マニュアル参考様式 Ver.1
食 品 中 の 健 康 機 能 性 成 分 の 分 析 法 マ ニ ュ ア ル
平 成 22年 3月 作 成
四 国 地 域 イ ノ ベ ー シ ョ ン 創 出 協 議 会
地 域 食 品 ･健 康 分 科 会 編
[email protected]
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大 豆 の イ ソ フ ラ ボ ン
作 成 者 ： 近 畿 中 国 四 国 農 業 研 究 セ ン タ ー
大 豆 育 種 研 究 近 中 四 サ ブ チ ー ム
主 任 研 究 員 高 田 吉 丈
東 北 農 業 研 究 セ ン タ ー
大 豆 育 種 研 究 東 北 サ ブ チ ー ム
サ ブ チ ー ム 長 菊 池 彰 夫
１ ． 大 豆 に つ い て
１ ． １ 概 要
大 豆 は 「 畑 の 肉 」 と 呼 ば れ 、 良 質 な 蛋 白 質 や 脂 質 を 豊 富 に 含 み 、 さ ら に イ ソ フ ラ ボ
ン や サ ポ ニ ン 等 の 機 能 性 成 分 を 含 ん だ 優 れ た 食 材 で あ る 。 大 豆 は 豆 腐 、 味 噌 、 醤 油 等
の 原 材 料 で あ り 、 国 民 の 健 康 に 対 す る 関 心 の 高 ま り か ら 見 直 さ れ て い る 日 本 型 食 生 活
の 中 心 的 な 役 割 を 担 っ て い る 。 し か し な が ら 、 大 豆 の 自 給 率 は 5%で 、 食 用 に 限 っ て み
て も 自 給 率 は 21%で あ り 、 日 本 の 大 豆 需 要 量 の 大 部 分 を 輸 入 に 頼 っ て い る 。
四 国 4 県 の 大 豆 作 に つ い て 見 る と 、 2008 年 の 作 付 面 積 は 937ha で 、 全 国 （ 14 万 7 千
ha） 対 比 0.6%、 収 穫 量 は 1,280t、 10a 当 た り 収 量 は 137kg で あ っ た 。 栽 培 さ れ て い る
品 種 と し て は 約 8 割 が 黄 大 豆 で 、そ の う ち の 90%を 豆 腐 加 工 適 性 に 定 評 の あ る「 フ ク ユ
タ カ 」 が 占 め て い る 。 そ れ 以 外 は 、 黒 大 豆 を 中 心 に 各 地 の 在 来 種 等 が 少 量 作 付 さ れ て
い る 。 例 を 挙 げ る と 、 愛 媛 県 で 栽 培 さ れ て い る 在 来 種 の 「 う い ろ う 豆 」 は 、 小 粒 の 黒
大 豆 で 、 子 葉 部 分 （ 中 身 ） が 緑 色 と い う 特 徴 を 持 ち 、 ご 飯 に 混 ぜ て 炊 く と 種 皮 の ア ン
ト シ ア ニ ン が ご 飯 に 移 り 、 淡 い ピ ン ク 色 を 呈 す る 。 ま た 、 特 産 品 的 な 育 成 品 種 の 育 成
と し て 、 香 川 県 の 「 香 川 黒 1 号 」 が 挙 げ ら れ る 。 本 品 種 は 、 香 川 大 、 香 川 県 、 香 川 県
農 業 協 同 組 合 が 共 同 育 成 し た 大 粒 の 黒 大 豆 品 種 で あ り 、 2008 年 か ら 県 内 で 本 格 的 な 栽
培 が 始 ま り 、 和 三 盆 糖 を 使 用 し た 煮 豆 や 黒 大 豆 焼 酎 等 の 製 品 化 が 進 め ら れ て い る 。 ま
た 、 生 産 物 を 選 別 し 、 大 粒 で 良 質 な も の だ け を 「 讃 州 大 黒 」 （ 商 標 登 録 第 5235274 号 ）
と し て 売 り 出 し 、 ブ ラ ン ド 化 が 進 め ら れ て い る 。
１ ． ２ 大 豆 の 機 能 性 成 分
大 豆 種 子 に 含 ま れ る 機 能 性 成 分 と し て 、 大 豆 蛋 白 （ 血 中 コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 作 用 1）
2)、 肥 満 予 防 3)） 、 リ ン 脂 質 大 豆 ペ プ チ ド （ 総 コ レ ス テ ロ ー ル 値 低 下 4)） 、 オ リ ゴ 糖
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（ ビ フ ィ ズ ス 菌 増 殖 作 用 5)6)）、イ ソ フ ラ ボ ン（ 後 述 ）、サ ポ ニ ン（ 大 腸 ガ ン 阻 害 7）、
AIDS ウ イ ル ス 感 染 阻 害 8)） 等 が 報 告 さ れ て い る 。
１ ． ３ 近 畿 中 国 四 国 農 業 研 究 セ ン タ ー に お け る 大 豆 育 種
当 研 究 セ ン タ ー で は 、 近 畿 ・ 中 国 ・ 四 国 地 域 で の 栽 培 に 適 し た 大 豆 の 基 幹 品 種 を 育
成 す る た め に 、 2001 年 に 大 豆 育 種 研 究 室 （ 大 豆 育 種 研 究 近 中 四 サ ブ チ ー ム 、 香 川 県 善
通 寺 市 ）を 新 設 し 、大 豆 育 種 を 開 始 し た 。主 な 育 種 目 標 を 豆 腐 加 工 適 性 、機 械 化 適 性 、
ウ イ ル ス 病 抵 抗 性 付 与 等 と し 、 こ れ ま で に 、 豆 腐 加 工 適 性 の 優 れ る 「 四 国 1 号 」 、 味
噌 加 工 適 性 の 優 れ る 「 四 国 3 号 」 、 青 臭 み の 少 な い リ ポ キ シ ゲ ナ ー ゼ 欠 失 の 「 四 国 10
号 」 等 を 育 成 し て い る 。 研 究 面 で は 、 ウ イ ル ス 病 抵 抗 性 選 抜 DNA マ ー カ ー の 開 発 、 タ
