ドジョウ胚の発生に伴うヘパリン結合性成長因子の検索
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(2) 目. 次. 1序論 H材料と方法 1 材料と飼育 （1） ドジョウの入手と飼育 （2） キンギョの入手と飼育 2 実験器具の洗浄及び滅菌操作 3 培養液・生理的塩類溶液・添加物の調製. （1） 199培養液. （2） CMF−PBS （3） ドジョウ用リンゲル氏液. （4） 0．05％トリプシンーO．04％EDTA液 （5） トリプシンインヒビター液 （6） コート用コラーゲン液. 4 キンギョFBDF細胞培養方法. （1） FBDF細胞培養法 （2） FBDF細胞数計測法 5 ドジョウ胚抽出タンパク質の入手方法. （1） 人工受精 （2） タンパク質抽出.
(3) 6 ドジョウ胚抽出タンパク質分画法. （1） PD−10カラムによる分画 （2） ヘパリンアフィニディーカラムによる分画. 7 NBCS濃度のキンギョFBDF細胞に対する細胞成長効果の測定法 8 ドジョウ胚抽出タンパク質のキンギョFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 の測定法. （1） PD−10カラム画分のFBDF細胞にに対する細胞成長因子活性. （2） NaCl溶液中の塩濃度のFBDF細胞に対する細胞成長効果 （3） ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M、1．OM、2．OM NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 9 ドジョウ胚抽出タンパク質のキンギョFBDF細胞への細胞成長因子活性濃度 の測定法. （1） タンパク質の定量. （2） 1／2最大活性濃度. 皿実験結果 1. NBCS濃度のキンギョFBDF細胞に対する細胞成長効果. 2. ドジョウ胚PD−10カラム画分のキンギョFBDF細胞に対する細胞成長 因子活性. 3. 発生に伴うドジョウ胚のヘパリン結合性タンパク質画竜（0．5M、1．OM、. 2．OMNaCl溶出）の変化 4. NaCl溶液中の塩濃度のFBDF細胞に対する細胞成長効果. 5. ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク盆画分（0．5MNaCi溶出）の キンギョFBDF細胞に対する細胞成長因子活性.
(4) 6 ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク質画分（1．OMNaCl溶出）の キンギョFBDF細胞に対する細胞成長因子活性. 7 ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク質画分（2．OMNaCl溶出）の キンギョFBDF細胞に対する細胞成長因子活性. lV考察 1 ドジョウ胚PD−10カラム画分とヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M、. 1．OM、2．OMNaCl溶出）の発生に伴うタンパク質量の変化 2 ドジョウ胚PD−10カラム画分とヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M、. 1．OM、2．OMNaCl溶出）の発生に伴うキンギョFBDF細胞に対す る細胞成長因子活性の変化. V謝辞 Vl文献 v旺図版.
(5) 1序論 単細胞の卵が多細胞の個体へと発達していく発生過程には、細胞分化と形態形成の動 的変動を伴い、その中心的役割を果たすものとして、シュベーマンは形成体を提唱し、. その後、両生類の初期胚における中胚葉誘導反応に関する数多くの研究D2｝がなされて いる。. 中胚葉誘導作用を示す例として、ヘパリン結合性成長因子ファミリーの小グループは、 中胚葉へ誘導し、胚の腹部中胚葉誘導は、ヘパリン結合性成長因子によって仲介され3｝、 A’enoρ〃sの発生初期stage 8∼9（胞胚期）、stage 10∼12（原腸期）4）に心筋アク. チンの発現にヘパリン結合性成長因子ファミリーの1つ、basicFGF（以後、 FGF−. 2とする）が誘導効果を示し、FGF−2が卵巣、卵、胞胚期に、 FGF−2のmRN Aが卵、4細胞期、sta3e 18（神経管形成期）と胚の初期発生段階を通して存在してい ることs）e）7） 8）が報告されている。また、中胚葉誘導作用を示す成長因子にTGF一β. スーパーファミリー9｝1ωがあり、その一員であるアクチビンが夫受精卵中に母性由来タ ンパク質：として蓄えられ11｝12）13）、アクチビン遺伝子がA’enOPUSの発生過程（胞胚期. と原腸期）で転写されること14）やTGF一βスーパーファミリーの：・一・員であるインヒビ. ンと類似塩基構造を持つVglのmRNAがXe〃oρusの胞胚期に中胚葉誘導を行う植物 極に局在する15）ことだけでなく、これら2つの成長因子ファミリーが、中胚葉誘導に相 乗的に協力し作用しているe）1。）とも報告されている。. ホ乳類や両生類の初期発生段階における中胚葉誘導とその成長因子の機能は徐々に解. 明されつつあるが、魚類については、ドジョウ胚の4∼6体節期にキンギョFin Blastema Derived Fibroblast細胞（以後、 FBDF細胞とする）の細胞成長因子活性を 示すヘパリン結合性タンパク質とacidicFGF（以後、 FGF−1とする）が存在し1 7）、. メダカにFGF受容体（FGFR）があり18）、ゼブラフィッシュの胚発生過程とその遺. 1一.
(6) 伝子群19）の役割が報告されている。. 本研究では、ドジョウ胚の発生段階に伴いヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M、. 1．OM、2．OM NaCl溶出）が増減し、FGF−1が胞胚期、原腸期及び4∼8 体節期に、FGF−2が4∼8体節期に存在（岡山大学 妹尾昌治博士の解析による） することと各発生段階におけるヘパリン結合性タンパク質がキンギョFBDF細胞に対 する細胞成長因子活性があることを報告する。. 一2一.
