC Reverse primer TTICGATTRCGIGAAGGCTG TaqMan MGB probe (Q-like) TGGAGAAGCGTGTTACCGTTT
TaqMan MGB probe (M-like) FAM-TGGAGAAGCGTGTYACAATTTCTGTRTC -NFQ-MGB
IV Forward primer CGGYCAYCCGTCGTGGAAG Reverse primer AGTGACTGCTTTATTYGAAGTGCG
TaqMan MGB probe FAM-CCTGTCCGCAGGATGTWACCAAAC-NF Q-MGB
2.4 水質指標および微生物指標の測定
試料約 10mL を用い、簡易水質分析計（HACH）によって濁度を測定した。また、多機 能水質計（Hanna Instruments）を用いて pH と電気伝導度を測定した。微生物指標として、 コ リ ラ ー ト （Idexx Laboratories） またはクロ モカルト・コリフォ ー ム 寒天培地（Merck Millipore）を用いて大腸菌を測定した。
3. 調査結果および考察
3.1 糞便汚染源試料からの微生物遺伝子マーカーの測定結果 糞便汚染源試料として採取した下水流入水、下水 2 次処理水および河川水（高橋、万年 橋および沖田橋）からの水質指標（pH、電気伝導度および濁度）と微生物指標（大腸菌）、 F ファージの測定結果を表 3.1～3.5 に示す。いずれの水質指標も、調査期間を通してほぼ 一定の値を示した。また、大腸菌と F ファージの濃度（対数値）も顕著な濃度変動は示さ ず、これらの糞便汚染源試料は平水時を代表するものとみなすことができると判断した。 表 3.1 流入水中の水質指標、微生物指標および F ファージの測定結果Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 7.5 598 142 5.56 7.68 5.94 2011/4/18 6.9 545 153 5.89 6.68 6.18 2011/5/25 7.6 542 134 5.59 6.81 5.94 2011/6/29 7.4 595 117 5.92 7.71 6.18 2011/7/25 7.4 560 129 6.00 7.49 6.08 2011/8/24 7.2 595 113 5.87 6.78 6.30 2011/9/14 7.2 487 149 6.00 7.44 6.32 2011/10/18 6.5 326 166 5.93 7.38 6.26 2011/11/24 6.8 340 157 5.81 6.61 6.45 2011/12/14 7.2 663 147 5.68 7.13 5.93 2012/1/24 7.6 640 156 5.63 6.83 6.65 2012/2/22 7.5 726 154 5.54 7.03 6.38
Sampling DateElectrical conductivitypH Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 7.5 598 142 5.56 7.68 5.94 2011/4/18 6.9 545 153 5.89 6.68 6.18 2011/5/25 7.6 542 134 5.59 6.81 5.94 2011/6/29 7.4 595 117 5.92 7.71 6.18 2011/7/25 7.4 560 129 6.00 7.49 6.08 2011/8/24 7.2 595 113 5.87 6.78 6.30 2011/9/14 7.2 487 149 6.00 7.44 6.32 2011/10/18 6.5 326 166 5.93 7.38 6.26 2011/11/24 6.8 340 157 5.81 6.61 6.45 2011/12/14 7.2 663 147 5.68 7.13 5.93 2012/1/24 7.6 640 156 5.63 6.83 6.65 2012/2/22 7.5 726 154 5.54 7.03 6.38 Sampling Date pH 表 3.2 下水 2 次処理水中の水質指標、微生物指標および F ファージの測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 6.7 559 2 3.20 5.37 3.56 2011/4/18 6.8 546 7 3.73 6.40 3.78 2011/5/25 6.9 389 3 2.84 4.42 2.90 2011/6/29 7.0 606 4 3.96 6.11 3.52 2011/7/25 6.7 458 5 3.41 5.25 3.26 20118/24 6.8 528 4 4.49 5.83 3.56 2011/9/14 6.8 525 6 4.52 5.92 2.90 2011/10/18 6.8 569 8 5.04 6.71 4.70 2011/11/24 6.8 620 12 4.72 6.77 3.95 2011/12/14 6.5 564 11 3.40 4.52 3.00 2012/1/24 6.7 585 3 2.88 5.43 3.46 2012/2/22 6.9 693 3 3.34 5.29 3.88