ン パ ク 質 組 成 の 改 良 や イ ソ フ ラ ボ ン や サ ポ ニ ン の 含 量 や 組 成 等 の 子 実 成 分 に 関 す る 研
究 に 取 り 組 ん で い る 。
＜ 引 用 ・ 参 考 文 献 ＞
1. Anderson, J. W.
et al
. Meta-analysis of the effects of soy protein intake
on serum lipids. New Engl. J. Med. 333:276-282 (1995)
2. BaBa, N.
et al
. Effects of casein versus soyprotein diets on body composition
and serum lipid levels in adult rats. Nutr. Res. 12:279-288 (1992)
3. Shinjo, S.
et al
. Comparative effect of casein and soybean protein isolate
on body fat accumulation in adult rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 38:247-253
(1992)
4. Hori
et al
. Soy protein hydrolyzate with bound phospholipids reduces serum
cholesterol levels in hypercholesterolemic adult male volunteers. Biosci
Biotechnol Biochem. 65:72-78 (2001)
5. 和 田 ら ． マ ン ニ ノ ト リ オ ー ス の ヒ ト 腸 内 フ ロ ー ラ に 及 ぼ す 影 響 ． 日 本 栄 養 ・ 食 糧
学 会 誌 44:171-176 (1991)
6. 和 田 ら ． 大 豆 オ リ ゴ 糖 の 各 摂 取 量 に よ る ヒ ト 腸 内 フ ロ ー ラ に 及 ぼ す 影 響 ． ビ フ ィ
ズ ス 5:51-54 (1991)
7. Ellington, A.A.
et al
. Induction of macroautophagy in human colon cancer
cells by soybean B-group triterpenoid saponins. Carcinogenesis 26:159-167
(2005)
8. Nakashima, H.
et al
. Inhibitory effect of glycosides like saponin from
soybean on the infectivity of HIV in vitro. AIDS 3： 655-658 (1989)
２ ． 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン に つ い て の 説 明
２ ． １ 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン の 種 類
イ ソ フ ラ ボ ン は フ ラ ボ ノ イ ド の 1 種 で 、 大 豆 、 ク ズ 、 カ ン ゾ ウ な ど マ メ 科 植 物 に 多
く 含 ま れ て い る 。 そ れ ら の う ち 日 常 の 食 生 活 で イ ソ フ ラ ボ ン を 摂 取 で き る 食 品 素 材 と
考 え ら れ る の は 、 大 豆 だ け で あ る 。 大 豆 の イ ソ フ ラ ボ ン に は 、 ダ イ ゼ イ ン 、 ゲ ニ ス テ
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イ ン 、 グ リ シ テ イ ン の 3 種 類 の ア グ リ コ ン と 各 々 の 配 糖 体 （ グ リ コ シ ド ） で あ る ダ イ
ジ ン 、 ゲ ニ ス チ ン 、 グ リ シ チ ン 、 そ れ ら 配 糖 体 の マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 、 ア セ チ ル 化 配 糖
体 の 合 計 12 種 類 が 存 在 す る （ 図 ２ ． １ ）。
図 ２ ． １ 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン の 化 学 構 造 式
２ ． ２ 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン の 機 能 性
イ ソ フ ラ ボ ン の 機 能 性 と し て 、 骨 密 度 低 下 の 防 止 1)2)3)、 ホ ッ ト フ ラ ッ シ ュ （ ほ て
り ）の 防 止 4)、発 ガ ン・ガ ン 細 胞 増 殖 抑 制 5)6)7)、抗 酸 化 作 用 8)等 が 報 告 さ れ て い る 。
マニュアル参考様式 Ver.1
２
ラ ボ ン 含 量 に 関 す る
数 の QTL（ 量 的 形 質 遺 伝 子 座 ） の 検 出 が 報 告 さ れ て い る 13）。
２
タ マ ホ マ レ 」 （ 長 野 県 、 1982 年 品 種 登 録 ） も イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 の 高 い 品 種 で あ
。
＜
1. I
loss caused by estrogen deficiency. Endocrinology.