(7) H材料と方法 ■材料と飼育20）2n22｝ （1） ドジョウ（Rli5gur nus ang〃iliicaudatus）の入手と飼育23）. 人工受精に用いたドジョウは、11代以上わたって近親交配した日本産種の特徴を示 すドジョウ（鳥取県東伯町加登立川魚店より購入）であり、半年以上本研究室で飼育し、. 健康状態の良好な産卵経験のある体長20cm前後の雌と体長15cm前後の雄との問 で人工受精を行った。. 飼育は、循環ろ過装置をつけた水槽に砂を敷き、脱塩試した水道水を入れ、水温：を常. に22℃前後に保つ拒。餌は、朝タ2回1時問で食べ残しがないように市販の鯉用飼料 を与え、受精1ヶ月前からは動物性タンパク質としてアカムシを雌に適宜与えta。. （2） キンギョ（Carassius auratus）の入手と飼育24）. キンギョは、本研究室において1年以上飼育している体長5cm前後の個体を用いた， 飼育は、循環ろ過装置をつけた水槽に脱塩証した水道水を入れ、水温を常に22℃前後 に保った。餌は、朝タ2回1時間で食べ残しがないように市販のキンギョ用の餌を与え た。. 一3一.
(8) 2. 実験器具の洗浄及び滅菌操作25）2e）2了）. 実験に使用した器具は、洗剤（切刃7−X：1一アイ化成k．k．）を溶かした洗浄液に一晩浸した. 後、ガラス壁の汚れを除去するため、超音波洗浄機（CA一・10：海上電気k．k．）で30分洗浄 した。. その後、流水で洗剤を洗い流し、再び超音波洗浄機で30分間すすぎ、流水に数時間 さらし、蒸留水ですすいでから乾燥させた。 乾燥は、エレクトリックドライングオーブン（TS−42S：TOYO KAGAKU SANGYO CO．LTD．）に. より、60℃の設定温度で完全乾燥させた。. 滅菌操作は、すべてクリーンベンチ内で行い、滅菌処理は120℃20分問の高圧蒸 気滅菌（TOMY AUTOCLAVE SD−30ND：TOMY SEIKO CO．LTD．）または、180℃60分問の乾熱 滅菌（LAB OVEN：MITAMURA RIKEN KOGYO INC）で行った。. 両滅菌法が使えない培養液や試薬の滅菌は、シリンジフィルター（￠3昭臥13田臥25mm −0．2μm：CORNING）や、一メンブランフィルター（￠47mm−O．22 ju m：NIHON MILLIPORE KOGYO. k．k．）を用いてろ過滅菌を行った。. 25） 28）. 3 培養液一生理的塩類溶液一添加物の調製 （1）199培養液 組織培養用199培地粉末（日水製薬）4．9g、HEPES緩衝液（和光純薬） 1．19gを高純度水に溶かし、硫酸ストレプトマイシン（明治製菓）50mg、. 硫酸カナマイシン（明治製菓）30mgを加え、 pH7．3に調製し500mlとしte。 上記調製後、ただちにろ過滅菌をし、使用にあteってはこの培地に無菌処理した New Born Calf Serum（JRH BlOSClENCES．以後、 NBCSとする）を必要量加えた。 一4 一一.
(9) 通常の培養では、NBCSを10％容量加え199＋10％NBCS培養液として用 いた。アッセイ用の培養では、NBCSr9 1％容量加え199＋1％NBCS培養液と して用いた。. （2） CMF 一一PBS. PBS（Phosphate Buffered Saline）から、Ca2㌔Mg2＋を除いたもので、 NaC1. 8． Og． KCI O． 2g． NaHPO4．12H20 2． 9g． KH2P 04 O・ 2g を高純度水に溶かし11とした。滅菌を必要とする場合には、高圧蒸気滅菌を行っ拒。. （3）ドジョウ用リンゲル氏液23）. NaC17．5g、KCl O．2g、CaC120．4gを高純度水に溶かし11 として用いだ。. （4）0．05％トリプシンーO．04％EDTA液 トリプシン1：250（DIFCO）0．5gをCMF−PBS中で、4℃で半日かく祥 溶解し11として、ろ過滅菌した。. EDTA・2Na（和光純薬）2gを高純度水に溶かし、pH7．4に調製し100ml として高圧蒸気滅菌を行っte。. 0．05％トリプシン液と2％EDTA液を49：1の割合で混合し、0．05％ トリプシンー0．04％EDTA液とした。. （5）トリプシンインヒビター液. 大豆製トリプシンインヒビター（和光純薬）をCMF−PBSlm1中に10000 単位含むように調製し、必要時に使用し彪。. 一5一.
(10) （6）コート用コラーゲン液. HClでpH3．0に調製した高純度水95mlを高圧蒸気滅菌し、無菌的にコラー ゲン（Callmatrix Type l−A：新田ゼラチンk．k．）5mlを加えてコラーゲン液とし彪。. コラーゲンコートシャーレは、麺菌条件でシャーレez 1mlのコラーゲン液を入れ、. 37℃で2時間以上インキュベートした後コラーゲン液を吸引除去し、CMF−PBS で洗浄し再び吸引除去し乾燥させtaものである。. 一6一.