Sampling DateElectrical conductivitypH Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 6.7 559 2 3.20 5.37 3.56 2011/4/18 6.8 546 7 3.73 6.40 3.78 2011/5/25 6.9 389 3 2.84 4.42 2.90 2011/6/29 7.0 606 4 3.96 6.11 3.52 2011/7/25 6.7 458 5 3.41 5.25 3.26 20118/24 6.8 528 4 4.49 5.83 3.56 2011/9/14 6.8 525 6 4.52 5.92 2.90 2011/10/18 6.8 569 8 5.04 6.71 4.70 2011/11/24 6.8 620 12 4.72 6.77 3.95 2011/12/14 6.5 564 11 3.40 4.52 3.00 2012/1/24 6.7 585 3 2.88 5.43 3.46 2012/2/22 6.9 693 3 3.34 5.29 3.88 Sampling Date pH 表 3.3 河川水（高橋）中の水質指標、微生物指標および F ファージの測定結果 Electrical conductivity Turbidity E. coli F-specific coliphage
(µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log PFU/L)
2014/8/20 7.7 256 3 3.63 2.90
2014/8/28 7.6 235 11 3.94 3.51
2014/9/8 7.6 219 7 3.87 3.45
表 3.4 河川水（万年橋）中の水質指標および微生物指標の測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log PFU/L)
2014/8/20 7.8 243 2 3.41 2.93
2014/8/28 7.8 229 25 4.27 3.63
2014/9/8 7.8 217 7 3.78 3.16
Sampling Date pH
表 3.5 河川水（沖田橋）中の水質指標および微生物指標の測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log PFU/L) 2014/8/20 8.0 398 15 3.41 2.88 2014/8/28 7.8 403 36 4.44 3.81 2014/9/8 7.9 315 6 4.14 3.48 Sampling Date pH 糞便汚染源試料から単離（1 試料あたり最大 8 個）した F ファージのプラックの同定結 果を表3.6～3.10 に示す。下水流入水からは F-RNA ファージの II 群が最も優占して同定さ れたのに対し、下水 2 次処理水からは I 群が優占して同定された。3 地点の河川水のいず れにおいても II 群が最も優占しており、その割合は 50～79%であった。 このプラックの同定結果と F ファージの検出濃度から算出した F-RNA ファージの各遺 伝子群の平均濃度を表 3.11 および図 3.1 に示す。下水処理場における F-RNA ファージの挙 動は、遺伝子群によって大きく異なっており、特に I 群は下水処理工程での除去率が他の 遺伝子群と比較して大幅に低いことが明らかとなった。下水流入水中においては、II 群お よび III 群の平均濃度が I 群と IV 群の平均濃度に比べて高かったものの、その差は 1 log 程度と小さいものであった。また、下水 2 次処理水では I 群の平均濃度が最も高かったも のの、II 群と III 群との差は 1 log 以下であった。下水処理の有無で優占する遺伝子群が異 なる点および優占する遺伝子群の平均濃度が顕著には突出していない点より、ヒト糞便汚 染指標として F-RNA ファージを用いることは困難であることが示唆された。また、畜産飼 育施設の上流（高橋）と下流（万年橋）で優占する遺伝子群（II 群）の平均濃度にほとん ど差はなく、畜産排水（動物糞便）受容の影響を F-RNA ファージを用いて評価することも 困難であると推察された。 以上のことから、F-RNA ファージの遺伝子群の同定法は、ヒトおよび動物糞便による河 川水の汚染の影響を評価する上で有用ではないと判断した。
表 3.6 下水流入水から単離した F ファージのプラックの同定結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
2011/3/30 0 1 2 2 2 1 8 2011/4/18 0 5 2 0 1 0 8 2011/5/25 1 2 4 0 0 1 8 2011/6/29 0 4 1 0 1 2 8 2011/7/25 0 5 1 0 1 1 8 2011/8/24 0 5 2 0 0 1 8 2011/9/14 0 4 1 0 3 0 8 2011/10/18 0 2 1 0 2 3 8 2011/11/24 0 2 2 0 2 2 8 2011/12/14 0 3 0 0 1 4 8 Total 1 33 16 2 13 15 80 Ratio (%) 1% 41% 20% 3% 16% 19% 100%
Date F-RNA coliphage F-DNA
coliphage Unknown
Number of isolated plaques
表 3.7 下水 2 次処理水から単離した F ファージのプラックの同定結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup III