2. P
y in postmenopausal women. Am. J. Clinical Nutrition.
3. A
4. Q
er Treatment
5. A
yrosine-specific
6. C
erican and Asian diets. J.
7. H
bean phytoestrogen intake and cancer risk. J. Nutr.
8. N
9. 境
実 中 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 お よ び そ の 組 成 ． 東 北 農 研
． ３ 大 豆 子 実 中 の イ ソ フ ラ ボ ン 含 量
ダ イ ズ 遺 伝 資 源 の 子 実 中 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 に は 10 倍 以 上 の 差 が 認 め ら れ 、非 常 に 変
異 に 富 ん で い る 。 ま た 、 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 と 成 熟 期 と の 間 に は 正 の 相 関 関 係 が 認 め ら
れ 、 早 生 品 種 群 よ り も 晩 生 品 種 群 で 高 イ ソ フ ラ ボ ン 品 種 が 多 く み ら れ る 9）。 イ ソ フ ラ
ボ ン 含 量 は 栽 培 場 所 、 栽 培 年 次 等 の 栽 培 環 境 に よ り 大 き く 影 響 を 受 け る こ と が 指 摘 さ
れ て い る 10)11）。 そ の 詳 細 な 要 因 は 解 明 さ れ て い な い が 、 登 熟 期 間 中 の 高 温 条 件 が イ
ソ フ ラ ボ ン 含 量 の 低 下 の 要 因 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 12）。こ れ ま で に イ ソ フ
ラ ボ ン 含 量 の 遺 伝 様 式 は 明 ら か に さ れ て い な い が 、 最 近 、 イ ソ フ
複
． ４ イ ソ フ ラ ボ ン 高 含 量 の 大 豆 育 成 品 種
国 内 の 大 豆 育 成 機 関 で は 、 高 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 化 を 目 的 と し た 育 種 が 行 わ れ 、 交 雑
育 種 か ら 、栽 培 適 地 の 普 及 品 種 よ り も イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 が 約 1.5 倍 高 い「 ふ く い ぶ き 」
（ 農 研 機 構 ・ 東 北 農 業 研 究 セ ン タ ー 、 2005 年 品 種 登 録 ） 、 「 ゆ き ぴ り か 」 （ 北 海 道 、
2006 年 出 願 公 表 ） が 育 成 さ れ て い る 。 西 日 本 で は 、 純 系 育 種 か ら 「 三 朝 神 倉 」 「 鳥 取
大 山 2001」 （ 鳥 取 県 、 2009 年 出 願 公 表 ） が 育 成 さ れ て い る 。 ま た 、 愛 媛 県 の 大 豆 奨 励
品 種 「
る
引 用 ・ 参 考 文 献 ＞
shimi Y. et al. Selective effects of genistein, a soybean isoflavone, on
B-lymphopoiesis and bone
140(4):1893-900 (1999)
otter, S. M. et al. Soy protein and isoflavones: their effects on blood
lipids and bone densit
68:1375-1379 (1998)
rjmandi, B. H. et al. Dietary Soybean Protein Prevents Bone Loss in an
Ovariectomized Rat Model of Osteoporosis. J. Nutr. 126:161-167 (1996)
uella, S. K. et al. Evaluation of Soy Phytoestrogens for the Treatment of
Hot Flashes in Breast Cancer Survivors: A North Central Canc
Group Trial. J. Clinical Oncology. 18(5):1068-1074 (2000)
kiyama, T. et al. Genistein, a specific inhibitor of t
protein kinases. J. Biol. Chem. 262:5592-5595 (1987)
oward, L. et al. Genistein, daidzein, and their beta-glycoside conjugates:
antitumor isoflavones in soybean foods from Am
Agric. Food Chem. 41 (11):1961– 1967 (1993)
erman, C. et al. Soy
125:757-770 (1995)
aim, M. et al. Antioxidative and antihemolytic activities of soybean
isoflavones. J. Agric. Food Chem. 24 (6):1174– 1177 (1976)
マニュアル参考様式 Ver.1
研 報 ． 104:83-149 (2005)
ldridge, A. C. and W. F. Kwolek. Soybean isoflavones: effect of t
environment and
10. E
he
variety on composition. J. Agric. Food Chem. 31：
11. W
ese
crop year, and location. J.