(11) 4. キンギョFBDF細胞培養方法. （1） FBDF細胞培養法17）29）30｝ 31）. ①準備する物. カッターナイフ ピンセット 分離針 ビーカー さらし粉溶液（1％） 70％. エタノール 麻酔液（4アミノ安息香酸エチルエタノール飽和溶液）CMF−PBS コラーゲンコートしたプラスチックシャーレ（￠35mm：CORN l NG）その他、細胞培養に. 必要な設備・器具及び培養液類. ②細胞培養前処置 細胞培養5日ほど前にキンギョに麻酔を施し、エタノールで消毒し彪カッターナイ. フで、尾鰭の中程をまっすぐに押し切るように切断した。以後5日間は、22℃の水 温で飼育しte。. ③初代細胞培養. 切断後5日目の再生芽が出tzキンギョの尾鰭から前記と同じ方法で再生芽だけを切. 断し冷やしたCMF−PBS中に入れ、以後は無菌操作で行っta。. 再生芽を1％さらし粉溶液に約50秒つけ、滅菌したCMF−PBSで洗浄した。. 次に70％エタノールに1鞭つけ、CMF−PBSでの洗浄を2回繰り返しta後、コ ラーゲンコートした滅菌シャーレに分離針で細分しながら植え込んだ。約2分間後、. 再生芽がシャーレの底に張り付いteのを確認して、199＋10％NBCS培養液 lmiを静かに加え、上蓋と上蓋の問をテーピングした。 これを、29℃に調節したインキュベータで培養し、培養液は3日毎に交換した。. 一7一.
(12) ④細胞継代培養. 初代培養によって、細胞がシャーレの底の1／2以上に面積を占めると継代培養し た。継代2代目からは細胞が底一杯に広がりぎっしりつまった密度依存性接触阻止を 起こした状態で次の継代を行っte。. 継代は、古い培養液を吸引除去した後、0．05％トリブシンー0．04％. EDTA液を2m1／25cm2角フラスコを加え、29℃のインキュベーターで5分 問保温した。インキュベーター付き倒立位相差顕微鏡で観察し、細胞が丸くなり容易 に底から剥離することを確認してから数回ピベッティングして細胞をばらばらにし売。. この細胞浮遊液に4倍量の培養液：を加え、3000gで3分問遠心後上澄み液：を吸 引除去し残った細胞に培養液を加え、細胞数が∼4×10 4ce1 ls／m 1になるように. 調製した細胞浮遊液を角フラスコに5ml入れ、培養を29℃のインキュベーターで 再開した。以後、この細胞をFBDF細胞と呼ぶことにする。. （2） FBDF細胞数計測法1T） 25｝ 2。） 29｝. FBDF細胞の細胞数の計測は、コールターカウンター（DN−2：COULTER ELECTRONICS lNC．）を用いて行った。設定は、 APERTURE CURRENT：1、THRESHOLD CONTROLS：22とした。. 培養液を吸引除去しte細胞に、0．05％トリプシンー0．04％EDTA液を. 2ml／25cm2角フラスコまtaは500μ1／3．6cm2WELLを加え、インキ ュベーター付き倒立位相差顕微鏡で観察し、細胞が丸くなり容易に底から剥離すること を確認してから数回ピベッティングして細胞をばらばらにした。. 次に、一定量を0．8％NaCl＋2mMNaN3中に希釈して10mlとしてコー ルターカウンターで計測した。. 一8一.
(13) 5. ドジョウ胚抽出タンパク質の入手方法. （1）人工受精23）. ①準備する物. 注射器 解剖はさみ プレパラート メス ピンセット ビーカー ピペット スリガラス 乳鉢 乳棒 麻酔液 ゴナトロビン（帝国臓器k．k．）. ②採卵前処置. 採卵10時問前に雌ドジョウに麻酔を施し、腹腔にゴナトロビンを注射した。. ③精液の採集. 雌ドジョウ1個体に対して、雄ドジョウ2個体の割合で精液を採集しte。受精10 時間前に麻酔を施し腹腔にゴナトロピンを注射した雄ドジョウを受精直前に腹開きに して一対の臼い精巣を注意深く取り出し、すぐに、冷やしておいたリンゲル氏液を少. 量入れた乳鉢に精巣を入れすりつぶし、雌1個体に対して15mlの希釈精液になる ようにリンゲル氏液を加え調製しte。使用するまでは、冷蔵庫で保存した。. ④受精. ゴナトロピン注射後10時間を過ぎだら、雌の腹部を生殖口に向かって軽くしごき あめ色半透明の成熟卵が生殖口から出るようであれば、放卵と同時に人工受精を行っ た。. 雌に麻酔を施し、ガーゼにくるみ腹部を軽くしごいて卵を絞り出すと同時に卵に希 釈調製した精液をピペットでかei te。生殖口から出てくる卵を精液で洗い流すように. 行い、その下には底にスリガラスを敷き2∼3cmの深さになるように水を張っ拒 バットを準備し拒。. 一9一.