2011/3/30 6 1 1 0 0 0 8 2011/4/18 6 1 0 0 0 1 8 2011/5/25 6 2 0 0 0 0 8 2011/6/29 6 2 0 0 0 0 8 2011/7/25 5 1 1 0 0 1 8 2011/8/24 8 0 0 0 0 0 8 2011/9/14 5 0 1 0 0 2 8 2011/10/18 8 0 0 0 0 0 8 2011/11/24 7 0 0 0 0 1 8 2011/12/14 1 3 3 0 0 1 8 Total 58 10 6 0 0 6 80 Ratio (%) 73% 13% 8% 0% 0% 8% 100%
Date F-RNA coliphage F-DNA
coliphage Unknown
Number of isolated plaques
表 3.8 河川水（高橋）から単離した F ファージのプラックの同定結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
2014/8/20 0 1 1 0 6 8 2014/8/28 0 7 0 0 1 8 2014/9/8 0 4 0 0 4 8 Total 0 12 1 0 11 24 Ratio (%) 0% 50% 4% 0% 46% 100% Unknown Number of isolated
Date F-RNA coliphage
表 3.9 河川水（万年橋）から単離した F ファージのプラックの同定結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
2014/8/20 0 4 0 0 4 8 2014/8/28 0 2 0 0 6 8 2014/9/8 0 7 0 0 1 8 Total 0 13 0 0 11 24 Ratio (%) 0% 54% 0% 0% 46% 100% Unknown Number of isolated
表 3.10 河川水（沖田橋）から単離した F ファージのプラックの同定結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
2014/8/20 0 8 0 0 0 8 2014/8/28 3 5 0 0 0 8 2014/9/8 0 6 0 0 2 8 Total 3 19 0 0 2 24 Ratio (%) 13% 79% 0% 0% 8% 100% Unknown Number of isolated
Date F-RNA coliphage
表 3.11 糞便汚染源試料中における F-RNA ファージの各遺伝子群の濃度算出結果
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
Raw Sewage 4.29 5.81 5.49 4.59
Secondary-treated Sewage 3.76 3.00 2.78
-Taka-hashi Bridge - 2.87 1.13
-Mannen-bashi Bridge - 2.61 -
-Okita-bashi Bridge 1.59 3.28 -
-A) Raw sewage and secondary-treated sewage
(-) 1 2 3 4 5 6 7
Raw Sewage Secondary-treated Sewage C on cen tr at ion (log PF U/L) Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
B) Takahashi Bridge (-) 1 2 3 4 5 6
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
C on cen tr at ion (log PF U/L) C) Mannnen-bashi Bridge (-) 1 2 3 4 5 6
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
C on cen tr at ion (PF U/L) D) Okita-bashi Bridge (-) 1 2 3 4 5 6
Genogroup I Genogroup II Genogroup III Genogroup IV
C on cen tr at ion (log PF U/L) 図 3.1 糞便汚染源試料中における F-RNA ファージの各遺伝子群の平均濃度の算出結果
糞便汚染源試料からのバクテロイデスの検出結果を図 3.2 に示す。また、ブタおよび反 芻動物バクテロイデスの平均濃度に対するヒトバクテロイデスの平均濃度の割合を図 3.3 に示す。下水流入水と下水 2 次処理水中におけるヒトバクテロイデスの平均濃度は、ブタ および反芻動物バクテロイデスに比較してそれぞれ 4 log、3 log 程度高かった。また、コ ミュニティプラントからの排水の影響を強く受けていると推察される沖田橋の河川水にお いては、ヒトバクテロイデスのみが検出され、ブタおよび反芻動物バクテロイデスは検出 されなかった。このことから、ヒト糞便汚染の解析にヒトバクテロイデスを用いることの 有効性が示唆された。 畜産飼育施設の上流（高橋）と下流（万年橋）で採取した 2 種類の試料中のバクテロイ デスを測定したところ、ヒトバクテロイデスの平均濃度はほぼ同じ値で、反芻動物バクテ ロイデスの平均濃度はいずれの地点も低い値であった。一方、ブタバクテロイデスの平均 濃度は、上流地点よりも下流地点の方が約 3 log 高く、さらに、ヒトバクテロイデスの平 均濃度よりも 2 log 程度高かった。このことより、ヒトおよびブタバクテロイデスを用い ることにより、ヒトとブタから受ける糞便汚染源のレベルが解析可能となることが示唆さ れた。
