研究分担者 研究協力者
Ａ．研究目的
原発性免疫不全症（
異常による
己免疫疾患の合併が多く、体細胞突然変異の障 害がその原因の一つとして考えられている。ま た、Common variable immunodeficiency
のなかには
免疫を発症する例が存在する。そのため、自己 免疫疾患のモデルとして
BCRを解析することは有用であると考えられ る。
これまで我々は
伝子再構成解析やキャピラリーシークエンス による体細胞突然変異解析を実施してきたが、
一度に解析可能なリード数に限りがあるなど の問題があった。本研究では次世代シークエン サーを用いることにより、多検体同時に十分な リード数の解析を可能とすることを目的とし て研究を行った。
Ｂ．研究方法 健常者（
伝子の同定された
〜46 歳）からインフォームド・コンセントを とり、EDTA
後にRNA を合成した後、
的なプライマーを用いた IgG、IgA
研究要旨 本研究では
析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者 者6例について
領域における
びパターンを検討した。
損症患者では 率に偏りを認めた でA>T、
りの異常を認めた。今後は、原因不明の患者を含む 進めていきたい。
厚生労働科学研究費補助金
次世代シークエンサーを
研究分担者 森尾友宏 研究協力者 今井耕輔 高島健浩
Ａ．研究目的
原発性免疫不全症（
異常によるHyper IgM syndrome
己免疫疾患の合併が多く、体細胞突然変異の障 害がその原因の一つとして考えられている。ま
Common variable immunodeficiency のなかにはT細胞、
免疫を発症する例が存在する。そのため、自己 免疫疾患のモデルとして
を解析することは有用であると考えられ これまで我々はFACS
伝子再構成解析やキャピラリーシークエンス による体細胞突然変異解析を実施してきたが、
一度に解析可能なリード数に限りがあるなど の問題があった。本研究では次世代シークエン サーを用いることにより、多検体同時に十分な リード数の解析を可能とすることを目的とし て研究を行った。
Ｂ．研究方法 健常者（4 例、3 伝子の同定されたPID
歳）からインフォームド・コンセントを EDTA加末梢血を採取した。単核球分離 RNAを抽出し、
を合成した後、IgH、
的なプライマーを用いた
IgA、TCRβの可変領域全長の 研究要旨
本研究では次世代シークエンサーを用いた手法 析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者
例について解析を行った。
領域におけるN-addition びパターンを検討した。
患者ではTCRβ 率に偏りを認めた。また、
、C>A変異が増加していた。
りの異常を認めた。今後は、原因不明の患者を含む 進めていきたい。
厚生労働科学研究費補助金
免疫アレルギー疾患等実用化研究事業
シークエンサーを および
森尾友宏 東京医科歯科大学大学院 今井耕輔 東京医科歯科大学大学院 高島健浩 愛媛
原発性免疫不全症（PID）のなかでも、
Hyper IgM syndrome
己免疫疾患の合併が多く、体細胞突然変異の障 害がその原因の一つとして考えられている。ま
Common variable immunodeficiency
細胞、B細胞の分化障害から自己 免疫を発症する例が存在する。そのため、自己 免疫疾患のモデルとしてPIDにおける
を解析することは有用であると考えられ FACSによる
伝子再構成解析やキャピラリーシークエンス による体細胞突然変異解析を実施してきたが、
一度に解析可能なリード数に限りがあるなど の問題があった。本研究では次世代シークエン サーを用いることにより、多検体同時に十分な リード数の解析を可能とすることを目的とし
3 歳〜35 歳）、および原因遺 PID患者（6
歳）からインフォームド・コンセントを 加末梢血を採取した。単核球分離 を抽出し、5'RACE反応により
、TCRb の定常領域に特異 的なプライマーを用いたPCR反応により
の可変領域全長の
次世代シークエンサーを用いた手法 析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者
解析を行った。シークエンス結果から addition、Palindrome
びパターンを検討した。遺伝子変異が同定された患者の β、IgM、IgA
。また、体細胞突然変異の頻度が低下してお 変異が増加していた。