(14) 塊になって落下した卵は、すぐにピペットでふきちらし卵と卵の重なりがないよう にした。精液を含むバットの水は、腐りやすいので新鮮な水と適宜取り替えte。まte、 バットの水に十分な空気を送りながら胚の発生段階を待つ拒。. ⑤ドジョウ胚入手. 人工受精後室温25℃の条件で、受精直後の受精卵、5時間前後経過した胞胚期の. 胚、10時間前後経過した原腸期の胚、15時間前後経過した4∼8体節期の胚、 18時間前後経過した12∼16体節期の胚をバットから回収した。各々の時期まで 発生の進んだ胚：を目の細かい網に受け回収し、CMF−PBSでよく洗った。以後、 この胚をドジョウ胚として実験に用いた。. （2）タンパク質抽出32｝. 各発生段階のドジョウ胚に胚の質量と同量のCMF−PBSを加え、ホモゲナイズし てホモゲナイトを得た。 次にこのホモゲナイト：を超遠心分離機（55P−72：日立工機k．k．）により、105Gで60. 分問遠心し、その上澄み液を分離しドジョウ胚抽出液とした。. 抽出液や以後の分画液は、すぐに利用する場合は氷中で保存し、その他の場合は全て. 一80℃で凍結保存し、使用時にすばやく融解して用いた。. 6. ドジョウ胚抽出タンパク質分画法. （1） PD−10カラムによる分画33） PD−10カラム（Phamacia）は、 Sephadex G−25を充墳したカラムで短時間に試料の 脱塩とバッファー交換が自然落下のもとでできる。. まず、CMF 一一 PBS25m1で平衡化し、次に試料を2．5m1加え、ゲルベット 一10一.
(15) まで吸わせた後、CMF−PBS3．5mlでゲルろ過した。この操作で、分子量 500Da以下の低分子物資の除去とカラム上部フィルターでの残存物の除去を行った。. （2） ヘパリンアフィニティーカラムによる分画34） 35） 36｝ 3T｝. Hitrap HepariR lml（Phamacia）は、 Heparin Sepharoseが1ml充墳されteアフィニ. ティークロマトグラフフィーの行えるカラムである。. 以下のシステムを用い、利用した溶液は全てシリンジフィルターで脱気しtaものを利 用しだ。. ＜＜Pharmacia FPLC System＞＞ ポンプ バルブ. ：P−500 ：V−7. UVモニター：UV−1 レコーダー ：R−02（理化電機工業k．k．）. カラムの10倍容量のCMF−PBSをカラムに流し平衡化した後、PD−10カラ ムにかけたドジョウ胚抽出液（Hitrap Heparin lmiの結合容量以下の液量）をシリンジで. 添加した。次に、CMF−PBSを120ml／hの流速で溶出されてくる画分がなく なるまでカラムに吸着されない物質を洗浄した。. 次に、0．5MNaCl−10mMTris（pH7．3）、1．OMNaCl− 10mM Tris （pH7．3）． 2． OM NaC1−10mM Tris （pH7．3） の3種類の異なる塩濃度の溶出液を用いて18皿1／hの流速で親和性のある画分を溶 出した。. 一11一.
(16) 7. NBCS濃度のFBDF細胞に対する. 細胞成長効果の測定法. 培養容器は、12Wellのマルチプレート（住友ベークラ朴）を用いた。細胞継代と同O. 要領で細胞浮遊液を作り、細胞数が∼4×10 4cells／mlなるように199＋10％. NBCSで調製し、0．5ml量を植え込み、29℃でインキュベートした。. 24時間後、199＋1％NBCSに交換し、更lt 24時間後199＋1％、2％、 5％のNBCSに交換し、4日後の細胞数で判定しte。. 細胞数の計測はFBDF細胞数計測法に従い実施し、各IVBCS濃度につき3回の繰 り返し実験の測定値のt検定を行い、NBCS濃度の細胞成長活性を判定した38）。. 8. ドジョウ胚抽出タンパク質のキンギョ. FBDF細胞成長因子活性の測定法 培養容器は、12WelIのマルチプレート（住友ベークラ・fF）：を用いた。細胞継代と同じ. 要領で細胞浮遊液：を作り、細胞数が∼4×10 4cells／m lなるように199＋10％. NBCSで調製し、0．5ml量を植え込み、29℃でインキュベートした。. 24時間後、199＋1％NBCSに交換し、更に24時間後199＋1％N’BCS に試料を添加し拒培養液に交換し、4日後の細胞数で判定した。 試料は、ドジョウ胚抽出画分をシリンジフィルターでろ過滅菌したものを培養液の. 1／10量を加えたものである。. 細胞数の計測はFBDF細胞数計測法に従い実施し、1つの試料につき3We11の 繰り返し実験の測定値のt検定を行い、細胞成長因子活性を判定した。. 12 一.
(17) （1）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 PD−10カラムで溶出しta肩甲試料について細胞成長因子活性を調べた。試料の. コントロールにはCMF−PBSを用いteo. （2）NaCl溶液中の塩濃度のFBDF細胞に対する細胞成長活性効果 ヘパリンカラムで溶出しta画分試料中のNaCl溶液中の塩濃度が、細胞成長活性に 影響を与えているか否かを調べた。ヘパリンカラムで溶出した画分と同U塩濃度の. NaCl溶液を培養液の1／10量加えte。. （3）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M、1．OM、2．OMNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性. PD−10カラム分画法で溶出した試料をHitrap Heparin lmlカラムで0．5M. NaCl、1．OMNaCl、2．OMNaClで溶出し、その西分について細胞成 長因子活性を調べ彪。それぞれの試料のコントロールにはPBSと（2）を用いた。. 9 ドジョウ胚抽出タンパク質のキンギョ FBDF細胞への成長因子活性濃度の iHij定法 （1）タンパク質の定量39｝ 40）. Lowryらによる改良法により行っta。2％Na2CO．一〇．1MNaOH：0．5％. CuSO4・5H20：1％酒石酸ナトリウムカリウム＝100：1：1の混合液に CMF−PBSで一定の割合に薄めtaO．2ml容量の試料を混合する。室温で10分 以上インキュベートした後、フェノール試薬を0．1ml加え、素早く混合する。さら に30分以上経過した後、2波長自記分光度計（UV−300：島津製作所）を用いて750皿m −13一.