A) Raw sewage and secondary-treated sewage (-) 3 4 5 6 7 8 9 10
Raw Sewage Secondary-treated Sewage Con cen tr at io n (lo g co p ies/ L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
B) Takahashi Bridge (-) 3 4 5 6 7
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
Con
centr
at
io
n
(
lo
g
P
FU/
L)
C) Mannnen-bashi Bridge (-) 3 4 5 6 7Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
Con
cen
tr
at
io
n
(log
co
p
ies/
L)
D) Okita-bashi Bridge (-) 3 4 5 6 7Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
Con
cen
tr
at
io
n
(
lo
g Co
p
ies/
L)
図 3.2 糞便汚染源試料中におけるバクテロイデスの 平均濃度の測定結果図 3.3 糞便汚染源試料中におけるブタおよび反芻動物バクテロイデスの 平均濃度に対するヒトバクテロイデスの平均濃度の割合 3.2 異なる流域の河川水中の糞便汚染源の解析結果 3.1 節において、ウイルス系の微生物遺伝子マーカーである F-RNA 大腸菌ファージに比 べ、バクテロイデスの方が宿主特異的な微生物遺伝子マーカーとして適していることが示 唆された。そこで、国内の異なる流域内の河川水を対象試料とし、バクテロイデスを用い た糞便汚染源の解析を試みた。 対象とした富士川（1 地点）、多摩川（3 地点）および利根川（1 地点）における水質指 標および微生物指標、F ファージの測定結果を表 3.12～3.16 に示す。いずれの河川におい ても、台風などに伴って降雨量が多くなる夏から秋にかけて濁度の上昇が見られた。大腸 菌濃度にも同様の傾向が認められた。地点別では、多摩川の上流に位置する羽村取水堰に おける大腸菌の濃度が低く、陽性率も 42%と低い値を示した。 表 3.12 富士川（富士橋）における水質指標、微生物指標および F ファージの測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 7.8 220 10 1.30 5.05 3.15 2011/4/18 8.0 219 10 1.40 5.07 3.56 2011/5/25 7.6 170 25 1.81 4.75 2.78 2011/6/29 7.9 219 11 1.65 5.02 2.78 2011/7/25 7.8 208 72 1.54 5.00 2.78 20118/24 7.7 199 12 1.00 5.01 3.08 2011/9/14 7.2 156 49 1.65 4.77 -2011/10/18 7.6 180 11 1.78 5.25 3.00 2011/11/24 7.5 175 14 1.90 4.95 3.08 2011/12/14 7.3 210 7 1.70 4.79 3.60 2012/1/24 8.1 226 8 1.43 5.16 3.81 2012/2/22 7.5 238 7 1.98 5.49 4.40
Sampling DateElectrical conductivitypH Turbidity E. coli E. coli F-specific coliphage (µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L) (log PFU/L)
2011/3/30 7.8 220 10 1.30 5.05 3.15 2011/4/18 8.0 219 10 1.40 5.07 3.56 2011/5/25 7.6 170 25 1.81 4.75 2.78 2011/6/29 7.9 219 11 1.65 5.02 2.78 2011/7/25 7.8 208 72 1.54 5.00 2.78 20118/24 7.7 199 12 1.00 5.01 3.08 2011/9/14 7.2 156 49 1.65 4.77 -2011/10/18 7.6 180 11 1.78 5.25 3.00 2011/11/24 7.5 175 14 1.90 4.95 3.08 2011/12/14 7.3 210 7 1.70 4.79 3.60 2012/1/24 8.1 226 8 1.43 5.16 3.81 2012/2/22 7.5 238 7 1.98 5.49 4.40 Sampling Date pH
表 3.13 多摩川（羽村取水堰）における水質指標および微生物指標の測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli
(µS/cm) (FAU) (log CFU/L) (log copies/L)