12. T
res during seed development. J. Agric. Food Chem.
13. P
tal isoflavone content
in soybean seeds. Crop Sci. 45:2454-5464 (2005)
３
394-396(1983)
ang, H. and P. A. Murphy. Isoflavone composition of American and Japan
soybeans in Iowa: effects of variety,
Agric.Food Chem. 42： 1674-1677(1994)
sukamoto, C., et al., Factors affecting isoflavone content in soybean
seeds: Changes in isoflavones, saponins, and composition of fatty acids
at different temperatu
43, 1184-1192 (1995)
rimomo, V. S.
et al
. Mapping QTL for individual and to
. 定 量 分 析 の 方 法 に つ い て
こ こ で は 、 大 豆 子 実 （ 全 粒 ） に 含 ま れ る 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン を 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ
フ ィ ー に よ り 定 量 す る 方 法 を 述 べ る 。 な お 、 分 析 対 象 と す る 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン は 、 大
豆 子 実 中 に は 極 く 僅 か し か 含 ま れ な い ア セ チ ル 化 配 糖 体 3 種 類 を 除 い た 9 種 類 と す る 。
pm、 1.5ml マ イ ク ロ チ ュ ー ブ が 使 用 可 能 な タ イ プ ）
4.
ー ブ ン ）
カ ラ ム （ YMC-Pack ODS-AM・ 粒 子 径 5μ m・ サ イ ズ 250x4.6mm 等 )
水 )
品 )
終 濃 度 が 10mg/l と な る よ う に 希 釈 す る 。標 準 原 液 は -20℃ 以 下 で 冷
凍 保 存 す る 。
３ ． ２
に 、 Tsukamoto
et al
.(1995)1)の 抽 出 法
を
３ ． １ 準 備 す る 器 具 等
1.粉 砕 機 （ メ ー カ ー 、 粉 砕 方 式 は 問 わ な い ）
2.遠 心 機 （ 12,000～ 15,000r
3.1.5ml マ イ ク ロ チ ュ ー ブ
高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 装 置 一 式（ 2 液 グ ラ ジ エ ン ト 可 能 な ポ ン プ 、イ ン ジ ェ ク
ク タ ー ま た は オ ー ト サ ン プ ラ 、 UV 検 出 器 ま た は PDA 検 出 器 、 カ ラ ム オ
5.ODS
[試 薬 ]
1.ア セ ト ニ ト リ ル (HPLC 用 )
2.蒸 留 水 (HPLC 用 ま た は 超 純
3.エ タ ノ ー ル (試 薬 特 級
4.酢 酸 (試 薬 特 級 品 )
5.イ ソ フ ラ ボ ン 各 種 標 品 （ 和 光 あ る い は フ ジ ッ コ ）
標 品 は 約 10mg を 精 秤 し 、 70%エ タ ノ ー ル （ 含 0.1%酢 酸 ） に 溶 解 し て 標 準 原 液 と
し 、使 用 時 に 最
分 析 用 試 料 の 抽 出 方 法
試 料 の 抽 出 法 は 多 検 体 が 取 り 扱 え る よ う
ス ケ ー ル ダ ウ ン し た も の に 改 変 し た 。
1.大 豆 粉 体 試 料 約 60mg を 精 秤 し 、 1.5ml マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 入 れ る 。
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テ ッ ク ス で 撹 拌 後 、遠 心 機 で
0 分 間 遠 心 後 の 上 澄 み を 使 用 す る 。必 要
に 応 じ て 抽 出 液 を フ ィ ル タ ー 濾 過 す る 。
３ ．
検 出 器 ： 日 立 L-2400 形 、 デ ー タ 収 集 ・ 解 析 ： EZChrom Elite for Hitachi、 で あ る 。
al
.(1991)2)の 方 法 に 準 拠 し た 分 析 条 件 の 場 合
純
水
も 可 ） を 用 い て 以 下 の よ う に 調 製 す る 。
ト ニ ト リ ル ： 酢 酸 (100： 0.1、 v/v)
（
媒 の 流 量 の 条 件
動 相 A、 移 動 相 B の 合 計 で 毎 分 1ml
ー ）
0 分 か ら 50 分 間 ：
グ ラ
55 分 か ら 70 分 間：
、B 液 15%の 状 態 で 保 持 す る（ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度
試 料 を 注 入 し 、 分 析 を 開 始 す る 。
。
②
を 回 帰 分 析 し て 作 成 す る 。 検 出 出 力 結 果 に は ピ ー ク 面 積 を 用 い る こ と が 多 い 。
2.70%エ タ ノ ー ル（ 含 0.1%酢 酸 ）を 0.6ml 加 え 、ボ ル
壁 面 の 水 滴 等 を 落 と し 、 25℃ で 48 時 間 静 置 す る 。
3.抽 出 終 了 後 は 、 分 析 時 ま で － 20℃ で 保 存 す る 。