(18) の吸光度によるタンパク質定量を行っta。標準試料としては、ボバインアルブミン（半井 化学薬品k．k．）を用いk。. （2）1／2最大活性濃度 ドジョウ胚抽出タンパク質の通常の細胞成長因子活性測定の方法により、試料の濃度. を変えて細胞成長因子活性を調べ、濃度活性曲線を作成し、1／2最大活性濃度を求め た。. すなわち、1unitとは、199＋1％NBCS培養液0．5ml中に含まれるFB DF細胞（∼2×104 cells）に対する1／2最大細胞成長因子活性を誘導するタンパ ク質量と定義した。. 14 一.
(19) 皿 実験結果. ■NBCS濃度のキンギョFBDF細胞に 対する細胞成長効果. FBDF細胞に対するNBCSの濃度の影響は、1％・2％・5％HBCS濃度の培 養液に交換した時の細胞を1とすると、4日後に1％NBCSは1．13倍、2％は 1．44倍（t ＝12．438、df＝4、P〈0．Ol）、5％は2．07倍となり、1％NBCSのと きのみ明らかにFBDF細胞に対する有意な細胞成長効果が見られなかった（図1）。. 以上のことから、199＋1％NBCSを細胞成長因子活性を測定する基本培養液と した。. 2 ドジョウ胚PD一■0カラム面分のキン ギョFBD細胞に対する細胞成長因子活 ・t生. ドジョウ胚の受精直後の卵（1g）からの回収タンパク質量は、PD−10カラム. 画分で6．3×104μgでり、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性を求めると、 1／2最大濃度活性は9μg／wELL、全活性は7．oxlo 3uni 一bs、比活性は 。．11 unit／μgであった。胞胚期の胚ではこれらの値は、5．5xlo4μg、. 17μg／wELL、3．2xlo 3uni ts、5．9xlo”2unit／μg、原腸期の胚で. は、5．8×104μg、21μg／WELL、2．8×10 3uni ts、4．8×10−2. unit／μg、4∼8体節期の胚では、6．8xlo4μg、13μg／wELL、5．2 xlo 3uni ts、7．7xlo“2unit／μg、12∼16体節期の胚では、5．3xlo4. 15 一.
(20) μg、18μg／wELL、2．9xlo 3uni ts、5．6xlo ”2unit／μgであった （図2、3、4，、5、6、表1）。. また、試料のタンパク質が高濃度になるにつれて、FBDF細胞の形態的変化がみら れte。この現象は、受精直後の卵、胞胚期、4∼8体節期、12∼16体節期に見られ、. 特ez 4∼8体節期で顕著で125μg／WELLで細胞の伸長・肥大が起こり、250. μg／WELLになると丸くなり始め彪細胞が出現し、500μg／WELLでは多数 の細胞が丸形や楕円形になり、1000μg／WELLLでは細胞の核の残骸だけが確 認できるまでに変化した（写真1）。. 3発生に伴うドジョウ胚ヘパリン結合性 タンパク質画分（0−5、■．0、. 2−OMNaCl溶出）の変化 受精直後の卵、胞胚期の胚、原腸期の胚、4∼8体節期の胚及び12∼16体節期の. 胚の5stagesのPD−10画分をヘパリンアフィニティ一考ラムに各々約10mgシ. リンジで添加し、0．5、1．0、2．OMNaCl溶液で溶出し、その西分を280 nmUVで吸収スペクトルを測定し距（図7）。また、ヘパリン結合性タンパク質画分 をドジョウ胚1g当たりに換算し直し拒。次に、 PD−10画分に含まれるタンパク質. 量：を100％とし、0．5M、1．0、2．OMNaCl溶液で溶出されるヘパリン結 合性タンパク質量を算出した（表2）。. 16 一.
(21) 4NaC1溶液中の塩濃度のキンギョFB DF細胞に対する細胞成長効果. 199＋1％NBCSに添加する試料のNaCl溶液中の塩濃度の影響：を0．5M、. 0．25M、0．22M、0．20M、0．18Mの塩濃度でFBDF細胞に対する細 胞成長効果を測定すると（図8）、NaCl溶液中の0．5M塩濃度でFBDF細胞の細 胞成長に阻害効果が見られた（tニ4．967、df＝4、Pく0．Ol）。塩濃度の影響が出ると考えられる. 0．5M塩濃度の試料を添加した場合は、その測定値に塩濃度の影響と考えられる滅少 率を加味した。. 5 ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク質画. 分（0．5MNaC1溶出）のキンギョ FBDF細胞に対する細胞成長因子活性 ドジョウ胚の受精直後の卵（1g）からの回収タンパク質量は、ヘパリン結合性タン. パク質量は2．8×103μgであり、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性を求める と、1／2最大濃度活性は1．5μg／WELL、全活性は1．9×10 3uni ts、比活 性は。．68unit／μgであっ距。胞胚期の胚ではこれらの値は、2．2×103μg、. 1μg／WELL、全活性は2．2×103units、比活性は1．Ounit／μg、原腸期. の胚では5．3×103μg、3．5μg／WELL、1．5×10 3uni ts、0．28 unit／μg、4∼8体野選の胚では3．3・X 103μg、3．5μg／WELL、0．9 ×10 3uni ts、0．2 7unit／pt g、12∼16体節期の胚では3．8×103μg、. 2μg／WELL、 L gXlO 3uni ts、0．50unit／μgであった（図9、10、 11、，12、13、表3）。. 一 17 一.