2011/3/8 8.5 114 5 - -2011/4/12 7.9 69 5 - 4.15 2011/5/9 8.4 111 4 - 4.44 2011/6/7 8.5 125 2 0.70 5.95 2011/7/13 8.5 128 5 1.00 -2011/8/3 7.6 94 3 - -2011/9/7 8.4 116 298 1.18 -2011/10/11 7.9 109 78 0.70 -2011/11/8 8.6 103 14 0.70 -2011/12/6 8.1 125 6 - -2012/1/18 8.2 99 2 - -2012/2/1 8.1 107 6 - -Sampling Date pH 表 3.14 多摩川（稲城大橋）における水質指標および微生物指標の測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli
(µS/cm) (FAU) (log MPN/L) (log copies/L)
2011/3/8 6.9 312 8 2.56 6.42 2011/4/12 7.3 352 9 2.79 6.11 2011/5/9 7.2 410 8 2.20 6.17 2011/6/7 7.1 365 1 2.88 6.43 2011/7/13 7.3 435 5 2.18 6.19 2011/8/3 7.2 261 3 2.76 6.10 2011/9/7 7.2 316 116 2.75 6.94 2011/10/11 6.7 372 5 2.18 5.61 2011/11/8 7.3 409 5 2.49 5.89 2011/12/6 7.0 413 10 2.49 6.26 2012/1/18 7.0 463 4 2.18 5.36 2012/2/1 6.9 486 8 2.78 4.87 Sampling Date pH
表 3.15 多摩川（二子橋）における水質指標および 微生物指標の測定結果
Electrical conductivity Turbidity E. coli E. coli
(µS/cm) (FAU) (log MPN/L) (log copies/L)
2011/3/8 7.9 264 10 2.18 6.30 2011/4/12 9.3 363 7 2.40 6.33 2011/5/9 9.0 354 11 1.18 5.54 2011/6/7 8.2 314 2 2.66 6.05 2011/7/13 9.3 384 10 - 5.12 2011/8/3 7.8 219 3 2.36 5.56 2011/9/7 7.6 178 203 2.04 5.19 2011/10/11 7.7 295 5 2.80 5.78 2011/11/8 7.8 358 2 1.30 5.44 2011/12/6 7.6 372 3 2.72 5.58 2012/1/18 7.7 345 10 2.23 5.73 2012/2/1 7.6 396 9 0.70 5.35 Sampling Date pH 表 3.16 利根川（利根大堰）における水質指標、微生物指標および F ファージの測定結果
Turbidity E. coli F-specific coliphage (FAU) (log MPN/L) (log PFU/L) 2011/5/10 7 2.54 2.00 2011/5/11 56 3.58 2.00 2011/5/12 55 4.62 3.53 2011/5/16 12 2.47 2.00 2011/5/24 11 3.19 2.18 2011/5/25 18 3.62 2.40 2011/5/26 6 2.87 2.18 2011/5/31 95 4.16 2.88 2011/6/7 13 3.29 -2011/6/14 9 3.20 1.70 2011/6/21 8 2.59 -2011/6/28 4 2.69 2.54 2011/7/5 12 2.59 -2011/7/12 14 3.09 -2011/7/19 8 2.93 2.00 2011/7/20 81 4.04 3.22 2011/7/21 43 4.11 3.15 2011/7/26 10 2.64 2.18 2011/8/2 131 3.91 3.04 2011/8/9 109 4.24 1.70 2011/8/16 24 3.39 1.70 2011/8/23 51 4.11 2.30 2011/8/30 11 2.93 2.30 2011/9/6 132 4.46 3.10 2011/9/13 36 3.48 2.40 2011/9/20 35 3.49 2.65 2011/9/27 21 3.31 2.85 2011/10/4 9 2.59 2.00 2011/10/11 6 2.53 2.40 2011/10/18 5 2.40 2.18 2011/10/25 6 2.97 2.65 2011/11/1 5 2.64 2.40 2011/11/8 10 3.17 2.48 2011/11/15 7 2.32 2.78 2011/11/22 5 2.72 2.54 2011/11/29 4 2.32 2.70 2011/12/6 5 2.77 2.85 2011/12/13 2 2.97 2.74 2011/12/20 7 2.48 2.85 2011/12/26 6 2.81 2.70 2012/1/5 5 2.09 2.81 2012/1/10 3 2.59 3.00 2012/1/17 4 2.32 3.00 2012/1/20 9:00 3 2.32 3.00 2012/1/20 16:00 5 2.31 3.00 2012/1/21 5 2.72 3.00 2012/1/22 7 3.47 3.00 2012/1/23 10 4.16 4.84 2012/1/24 5 1.90 2.74 2012/1/31 3 2.09 2.74 Sampling Date