4.HPLC 分 析 に は 、12,000～ 15,000rpm で 1
３ HPLC に よ る 分 析 方 法
使 用 し た HPLC 装 置 構 成 は 、ポ ン プ：日 立 L-2130 形（ 低 圧 グ ラ ジ エ ン ト ユ ニ ッ ト 、
デ ガ ッ サ 装 着 ）、オ ー ト サ ン プ ラ ： 日 立 L-2200 形 、カ ラ ム オ ー ブ ン ： L-2300 形 、UV
３ ． ３ ． １ Kudo
et
（ １ ） 移 動 相 の 調 製
移 動 相 A 及 び 移 動 相 B を ア セ ト ニ ト リ ル (HPLC 用 )、 蒸 留 水 （ HPLC 用 ） ま た は 超
、 酢 酸 （ HPLC 用 が 望 ま し い が 特 級 で
【 A 液 】 水 ： 酢 酸 (100： 0.1、 v/v)
【 B 液 】 ア セ
２ ） 分 析 条 件
① 検 出 器 、 恒 温 槽 、 溶
検 出 波 長 :260nm
カ ラ ム 温 度 :35℃
流 量 :移
② カ ラ ム
YMC-Pack ODS-AM・ 粒 子 径 5μ m・ サ イ ズ 250x4.6mm（ ワ イ エ ム シ
③ 移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 (グ ラ ジ エ ン ト )は 以 下 の よ う に 調 整 す る 。
初 期 状 態 ： A 液 85%、 B 液 15%の 状 態 で 保 持 す る （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 15%） 。
50 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 35%に な る よ う に 直 線 濃 度
ジ エ ン ト を 行 う （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 15→ 35%） 。
50 分 か ら 55 分 間：B 液 100%の 状 態 を 保 持 す る（ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 100%）。
A 液 85%
15%） 。
70 分 後 に 次 の
（ ３ ） 定 性 及 び 定 量
① 分 離 さ れ た 物 質 の 定 性 は イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 試 料 の 保 持 時 間 と の 比 較 に よ り 行 う
定 量 は 検 量 線 法 に よ り 行 う 。 検 量 線 は 標 準 試 料 の 濃 度 と 検 出 出 力 結 果 と の 関 係
３ ． ３ ． ２ 分 析 時 間 短 縮 の た め に 移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 を 変 え る 場 合
大 豆 の イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 に 関 す る 育 種 で は 、 多 数 の 個 体 や 系 統 を 分 析 し な け れ ば
な ら な い 。 従 っ て 、 短 期 間 で 効 率 よ く 選 抜 す る た め に は 、 １ 検 体 当 た り の 分 析 時 間
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を 短 縮 す る 必 要 が あ る 。 こ こ で は 、 「 ３ ． ３ ． １ （ ２ ） 分 析 条 件 ③ 」 の 溶 媒 の 混 合
析 時 間 を 短 縮 し た 。
と 同 じ 。
（
は 「 ３ ． ３ ． １ 」 に 従 う 。
0 分 か ら 17 分 間 ：
B 液 15%の 状 態 を 保 持 す る （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度
17 分 か ら 35 分 間：
度 グ ラ
39 分 か ら 48 分 間：
、B 液 15%の 状 態 で 保 持 す る（ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度
試 料 を 注 入 し 、 分 析 を 開 始 す る 。
（ ３ ）
３ ． ３ ． １ と 同 じ 。
に 、 長 さ 、 内 径 あ る い は 粒 子 径 の
し 、 分 析 条 件 を 検 討 し た 。
と 同 じ 。
（
媒 の 流 量 の 条 件
0℃ ）
動 相 A、 移 動 相 B の 合 計 で 毎 分 0.5ml
5μ m・ サ イ ズ 250x3mm（ ワ イ エ ム シ ー ）
ン タ ク ト ）
イ ズ 150x2mm（ 島 津 ）
③
以 下 の よ う に 調 整 す る 。
３ ． ２ 」 に 従 う 。
比 の み を 変 更 し て 分
（ １ ） 移 動 相 の 調 製
３ ． ３ ． １
２ ） 分 析 条 件
① 検 出 器 、 恒 温 槽 、 溶 媒 の 流 量 の 条 件
② カ ラ ム は 「 ３ ． ３ ． １ 」 と 同 じ 。
③ 移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 (グ ラ ジ エ ン ト )は 以 下 の よ う に 調 整 す る 。
初 期 状 態 ： A 液 85%、 B 液 15%の 状 態 で 保 持 す る （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 15%） 。
A 液 85%、
15%） 。
35 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 47%に な る よ う に 直 線 濃