(22) 6 ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク質画. 分（■．OMNaC1溶出）のキンギョ FBDF細胞に対する細胞成長因子活性 ドジョウ胚の受精直後の卵（1g）からの回収タンパク質量は、ヘパリン結合性タン. パク質量は1．9×103μgであり、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性を求める と、1／2最大濃度活性は1．0μg／WELL、全活性は1．9×10 3uni ts、比活 性は1．Ounit／μgであっだ。胞胚期の胚ではこれらの値は、1．5×13μg、. 1．0μg／WELL、1．5×10 3uni ts、1．Ounit／μg、原腸期の胚では 2・ O×1031t g． 1． OIL g／WELL． 2． 0×103units． 1． Ounit／”g．. 4∼8体節期の胚では1．6×103回目、1．5μg／WELL、1．1×10 3uni ts、. 0．69unlt／μg、12∼16体節期の胚からの回収タンパク質量は1．9×103 μgであるが、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性は他の発生段階と比較すると低. かっta（図14、15、16、17、18、表4）。. 7 ドジョウ胚ヘパリン結合性タンパク壁画. 分（2．OMNaC1溶出）のキンギョ FBDF細胞に対する細胞成長因子活性 ドジョウ胚の受精直後の卵（1g）からの回収タンパク質量は、ヘパリン結合性タン. パク質量は9．4×10μgであり、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性はなかっ. た。胞胚期の胚では7．3×10μg、原腸期の胚では3．OX102μgでともに細胞 成長因子活性は見られなかった。. 4∼8体早期の胚では2．5×102μg、12∼16体四聖の胚では5．OX102 μgであるが、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性は他のNaCl溶出画分と比較 一18一.
(23) すると極めて低かった（図19、20、21、22、23、表5）。. 一19一.
(24) IV考察 ■ ドジョウ胚PD一■0カラム出癖とヘパ リン結合性タンパク質画一（0．5M、. ■．OM、2．OMNaC1溶出）の発生 に伴うタンパク質量の変化 ドジョウ胚（1g）中のPD−10カラム面分のタンパク質量の変化を見ると、受精. 直後卵（63mg）から胞胚期（55mg）にかけて減少しているのは母性由来のタン パク質が発生の進行に伴い分解されていることを示唆し、胞胚期から原腸期（58mg）、. 4∼8体節期（681ng）への増加は胚自身の遺伝子が発現し、発生の進行に伴い多量 のタンパク質が合成され、様々な器官に分化し形態形成がなされていることを暗示して. いる。12∼16体節期（53mg）においてタンパク質量の増加の度合いは低下して いた（図24）。. PD−10カラム画分のヘパリン結合性タンパク質以外のタンパク質量はいずれの発 生時期も多量に含まれ90％前後を占めていることは、ヘパリン非結合性タンパク質も 発生に重要な働きをする可能性を示唆している（図25、表2）。. ヘパリン結合性タンパク質の量的変化を見ると、いずれのNaCl溶出西分も受精直 後卵から胞胚期にかけて変動はなく、原腸期に増加し、4∼8体節期に減少、その後 12∼16体節期に増加している。これは、胚におけるタンパク質代謝を相対的にみる と胞胚期から原腸期にかけてヘパリン結合性タンパク質は胚によってより活発に合成さ. れ、4∼8体節期にかけてはむしろ分解され、更に12∼16体節期には再び活発に合 成されることを示唆し、発生段階で最も形態形成が顕著に進行するこれらの時期にヘパ リン結合性タンパク質が重要な役割を果taすことを暗示している（図25）。’. 一20一.
(25) 以上のことをまとめると、受精直後卵から胞胚期は母性由来のタンパク質（ヘパリン 結合性タンパク質も含む）が発生に従い分解され、胞胚期から原腸期にかけては胚の遺 伝子の発現によりタンパク質（ヘパリン結合性タンパク質も含む）が発生に従い活発に. 合成されていることを暗示する。原腸期から4∼8体節期にかけてはタンパク質合成は 更に活発に進むが、ヘパリン結合性タンパク質量は減少（ヘパリン非結合性タンパク質. 量は増加）し、4∼8体下期から12∼16体節期にかけてはタンパク質量が減少し、 逆にヘパリン結合性タンパク質が増加するという発生過程でのダイナミックなタンパク 質代謝系の存在が示唆された。. このことから、胞胚期から原腸期にかけて相対的に増加したタンパク質群（ヘパリン. 結合性タンパク質を含む）、原腸期から4∼8体節期にかけて減少したヘパリン結合性 タンパク質群、原腸期から4∼8体下期にかけて増加したヘパリ．ン非結合性タンパク質. 群、4∼8体節期から12∼16体節期にかけて増加したヘパリン結合性タンパク質群 の機能を解析する事が必要である。. 2ドジョウ胚PD一■0カラム画分とヘパ リン結合性タンパク質画分（0．5M、. ■．OM、2．OMNaC1溶出）の発生 に伴うキンギョFBDF細胞に対する細 胞成長因子活性の変化 PD−10カラムによるタンパク壁画分の発生段階別の細胞成長因子活性の変化につ いてみると、いずれの時期のタンパク質画分もFBDF細胞に対する最大活性度は高く、 全活性、比活性の大きさとも4∼8体節期が他の発生時期（受精直後の卵・胞胚期・. 原腸期・12∼16体節期）より高かった。これは、先に述べたタンパク質量の変化の 項で4∼8体節期で多量のヘパリン非結合性タンパク質珊珊が増加し距事とも関係する. 一21一.