りの異常を認めた。今後は、原因不明の患者を含む
厚生労働科学研究費補助金 難治性疾患克服研究事業 免疫アレルギー疾患等実用化研究事業
分担研究報告書
シークエンサーを用いたヒト
および体細胞突然変異解析法
東京医科歯科大学大学院 東京医科歯科大学大学院 愛媛大学大学院
）のなかでも、AID Hyper IgM syndrome (HIGM)では自 己免疫疾患の合併が多く、体細胞突然変異の障 害がその原因の一つとして考えられている。ま
Common variable immunodeficiency（CVID 細胞の分化障害から自己 免疫を発症する例が存在する。そのため、自己
におけるTCR を解析することは有用であると考えられ
によるT細胞受容体遺 伝子再構成解析やキャピラリーシークエンス による体細胞突然変異解析を実施してきたが、
一度に解析可能なリード数に限りがあるなど の問題があった。本研究では次世代シークエン サーを用いることにより、多検体同時に十分な リード数の解析を可能とすることを目的とし
歳）、および原因遺 6例、0歳6ヶ月 歳）からインフォームド・コンセントを 加末梢血を採取した。単核球分離 反応によりcDNA の定常領域に特異 反応によりIgM の可変領域全長の cDNA 次世代シークエンサーを用いた手法 析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者
シークエンス結果から Palindrome配列、ならびに 遺伝子変異が同定された患者の
IgAでCDR3領域長に偏りを認め 体細胞突然変異の頻度が低下してお 変異が増加していた。他の原因遺伝子の同定された りの異常を認めた。今後は、原因不明の患者を含む
難治性疾患克服研究事業
免疫アレルギー疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患実用化研究分野
研究報告書（Ｈ26
いたヒト T 細胞 体細胞突然変異解析法
東京医科歯科大学大学院 東京医科歯科大学大学院
大学大学院医学系研究科
AID では自 己免疫疾患の合併が多く、体細胞突然変異の障 害がその原因の一つとして考えられている。ま CVID）
細胞の分化障害から自己 免疫を発症する例が存在する。そのため、自己 TCR、
を解析することは有用であると考えられ 細胞受容体遺 伝子再構成解析やキャピラリーシークエンス による体細胞突然変異解析を実施してきたが、
一度に解析可能なリード数に限りがあるなど の問題があった。本研究では次世代シークエン サーを用いることにより、多検体同時に十分な リード数の解析を可能とすることを目的とし
歳）、および原因遺 ヶ月 歳）からインフォームド・コンセントを 加末梢血を採取した。単核球分離 cDNA の定常領域に特異 IgM、
cDNA を
増幅した。これらの 列を付加し、
ークエンスを行った（図
図１
（倫理面への配慮）
本研究は、本学医学部倫理委員会にて承認さ れた
上同意を得た検体について Ｃ．研究結果
シークエンス結果から 領域の利用率、
N-addition
域における体細胞突然変異の頻度およびパタ ーンを検討した。
原因遺伝子の同定された 次世代シークエンサーを用いた手法により、従来の解析を越える 析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者
シークエンス結果からCDR3 配列、ならびにFR3 遺伝子変異が同定された患者の
領域長に偏りを認め 体細胞突然変異の頻度が低下してお
他の原因遺伝子の同定された りの異常を認めた。今後は、原因不明の患者を含むHIGM
難治性疾患克服研究事業 難治性疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患実用化研究分野
26年度）
細胞・B 細胞受容体遺伝子再構成 体細胞突然変異解析法に関する
発生発達病態学分野
小児･周産期地域医療学寄附講座 医学系研究科 小児医学講座
増幅した。これらの 列を付加し、Miseq ークエンスを行った（図
図１. 次世代シークエンサーを用いた
（倫理面への配慮）
本研究は、本学医学部倫理委員会にて承認さ れた研究計画に従い、説明書を被験者に説明の 上同意を得た検体について
Ｃ．研究結果
シークエンス結果から 領域の利用率、
addition、 Palindrome
域における体細胞突然変異の頻度およびパタ ーンを検討した。