ジ エ ン ト を 行 う （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 15→ 47%） 。
35 分 か ら 39 分 間：B 液 100%の 状 態 を 保 持 す る（ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 100%）。
A 液 85%
15%） 。
48 分 後 に 次 の
定 性 及 び 定 量
３ ． ３ ． ３ 分 析 時 間 短 縮 お よ び 溶 媒 使 用 量 削 減 の た め に カ ラ ム サ イ ズ を 変 え た 場 合
こ こ で は 、 既 存 の 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 装 置
異 な る カ ラ ム を 装 着
（ １ ） 移 動 相 の 調 製
３ ． ３ ． １
２ ） 分 析 条 件
① 検 出 器 、 恒 温 槽 、 溶
検 出 波 長 :260nm
カ ラ ム 温 度 :カ ラ ム １ （ 35℃ ） 、 カ ラ ム ２ と ３ （ 4
流 量 :移
② カ ラ ム
１ ： YMC-Pack ODS-AM・ 粒 子 径
［ カ ラ ム 内 径 ・ 小 ］
２ ： Unison UK-C18・ 粒 子 径 3μ m・ サ イ ズ 150x3mm（ イ
［ カ ラ ム 長 さ ・ 短 、 内 径 ・ 小 、 粒 子 径 ・ 小 ］
３ ： Shim-pack VP-ODS・ 粒 子 径 5μ m・ サ
［ カ ラ ム 長 さ ・ 短 、 内 径 ・ 小 ］
移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 (グ ラ ジ エ ン ト )は
カ ラ ム １ ： 「 ３ ．
カ ラ ム ２ と ３ ：
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。
0 分 か ら 9 分 間
、 B 液 13%の 状 態 を 保 持 す る （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度
9 分 か ら 19 分 間 ：
グ ラ
19 分 か ら 20 分 間
グ
20 分 か ら 30 分 間：
、B 液 13%の 状 態 で 保 持 す る（ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度
試 料 を 注 入 し 、 分 析 を 開 始 す る 。
３ ． ３ ． １ と 同 じ 。
初 期 状 態 ： A 液 87%、 B 液 13%の 状 態 で 保 持 す る （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 13%）
： A 液 87%
13%） 。
19 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 48%に な る よ う に 直 線 濃 度
ジ エ ン ト を 行 う （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 13→ 48%） 。
： 20 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 100%に な る よ う に 直 線 濃 度
ラ ジ エ ン ト を 行 う （ ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 48→ 100%） 。
A 液 87%
13%） 。
30 分 後 に 次 の
（ ３ ） 定 性 及 び 定 量
４ ． 分 析 例
３ ． ３ で 述 べ た 条 件 で 分 析 し た 9 種 類 の イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム を 以
４
１ 「 Kudo
et al
.(1991)2)の 方 法 に 準 拠 し た 分 析 条 件 の 場 合 」 の 分 析 例
下 に 示 す 。
．
図 ４ ． １ イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
マニュアル参考様式 Ver.1
４
．
２ 「 移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 を 変 え て 分 析 時 間 を 短 縮 す る 場 合 」 の 分 析 例
図 ４ ． ２ イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
マニュアル参考様式 Ver.1
４
．
３ 「 カ ラ ム サ イ ズ を 変 え た 場 合 」 の 分 析 例
図 ４ ． ３ － １ カ ラ ム １ を 使 用 し た 場 合 の イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
カ ラ ム １ ：
子 径 5μ m・ サ イ ズ 250x3mm（ ワ イ エ ム シ ー ）
［ カ ラ ム 内 径 ・ 小 ］
6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
YMC-Pack ODS-AM・ 粒
マニュアル参考様式 Ver.1
図 ４ ． ３ － ２ カ ラ ム ２ を 使 用 し た 場 合 の イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
カ ラ ム ２ ： Unison UK-C18・ 粒 子 径 3μ m・ サ イ ズ 150x3mm（ イ ン タ ク ト ）
［ カ ラ ム 長 さ ・ 短 、 内 径 ・ 小 、 粒 子 径 ・ 小 ］