(26) のかも知れない（図26）。また、PD−10カラムによるタンパク質画分のFBDF細 胞に対する細胞成長因子活性を測定した場合、そのタンパク質量が高濃度になると. 4∼8体節期では細胞形態に顕著な変化が見られたが、原腸期、12∼16体同期では この現象が見られなかった事実とも関連するかも知れない。4∼8体同期のヘパリン. 非結合性タンパク質画分のFBDF細胞に対する作用を検討することが必要である。. ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl溶出）の発生段階別の細胞成長 因子活性の変化についてみると、いずれの時期のタンパク質画分もFBDF細胞に対す る最大活性度は高く、全活性、比活性の大きさは、胞胚期〉受精直後卵＞12∼16 体節期＞＞原腸期、4∼8体節期の順であり、先に述べ拒タンパク質量の変化と考え合 わせると、ヘパリン結合性タンパク質笹分は3つのグループ、すなわち、受精直後卵・. 胞胚期の母性由来のタンパク早々分、原腸期・4∼8体節期の胚の遺伝子の発現により. 合成されたと推定されるタンパク挿画分、12∼16体予期の胚の遺伝子の発現により 再び合成されたと推定されるタンパク質野分に分けられた（図27）。. ヘパリン結合性タンパク質画塾（1．OMNaCl溶出）の発生段階別の細胞成長因 子活性の変化についてみると、FBDF細胞に対する最大活性度はいずれの時期も前述. のヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl溶出）よりやや低く、12∼16 体節期で特に低かった。全活性、比活性の大きさは、原腸期、受精直後卵〉胞胚期＞＞. 4∼8体節期の順であり、先に述べたタンパク質量の変化と考えあわせると、ヘパリン 結合性タンパク質国分は3つのグループ、すなわち、受精直後卵・胞胚期・原腸期の. タンパク質画分、4∼8体節期のタンパク質職分、1・2∼16体節期に再び合成されte と推定される最大活性度の非常に低いタンパク質平分に分けられた（図28）。. このヘパリン結合性タンパク甲唄分（1．OMNaCl溶出）の発生段階別のFG F−1及び一2に対するWestern Blotting （岡山大学 妹尾昌治博士の解析：図29） では、human抗F G F−1に対する免疫反応は胞胚期・原腸期・4∼8体節期にあり、. 12∼16体節期には見られず、human抗FGF一一2に対する免疫反応は4∼8体三期の 一22一.
(27) みに見られた。研究が進んでいるXenop〃sの初期胚では、胞胚期に抗FGF−2に対す る免疫反応が見られ5）、FGF−4に似たシグナルペプチドを持つXenop〃s embryom i c. FGFのmRNAが未受精卵∼尾芽期に存在し、特に原腸期に多量に出現していること が報告されている8｝ 41｝。. これらの事から、母性由来のFGF−1が胞胚期まで存在し、原腸期以降4∼8体節. 期までFGF−1が合成され、4∼8体画期に更にFGF−2が合成され、12∼16 体節介にはFGF−1、一2が分解され、新しいヘパリン結合性タンパク質が合成され ることが示唆される。. ヘパリン結合性タンパク写研分（2．OMNaC1溶出）の発生段階別の細胞成長 因子活性の変化についてみると、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性は受精直後卵. ・胞胚期・原腸期で見られず、4∼8体節事と12∼16体節期で非常に低い活性が見 られた。全活性、比活性の大きさは、4∼8体早期＝12∼16体節期＞＞原腸期（受 精直後卵、胞胚期はない）であり、先に述べたタンパク質量の変化とあわせると、ヘパ. リン結合性タンパク質四分は3つのグループ、すなわち、受精直後卵・胞胚期の全く含. まれない申分、原腸期の活性のないタンパク洋画分、4∼8体節期・12∼16体節期 に増加した最大活性度の極めて低いタンパク質書分に分けられた。. 以上の事から、ドジョウの受精直後卵から胞胚期では母性由来のタンパク質（ヘパリ ン結合性タンパク質も含む）は発生に伴い順次分解され、胞胚期から原腸期にかけては 胚の遺伝子が発現して、新しい生体システム作りに不可欠なタンパク質（ヘパリン結合. 性タンパク質も含む）が合成さ：れ、更に4∼8体節期。12∼16体節期にかけてはヘ パリン結合性タンパク質量の増減を含むタンパク質の合成と分解が活発に起こり、タン パク質変動パターンと発生（形態形成の進行）との関連性が示唆され拒。. 一一. @23 一.
(28) V. 謝. 辞. 本研究は兵庫教育大学自然系動物生理学教室で行ったものである。この間、終始適切 な助言と懇切丁寧なご指導を賜った稲葉耕三教授、並びに笠原 恵先生に謹んで感謝の 意を表します。. まte、ドジョウ胚のヘパリン結合性タンパク質画分（1．OM NaCl溶出）に対す るFGF−1及び一2の解析等、多大なご指導と助言を賜った岡山大学工学部生体機能 研究室の妹尾昌治先生に感謝の意を表します。. 一24一.