原因遺伝子の同定された により、従来の解析を越える 析を可能とすることを目的として研究を行った。健常者4例および
CDR3領域長、
FR3領域における体細胞突然変異の頻度およ 遺伝子変異が同定された患者のうち、自己免疫性疾患を合併した
領域長に偏りを認め、IgM 体細胞突然変異の頻度が低下しており、
他の原因遺伝子の同定されたPID HIGM やCVID
難治性疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患実用化研究分野
細胞受容体遺伝子再構成 する研究
発生発達病態学分野
小児･周産期地域医療学寄附講座 小児医学講座 大学院
増幅した。これらのPCR産物にアダプター配 Miseq（illumina
ークエンスを行った（図1
次世代シークエンサーを用いた
（倫理面への配慮）
本研究は、本学医学部倫理委員会にて承認さ 研究計画に従い、説明書を被験者に説明の 上同意を得た検体について
シークエンス結果からCDR3 領域の利用率、JUNCTION
Palindrome配列、ならびに 域における体細胞突然変異の頻度およびパタ ーンを検討した。
原因遺伝子の同定された により、従来の解析を越える
例および原因遺伝子の同定された 領域長、D・J領域の利用率、
領域における体細胞突然変異の頻度およ 自己免疫性疾患を合併した
IgM、IgAのD り、IgMでA>G
PID患者では、おおむね既報の通 CVID患者に対してもこうした解析を
難治性疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患実用化研究分野
細胞受容体遺伝子再構成
教授 小児･周産期地域医療学寄附講座
大学院生
産物にアダプター配 illumina 社）を用いてシ
1）。
次世代シークエンサーを用いたTCR・BCR
本研究は、本学医学部倫理委員会にて承認さ 研究計画に従い、説明書を被験者に説明の 上同意を得た検体について、解析を行っ
CDR3領域長、
JUNCTION領域における
配列、ならびに 域における体細胞突然変異の頻度およびパタ
原因遺伝子の同定されたPID患者の内訳は、
により、従来の解析を越えるTCR・BCR 原因遺伝子の同定された
領域の利用率、JUNCTION 領域における体細胞突然変異の頻度およ
自己免疫性疾患を合併した
D領域、J領域の利用 A>G、C>T変異が、
患者では、おおむね既報の通 患者に対してもこうした解析を 准教授
産物にアダプター配 社）を用いてシ
BCR解析法
本研究は、本学医学部倫理委員会にて承認さ 研究計画に従い、説明書を被験者に説明の 解析を行った。
領域長、D・J 領域における 配列、ならびにFR3領 域における体細胞突然変異の頻度およびパタ
患者の内訳は、
BCR配列の解
原因遺伝子の同定されたPID患 JUNCTION 領域における体細胞突然変異の頻度およ
自己免疫性疾患を合併したLRBA欠 領域の利用 変異が、IgA 患者では、おおむね既報の通 患者に対してもこうした解析を
PIK3CD 例、ICOS 欠損症患者は
ど）を合併しており、本研究の趣旨に最も適合 していると考えた。
LRBA の0.4%であ
解析可能であった。
領域長に偏りを認め
域、J領域の利用率に偏りを認めた た、体細胞突然変異の頻度が低下してお 4）、IgM
C>A変異が増加し その他の
然変異の頻度が低下していた、
JUNCTION めた。
PIK3CD 2例、LRBA
ICOS 1例であった。その中でも、
患者は自己免疫疾患
合併しており、本研究の趣旨に最も適合 していると考えた。
LRBA欠損症患者の であったが、
解析可能であった。
領域長に偏りを認め
領域の利用率に偏りを認めた 体細胞突然変異の頻度が低下してお
IgMでA>G、C>T 変異が増加していた その他のPID患者では
然変異の頻度が低下していた、
JUNCTION領域における
図2. CDR3
図3. D領域、
LRBA 1例、IL2RG 1 例であった。その中でも、
自己免疫疾患（1
合併しており、本研究の趣旨に最も適合 していると考えた。
欠損症患者のB細胞分画 ったが、BCR配列について 解析可能であった。TCRβ、IgM
領域長に偏りを認め（図2）、IgM 領域の利用率に偏りを認めた 体細胞突然変異の頻度が低下してお
C>T変異が、
ていた（図5
患者ではIL2RG患者で体細胞突 然変異の頻度が低下していた、
領域におけるN-addition
2. CDR3領域長の解析
領域、J領域の利用率