表 3.16 （つづき）
Turbidity E. coli F-specific coliphage (FAU) (log MPN/L) (log PFU/L) 2011/5/10 7 2.54 2.00 2011/5/11 56 3.58 2.00 2011/5/12 55 4.62 3.53 2011/5/16 12 2.47 2.00 2011/5/24 11 3.19 2.18 2011/5/25 18 3.62 2.40 2011/5/26 6 2.87 2.18 2011/5/31 95 4.16 2.88 2011/6/7 13 3.29 -2011/6/14 9 3.20 1.70 2011/6/21 8 2.59 -2011/6/28 4 2.69 2.54 2011/7/5 12 2.59 -2011/7/12 14 3.09 -2011/7/19 8 2.93 2.00 2011/7/20 81 4.04 3.22 2011/7/21 43 4.11 3.15 2011/7/26 10 2.64 2.18 2011/8/2 131 3.91 3.04 2011/8/9 109 4.24 1.70 2011/8/16 24 3.39 1.70 2011/8/23 51 4.11 2.30 2011/8/30 11 2.93 2.30 2011/9/6 132 4.46 3.10 2011/9/13 36 3.48 2.40 2011/9/20 35 3.49 2.65 2011/9/27 21 3.31 2.85 2011/10/4 9 2.59 2.00 2011/10/11 6 2.53 2.40 2011/10/18 5 2.40 2.18 2011/10/25 6 2.97 2.65 2011/11/1 5 2.64 2.40 2011/11/8 10 3.17 2.48 2011/11/15 7 2.32 2.78 2011/11/22 5 2.72 2.54 2011/11/29 4 2.32 2.70 2011/12/6 5 2.77 2.85 2011/12/13 2 2.97 2.74 2011/12/20 7 2.48 2.85 2011/12/26 6 2.81 2.70 2012/1/5 5 2.09 2.81 2012/1/10 3 2.59 3.00 2012/1/17 4 2.32 3.00 2012/1/20 9:00 3 2.32 3.00 2012/1/20 16:00 5 2.31 3.00 2012/1/21 5 2.72 3.00 2012/1/22 7 3.47 3.00 2012/1/23 10 4.16 4.84 2012/1/24 5 1.90 2.74 2012/1/31 3 2.09 2.74 Sampling Date
Turbidity E. coli F-specific coliphage (FAU) (log MPN/L) (log PFU/L) 2011/5/10 7 2.54 2.00 2011/5/11 56 3.58 2.00 2011/5/12 55 4.62 3.53 2011/5/16 12 2.47 2.00 2011/5/24 11 3.19 2.18 2011/5/25 18 3.62 2.40 2011/5/26 6 2.87 2.18 2011/5/31 95 4.16 2.88 2011/6/7 13 3.29 -2011/6/14 9 3.20 1.70 2011/6/21 8 2.59 -2011/6/28 4 2.69 2.54 2011/7/5 12 2.59 -2011/7/12 14 3.09 -2011/7/19 8 2.93 2.00 2011/7/20 81 4.04 3.22 2011/7/21 43 4.11 3.15 2011/7/26 10 2.64 2.18 2011/8/2 131 3.91 3.04 2011/8/9 109 4.24 1.70 2011/8/16 24 3.39 1.70 2011/8/23 51 4.11 2.30 2011/8/30 11 2.93 2.30 2011/9/6 132 4.46 3.10 2011/9/13 36 3.48 2.40 2011/9/20 35 3.49 2.65 2011/9/27 21 3.31 2.85 2011/10/4 9 2.59 2.00 2011/10/11 6 2.53 2.40 2011/10/18 5 2.40 2.18 2011/10/25 6 2.97 2.65 2011/11/1 5 2.64 2.40 2011/11/8 10 3.17 2.48 2011/11/15 7 2.32 2.78 2011/11/22 5 2.72 2.54 2011/11/29 4 2.32 2.70 2011/12/6 5 2.77 2.85 2011/12/13 2 2.97 2.74 2011/12/20 7 2.48 2.85 2011/12/26 6 2.81 2.70 2012/1/5 5 2.09 2.81 2012/1/10 3 2.59 3.00 2012/1/17 4 2.32 3.00 2012/1/20 9:00 3 2.32 3.00 2012/1/20 16:00 5 2.31 3.00 2012/1/21 5 2.72 3.00 2012/1/22 7 3.47 3.00 2012/1/23 10 4.16 4.84 2012/1/24 5 1.90 2.74 2012/1/31 3 2.09 2.74 Sampling