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図 ４ ． ３ － ３ カ ラ ム ３ を 使 用 し た 場 合 の イ ソ フ ラ ボ ン 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
カ ラ ム ３ ： Shim-pack VP-ODS・ 粒 子 径 5μ m・ サ イ ズ 150x2mm（ 島 津 ）
［ カ ラ ム 長 さ ・ 短 、 内 径 ・ 小 ］
他 の カ ラ ム と 異 な り 、
daidzein の 溶 出 が 6”-O-malonylgenistin よ り 先 に な っ た 。
５ ． 食 品 の 分 析 結 果 例
大 豆 種 子 な ら び に 大 豆 加 工 食 品 に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の 分 析 結 果 を 以 下 に 示 す 。
な お 、分 析 試 料 に は 、大 豆 種 子 か ら は「 ３ ．３ ．１ 」の 通 り に 、大 豆 加 工 食 品（ 豆 腐 、
納 豆 、 味 噌 ） か ら は 、 約 1g の 食 品 に 5ml の 70%エ タ ノ ー ル （ 含 0.1%酢 酸 ） を 加 え て 、
ホ モ ジ ナ イ ズ 後 、 室 温 で 24 時 間 振 と う し 、 12,000rpm、 15 分 間 遠 心 し 、 上 澄 み を フ ィ
ル タ ー 濾 過 し た 抽 出 液 を 用 い た 。 分 析 条 件 は 、 い ず れ も 「 ３ ． ３ ． ２ 」 の 方 法 を 用 い
た 。
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５ ． １ 大 豆 種 子
図 ５ ． １ － １ 大 豆 全 粒 種 子 中 に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin,
6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
供 試 品 種 は イ ソ フ ラ ボ ン 高 含 量 の 「 ふ く い ぶ き 」 （ 2006 年 近 中 四 農 研 セ ン タ ー 産 ） 。
全 粒 種 子 中 で は マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 が 多 く 含 ま れ る 。 胚 軸 に の み 含 ま れ る グ リ シ テ イ ン
を ア グ リ コ ン と す る イ ソ フ ラ ボ ン の 含 量 は 少 な い 。
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図 ５ ． １ － ２ 異 な る 播 種 期 で 栽 培 さ れ た ダ イ ズ 品 種 ・ 系 統 の 全 粒 種 子 中 イ ソ フ ラ ボ
ン 含 量
2003 年 近 中 四 農 研 セ ン タ ー 産 （ 香 川 県 善 通 寺 市 ） 、 18 点 、 ２ 播 種 期
図 中 の 積 み 重 ね 棒 お よ び バ ー は 、 各 イ ソ フ ラ ボ ン 型 の 平 均 値 お よ び 総 含 量 の 標 準 偏 差
を 示 す 。
標 準 播 種 栽 培 さ れ た ダ イ ズ 品 種・系 統 の 総 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 は 116～ 579mg/100g・乾 物
重 の 範 囲 に 分 布 し 、 平 均 値 は 297mg/100g・ 乾 物 重 で あ っ た 。 最 高 は タ マ ホ マ レ 、 最 低
は 善 系 6 号 で あ っ た 。
供 試 し た 全 品 種 ・ 系 統 に お い て 、 晩 播 栽 培 に よ り 総 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 が 高 ま る 傾 向 が
認 め ら れ た 。
総 イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 に 対 す る ダ イ ゼ イ ン 型 （ あ る い は ゲ ニ ス テ イ ン 型 ） イ ソ フ ラ ボ ン
の 比 率 は 品 種 ・ 系 統 に よ り 異 な っ た 。
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５ ． ２ 豆 腐 （ 絹 ）
図 ５ ． ２
豆 腐 （ 絹 ） に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 4: 6”-O-malonyldaidzin, 5: 6”-O-malonylglycitin, 6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 9: genistein
供 試 し た 豆 腐 （ 絹 ） は 市 販 品 。
豆 腐 で は マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 が 他 の 大 豆 加 工 製 品 に 比 べ 多 く 含 ま れ て い た 。
glycitein は
検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。
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５ ． ３ 納 豆
図 ５ ． ３ 納 豆 に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム
1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 6: 6”-O-malonylgenistin, 7: daidzein, 9: genistein