IL2RG 1例、ATM 1 例であった。その中でも、LRBA
1型DM、ITP 合併しており、本研究の趣旨に最も適合
分画はリンパ球 配列についても十分
IgM、IgAでCDR3 IgM、IgAのD 領域の利用率に偏りを認めた（図3）。ま 体細胞突然変異の頻度が低下しており（図
変異が、IgAでA>T 5）。
患者で体細胞突 然変異の頻度が低下していた、ATM患者では additionの減少を認
の解析
領域の利用率
ATM 1 LRBA
ITPな 合併しており、本研究の趣旨に最も適合
リンパ球 も十分
CDR3 D領
）。ま り（図 A>T、
患者で体細胞突 患者では の減少を認
Ｄ．考察
原因遺伝子の同定された
むね既報の通りの異常を認めた。今後はさらに 他の遺伝子変異既知の患者で解析を重ね、有用 性を検証した上で、
変異未知の患者について検討し、病態解析の一 助としていきたい。
Ｅ．結論
次世代シークエンサーを用いたヒト
B細胞受容体遺伝子再構成解析および体細胞突 然変異解析の方法を構築した。また、実際に 患者検体を用いて解析し、その実用性を検証し た。
G．研究発表 1.
1.
図
図
Ｄ．考察
原因遺伝子の同定された
むね既報の通りの異常を認めた。今後はさらに 他の遺伝子変異既知の患者で解析を重ね、有用 性を検証した上で、
変異未知の患者について検討し、病態解析の一 助としていきたい。
Ｅ．結論
次世代シークエンサーを用いたヒト
細胞受容体遺伝子再構成解析および体細胞突 然変異解析の方法を構築した。また、実際に 患者検体を用いて解析し、その実用性を検証し た。
．研究発表 論文発表
Endo A, Watanabe K, Ohye T, Matsubara T, Shimizu N, Kurahashi H, Yoshikawa T, Katano H, Inoue N, Imai K, Takagi M, T, Mizutani S.
図4. 体細胞突然変異の頻度
図5. 体細胞突然変異の
原因遺伝子の同定された
むね既報の通りの異常を認めた。今後はさらに 他の遺伝子変異既知の患者で解析を重ね、有用 性を検証した上で、HIGM、
変異未知の患者について検討し、病態解析の一 助としていきたい。
次世代シークエンサーを用いたヒト
細胞受容体遺伝子再構成解析および体細胞突 然変異解析の方法を構築した。また、実際に 患者検体を用いて解析し、その実用性を検証し
Watanabe K, Ohye T, Matsubara T, Shimizu N, Kurahashi H, Yoshikawa T, Katano H, Inoue N, Imai K, Takagi M,
, Mizutani S. Molecular and virological 体細胞突然変異の頻度
体細胞突然変異のパターン
原因遺伝子の同定されたPID患者では、おお むね既報の通りの異常を認めた。今後はさらに 他の遺伝子変異既知の患者で解析を重ね、有用
、CVIDを含む遺伝子
変異未知の患者について検討し、病態解析の一
次世代シークエンサーを用いたヒト
細胞受容体遺伝子再構成解析および体細胞突 然変異解析の方法を構築した。また、実際に 患者検体を用いて解析し、その実用性を検証し
Watanabe K, Ohye T, Matsubara T, Shimizu N, Kurahashi H, Yoshikawa T, Katano H, Inoue N, Imai K, Takagi M,
Molecular and virological 体細胞突然変異の頻度
パターン
患者では、おお むね既報の通りの異常を認めた。今後はさらに 他の遺伝子変異既知の患者で解析を重ね、有用 を含む遺伝子 変異未知の患者について検討し、病態解析の一
次世代シークエンサーを用いたヒトT細胞・
細胞受容体遺伝子再構成解析および体細胞突 然変異解析の方法を構築した。また、実際にPID 患者検体を用いて解析し、その実用性を検証し
Watanabe K, Ohye T, Matsubara T, Shimizu N, Kurahashi H, Yoshikawa T, Katano H, Inoue N, Imai K, Takagi M, Morio
Molecular and virological
evidence of viral activation from chromosomally integrated HHV-6A in a patient with X-SCID. Clin. Infect. Dis.