Date 2012/2/7 1 2.68 2.74 2012/2/8 2 3.24 3.40 2012/2/9 8 2.39 3.23 2012/2/14 7 2.21 3.22 2012/2/21 1 1.90 2.95 2012/2/23 6 - 2.74 2012/2/24 8 2.32 2.60 2012/2/28 8 - 2.85 2012/3/1 7 - 2.98 2012/3/2 7 1.90 3.06 2012/3/6 14 4.14 3.24 2012/3/7 8 2.32 3.94 2012/3/8 11 2.98 2.40 2012/3/9 7 2.85 2.30 2012/3/12 9 3.01 2.48 2012/3/19 9 2.84 2.98 2012/3/26 10 2.40 3.04 2012/4/3 11 2.40 2.30 2012/4/10 7 2.09 2.60 2012/4/17 9 2.96 2.30 2012/4/24 15 3.37 2.48 河川水中のバクテロイデスの濃度変動および平均濃度を図 3.3～3.10 に示す。また、ブ タおよび反芻動物バクテロイデスの平均濃度に対するヒトバクテロイデスの平均濃度の割 合を図3.11 に示す。いずれの地点においても、バクテロイデスの濃度には顕著な季節変動 は見られなかった。しかしながら、1 週間に 1 回以上の頻度で調査をした利根川において は、突発的にバクテロイデスの濃度が高くなることがあり、定常的ではない強い糞 便汚染 を受けていたことが示唆された。水系感染リスクを考える上で、このような突発的な濃度 変動は非常に大きな影響を与え得るため、さらに採水間隔を短くした採水調査を行うこと
により、どの程度の濃度変動が生じるのかをより詳細に検討することが求められる。 富士川においては、3 種類のバクテロイデスの中でブタバクテロイデスが最も高い濃度 で検出され、ブタの糞便汚染を強く受けていることが示唆された。 多摩川においては、地 点ごとに検出結果に特徴があり、大腸菌の汚染レベルが低かった羽村取水堰ではバクテロ イデスはほとんど検出されず、反芻動物バクテロイデスが 2 回検出されたのみであった。 一方、稲城大橋と二子橋では、ヒトバクテロイデスがすべての試料から高い濃度で検出さ れ、恒常的にヒト由来の糞便汚染を受けていることが示唆された。利根川においては、反 芻動物バクテロイデスの濃度が最も高く、ブタバクテロイデス、ヒトバクテロイデスの順 で検出されており、いずれの宿主による糞便汚染もある程度以上強く受けていることが示 唆された。 富士川流域と利根川流域では、ブタやウシをはじめとした家畜の飼育が盛んである。一 方、多摩川流域では畜産は両流域ほど盛んではなく、都市部を流下することから中下流域 には多くの下水処理場が立地しており、河川流量の半分程度を下水処理水が占めていると されている。これは、本事業におけるバクテロイデス遺伝子マーカーを用いた糞便汚染源 解析結果と概ね一致するものであった。 (-) 3 4 5 6 7 8 9 10
Con
cen
tr
at
io
n
(lo
g c
o
p
ies/
L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
(-) 4 5 6 7 8 9 10
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
Con
cen
tr
at
io
n
(log
co
p
ies/
L)
図 3.4 富士橋におけるバクテロイデスの平均濃度 (-) 3 4 5 6 7 8 9 10Con
cen
tr
at
io
n
(log
co
p
ies/
L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
(-) 3 4 5 6 7 8 9 10
Con
cen
tr
at
io
n
(log
co
p
ies/
L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
図 3.6 稲城大橋におけるバクテロイデスの濃度変動 (-) 3 4 5 6 7 8 9 10
Con
cen
tr
at
io
n
(log
co
p
ies/
L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
A) Hamura Water Weir (-) 3 4 5 6 7 8 9 10
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
C
on
cen
tr
at
ion
(
log
cop
ies/
L)
B) Inagi-ohashi Bridge (-) 3 4 5 6 7 8 9 10Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
C
on
cen
tr
at
ion
(
log
cop
ies/
L)
C) Futako-bashi Bridge (-) 3 4 5 6 7 8 9 10Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
C
on
cen
tr
at
ion
(
log
cop
ies/
L)
図 3.8 多摩川におけるバクテロイデスの平均濃度(-) 4 5 6 7 8 9 10 2011/5 2011/6 2011/7 2011/8 2011/9 2011/10 2011/11 2011/12 2012/1 2012/2 2012/3 2012/4 Con cen tr at io n ( lo g co p ies/ L)