供 試 し た 納 豆 （ 中 粒 ） は 市 販 品 。
今 回 分 析 し た 納 豆 で は 、 全 粒 種 子 と 比 較 し て マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 含 量 が 顕 著 に 減 少 し て
い た 。 な お 、 納 豆 に 特 有 の イ ソ フ ラ ボ ン と し て 、 サ ク シ ニ ル 化 配 糖 体 が 報 告 さ れ て い
る
3)が 、 標 準 品 を 入 手 で き な か っ た た め 、 本 分 析 で は 確 認 で き な か っ た 。
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５ ． ４ 味 噌
図 ５ ． ４ － １
白 味 噌 に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム 1: daidzin, 3: genistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein供 試 し た 味 噌 は 、 四 国
6 号 （ 2007 年 近 中 四 農 研 セ ン タ ー 産 ） を 原 料 に 、 中 央 味 噌 研 究
所 に お い て
2008 年 に 試 作 （ 国 産 大 豆 協 議 会 品 質 評 価 分 科 会 ）。 冷 蔵 保 存 。
マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。 味 噌 醸 造 過 程 で 分 解 さ れ た た め と 考 え ら
れ る 。 他 方 、 ア グ リ コ ン の 量 が 顕 著 に 増 加 し た 。
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図 ５ ． ４ － ２
赤 味 噌 に 含 ま れ る イ ソ フ ラ ボ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム1: daidzin, 2: glycitin, 3: genistin, 7: daidzein, 8: glycitein, 9: genistein
供 試 し た 味 噌 は 、 四 国
6 号 （ 2007 年 近 中 四 農 研 セ ン タ ー 産 ） を 原 料 に 、 中 央 味 噌 研 究
所 に お い て
2008 年 に 試 作 （ 国 産 大 豆 協 議 会 品 質 評 価 分 科 会 ）。 冷 蔵 保 存 。
白 味 噌 と 同 様 に 、 マ ロ ニ ル 化 配 糖 体 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。 他 方 、 ア グ リ コ ン の 量
が 顕 著 に 増 加 し た 。
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表 ５ 大 豆 食 品 中 の イ ソ フ ラ ボ ン 含 量 （ 図 ５ ． １ ～ 図 ５ ． ４ － ２ ）
大豆全粒種子
豆腐（絹）
納豆
白味噌
赤味噌
daidzin
32.8
22.3
6.3
1.6
7.2
glycitin
9.1
2.1
0.9
nd
0.6
genistin
47.2
50.5
10.0
6.3
17.2
6"-O-malonyldaidzin
155.6
nd
9.3
nd
nd
6"-O-malonylglycitin
26.8
nd
0.9
nd
nd
6"-O-malonylgenistin
216.7
1.6
16.0
nd
nd
daidzein
6.0
0.5
0.3
4.2
5.0
glycitein
0.8
nd
nd
0.4
1.4
genistein
1.0
2.3
0.4
10.8
8.8
合計
496.1
79.3
44.1
23.3
40.2
注1)各クロマトグラムのピーク面積から算出した。
注2)イソフラボン含量は生重100g当たりの量で示した。
注3)「nd」は、検出限界以下を意味する。
イソフラボン含量（mg/100g）
６ ． 分 析 上 の 留 意 、 注 意 点
○ カ ラ ム 内 径 を 小 さ く し た と き 、 抽 出 液 の 溶 出 力 が 強 い と ピ ー ク の リ ー デ ィ ン グ が 起
こ る 場 合 が あ る 。 抽 出 液 を 移 動 相 と 同 じ 溶 媒 に 変 え る か 、 希 釈 し て 溶 出 力 を 弱 め る と
リ ー デ ィ ン グ 現 象 を 回 避 で き る 。
○ ア セ ト ニ ト リ ル 、 蒸 留 水 は HPLC グ レ ー ド で あ れ ば 、 製 造 メ ー カ ー 間 の 差 は な い 。
７ ． そ の 他
本 報 で は 、 筆 者 ら が 行 っ て い る イ ソ フ ラ ボ ン 分 析 方 法 を 述 べ た が 、「 健 康 補 助 食 品
規 格 基 準 集（ そ の 2）」（ 財 団 法 人 日 本 健 康・栄 養 食 品 協 会 ）に 大 豆 イ ソ フ ラ ボ ン の 試
験 方 法 が 示 さ れ て い る の で 、 そ ち ら も 参 照 し て い た だ き た い 。
８ ． 定 量 法 に 関 す る 引 用 ・ 参 考 文 献
1. Tsukamoto, C.
et al
. Factors affecting isoflavone content in soybean seeds:
Changes in isoflavones, saponins, and composition of fatty acids at
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