59:545-8, 2014.
2. Nakatani K, Imai K, Shigeno M, Sato H, Tezuka M, Okawa T, Mitsuiki N, Isoda T, Tomizawa D, Takagi M, Nagasawa M, Kajiwara M, Yamamoto M, Arai A, Miura O, Kamae C, Nakagawa N, Homma K,
Nonoyama S, Mizutani S, Morio T. Cord blood transplantation is associated with rapid B cell neogenesis compared with bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 49:1155-61, 2014.
2. 学会発表
1. Imai K, Tsujiita Y, Mitsui-Sekinaka K, Mitsuiki N, Takashima T, Okano T, Aoki Y, Kimoto F, Inoue M, Iwasaki F, Kaneko T, Waragai T, Sano H, Kikuta A, Morio T, Nonoyama S. Hematopoietic Stem Cell Transplantation for the Patients with Activated P13K-Delta Syndrome. 16th Biennial Meeting of the European Society of Immunodeficiencies (ESID2014). Prague, Czech Republic. October 2014.
2. Takashima T, Tsujita Y, Yeh T.W, Mitsuiki N, Kanegane H, Kracker S, Durandy A,
Nonoyama S, Morio T, Imai K. Clinical and Immunological Features of Patients with Gain-of-Function PIK3CD Mutations in Japan. 16th Biennial Meeting of the European Society of Immunodeficiencies (ESID2014). Prague, Czech Republic.
October 2014.
3. Mitsuiki N, Yang X, Bartol S, Kosaka Y, Takada H, Imai K, Kanegane H, Mizutani S, Van der Burg M, Van Zelm M, Ohara O,
Morio T. Mutations in Bruton’s Tyrosine Kinase Impairiga Responses. 16th Biennial Meeting of the European Society of Immunodeficiencies (ESID2014). Prague, Czech Republic. October 2014.
4. 岡野 翼、今井耕輔、宮脇零士、奥津美夏、
高島健浩、青木由貴、富澤大輔、高木正稔、
梶原道子、水谷修紀、森尾友宏：炎症性腸 疾患とMycobacterium avium感染症を合併 したNEMO異常症に対する非血縁者間骨 髄移植、第56回日本小児血液・がん学会 学術集会、岡山、2014年11月29日 5. 谷ヶ崎博、平井麻衣子、下澤克宜、金澤剛
二、陳 基明、高島健浩、今井耕輔、森尾 友宏、高橋昌里：全腸性の粘膜下リンパ増 殖性疾患と軽度の免疫異常を示す女児に 同定されたPIK3CD遺伝子の胚細胞性変 異、第56回日本小児血液・がん学会学術 集会、岡山、2014年11月28日
6. 高島健浩、辻田由喜、今井耕輔、関中佳奈 子、YehTsu-Wen、満生紀子、奥野友介、
村松秀城、白石友一、千葉健一、田中洋子、
宮野 悟、吉田健一、小川誠司、金兼弘和、
小島勢二、小原 收、森尾友宏、野々山恵 章：Activated PI3K-δ syndrome 患者の臨 床的・免疫学的特徴、第42回日本臨床免 疫学会総会、東京、2014年9月25日 H．知的財産権の出願・登録状況
1. 特許取得 該当なし 2. 実用新案登録
該当なし 3. その他
該当なし