Hum-Bac Pig-Bac Rum-Bac
図 3.9 利根川におけるバクテロイデスの濃度変動 (-) 4 5 6 7 8 9 10
Hum-Bac Pug-Bac Rum-Bac
C
on
cen
tr
at
io
n
(lod
c
op
ies/
L)
図 3.10 利根川におけるバクテロイデスの平均濃度-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Site 1
Site 2
Site 3
Tamagawa River
Fujikawa
River
Tonegawa
River
Arakawa
River
Rat
io
o
f H
u
m
-Bac
to
Pig
-Bac
Rat
io
o
f
H
u
m
-Bac
to
Ru
m
-Bac
Hum-Bac/Pig-Bac
Hum-Bac/Rum-Bac
図 3.11 河川水中におけるブタおよび反芻動物バクテロイデスの平均濃度に対する ヒトバクテロイデスの平均濃度の割合4. まとめ
本事業では、現在主流の微生物遺伝子マーカーであるバクテロイデスに加えて、ウイル ス系の微生物遺伝子マーカーである F-RNA ファージを用いることでより詳細な河川水中 の糞便汚染源解析が可能となるかを評価するため、糞便汚染源試料（下水、コミュニティ プラント排水および畜産排水）からの微生物遺伝子マーカーの検出特性を 把握し、さらに、 異なる流域特性を持つ河川水（富士川、多摩川および利根川）を対象に糞便汚染源の解析 を試みた。本事業で得られた知見は以下に示す通りである。 1） 糞便汚染源試料（下水、コミュニティプラント排水および畜産排水）から単離した F ファージのプラックを同定した結果、ヒト糞便汚染源である下水流入水、下水 2 次処 理水およびコミュニティプラント排水中の F-RNA ファージの遺伝子群の検出結果には 共通した傾向は認められず、ヒト糞便汚染指標として F-RNA ファージを用いることは 困難であることが示唆された。また、畜産飼育施設の上流と下流の河川水中で優占す る遺伝子群の平均濃度に大きな差はなく、動物糞便汚染試料として F-RNA ファージを 用いることも困難であると推察された。この結果より、F-RNA ファージの遺伝子群の 同定法は、ヒトおよび動物糞便による河川水の汚染の影響を評価する上で有用ではな いと判断された。 2） 糞便汚染源試料中の 3 種類の宿主（ヒト、ブタおよび反芻動物）特異的なバクテロイ デスを検出した結果、下水流入水と下水 2 次処理水、コミュニティプラント排水から はヒトバクテロイデスが他のバクテロイデスよりも 3～4 log 程度高い平均濃度で検出 された。また、畜産飼育施設の下流に位置する地点の河川水からは ブタバクテロイデスが高い平均濃度で検出され、下流地点よりも約 3 log、ヒトバクテロイデスよりも約 2 log 高い値であった。これらの結果より、ヒトおよびブタバクテロイデスを用いるこ とにより、ヒトとブタから受ける糞便汚染源のレベルが解析可能となることが示唆さ れた。 3） 糞便汚染源試料の測定によって微生物遺伝子マーカーとして F-RNA ファージよりも有 効であることが示唆されたバクテロイデスを用い、異なる流域特性を有する 3 河川（5 地点、119 試料）を対象とした河川水中の糞便汚染源解析を試みた。その結果、流域特 性に呼応した宿主のバクテロイデスが検出される傾向が認められ、都市河川ではヒト バクテロイデスが優占しており、畜産の盛んな流域ではブタおよび反芻動物バクテロ イデスがヒトバクテロイデ スよりも優占していることが明らかとなった。本事業で適 用を試みたウイルス系の微生物遺伝子マーカーの有効性は低いことが示唆されたもの の、現在主流のバクテロイデスを用いることで、国内河川においても高精度の糞便汚 染源解析源解析が可能となることが示された。
謝辞
本事業の実施にあたり、下水試料の採取にご協力を頂いた下水処理場の関係者に深謝す る。参考文献
1） 原本英司、片山浩之、浅見真理、秋葉道宏、国包章一（2010）河川水からのウイルス 及び原虫の同時濃縮法の開発、水道協会雑誌、Vol. 79、No. 10、pp. 2-11.2） Haramoto, E., Katayama, H., Asami, M., Akiba, M. (2012) Development of a novel method for simultaneous concentration of viruses and protozoa from a single water sample, Journal of Virological Methods, Vol. 182, No. 1-2, pp. 62-69.
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9） Haramoto, E., Kitajima, M., Katayama, H., Asami, M., Akiba, M., Kunikane, S. (2009): Application of real-time PCR assays to genotyping of F-specific phages in river water and sediments in Japan, Water Research, Vol. 43, No. 15, pp. 3759-3764.
・助成事業者紹介 原本 英司
現職：国立大学 山梨大学
大学院総合研究部・准教授 学位：博士（工学）