(29) 一VI. 文 献. 1）. 松代愛三編 ”発生”化学同人 （1991）. 2）. Slack，J．M． ＆ Forman，D． ” An i nteraction between dorsa l and ventra l reg i ons of the marg i na l zone i n early amph i ban embryos ”. j．Embryo l．exp．Morph． 56，283−299（1980）. 3）. Slack，3．M．W． Darlington，B．G． Heath，J．K． Godsave，S．F． ” Mesoderm i nduction in early Xenopus embryos by hepar i n−bind i ng growth factors ”. NATURE 326，197−200（1987）. 4）. Nieuwkoop，P．D． ＆ Faber，J． Nemal table of Xenop”s laevis （ N．Hol l and，. Amsterdam，1967） 5）. Slack，J−M一 ＆ H・V． l saacs ” Presence of bas i c f i broblast faci or i n the. early Xenepus embryo ” Develgpment 105，147r153（1989） 6）. Kime l man，D． ＆ K i rschner，M． ” Synerg i stic i nduction of Mesoderm by FGF and TGF−P and the l ndent i f i cat i on of rnRNA Cod i ng for FGF i n the Early. Xenop”s Emhryo ” Ce l 1 51，869−877（1987）. 7）. 塩川光一郎・浅野美咲き”両生類における中胚葉形成と成長因子” 細胞工学 Vo l．9 No，10（1990）. 8）. ：塩川光一郎・浅野美咲・田代康介・古賀千恵・”成長因子遺伝子群の作用と初期胚 の形態形成”蛋白質核酸酵幸 2633−2653Vo 1．38（15）（1993）、. 9）. Slack，」．M．V． ” PEPT I DE REGULATORY FACTORS I N EMBRYOM I C ”. DEVELOPMENT 1312−1316，（1989） 10）. 林 恭三・古川昭栄 ”成長因子1”広川書店 （1993）. 11）. Asashima，M． et a 1．：Proc．Nat1．Acad．Sc i．USA，88，6511−6514（1991）. 12）. 内山英穂。浅島 誠：形づくりの最初の分子シグナルと遺伝子発現 細胞 24（8）（1992） 一 25 一一.
(30) 13） 内山英穂・浅島 誠 ”両生類（ゼノパス）の初期発生と遺伝子群” 蛋白質核酸酵素 2443−2455Vo 1。38（15）（1993） 14） Thomsem，G． et a l．：Cel l 63，485−493（1990） 15） Weeks，D．L． ＆ Me l ton，D．A． ” A Materna l mRNA Loco l i zed to the Vegeta l. Hem i sphere i n Menop”s Eggs Codes for a Growth Factor Re l ated to TGF−B ”. Cell 51．861−867（1987） 16） Green，J・B． Heten V．N． J．C．Sm i th ” Responses of Embryom i c Aebnep”s Cells to. Activin and FGF Are Separatede by Mu l t i ple Dese Thesholds and Correspond to D i st i nct Axes of the Mesoderm ” Ce S 1 71，731−739（1992）. 17） 浦井太郎”ドジョウ胚由来のヘパリン結合性成長因子の検索” 兵庫教育大学修士論文く1993） 18） Yasufumi，E． Akihiko，Y． Kaoru，S． ” tdentification of four FGF receptor genes i n Medaka f i sh （ eryiias latipes ） ” Federat i on of European. Biochemica1 Societies Vo1．314（2），176−178（1992）. 19）八田公平 ”ゼブラフィッシュの胚発生過程と遺伝子群” 蛋白質核酸酵素2433−2442Vo 1．38（15）（1993）. 20）江上信雄編”実験動物としての魚類” ソフトサイエンス社 （1981） 21） 川那部浩哉・水野信彦’，日本の淡水魚” 山と渓谷社 （1989）. 22） 水野信彦・後藤 晃”日本の淡水魚類” 東海大学出版（1989） 23） 鈴木 亮”図解 ドジョウの養殖” 緑書房 （1982）. 24） 渡辺国夫”金魚の飼い方と病気”永岡書店（1984）. 25） 日本組織培養学会編”組織培養の技術第2版”朝倉書店（1990） 26） 黒田行昭”細胞培養の技法” ニューサイエンス社（1984）. 27）大澤省三・堀田康雄”細胞生物学実験法” 廣川書店. 28）辻啓一訳”緩衝液の選択と応用”講談社サイエンティフィック（1982）. 一 26 一一.
(31) 29） 森 敏雄”キンギョ尾鰭再生芽由来線維芽細胞の培養とドジョウ胚よりの細胞. 増殖因子の検索”兵庫教育大学修士論文 （1992） 30） 山田雅保・沖垣 達”繊維芽細胞培地由来の付着・増殖因子 一歴史的展望と 最近の進歩一”組織培養 Vo 1．13（5）162−167（1987）. 31）井出利憲”細胞増殖のしくみ”共立出版（1989） 32） 毛利秀雄。香川靖雄”実験生物学講座 細胞分画法” 丸善 （1984）. 33）永井裕・林利彦訳”生化学実験法ゲルクロマトグラフィー” 東京化学同人（1981）. 34）山崎誠・石井信一・岩井浩一”アフィニティークロマトグラフ≧一” 講談社サイエンティフィック （1976）. 35） 木村一郎・後藤八重”ヘパリンカラム法：細胞成長因子の精製への利用” 細胞 Vo 1．19（2）（1987） 36） Masaharu Seno ” Stud i es on the Structu re and Function of Human Bas i c. Fibroblast Growth Factor ” （1990） 37） M．Klagsbrun and Y．Shing ” Heparin affnity of anionic and cationic endothel i al ce11 growth factor． Ana l ys i s of’hypothalamus growth factors. and f i broblast growth factors Proc． Natl． Sci． USA Vo l．82，805−809 （1985）. 38）岩井勇児”児童生徒理解の統計法”福村出版 （1992） 39） 日本生化学会編 ”タンパク質の化学1 分離精製” 東京化学同人. 40） 菅原 潔。副島正美”生物化学実験法7 蛋白質の定量法第2版” 学会出版（1986） 41） H．V．Isaacs， D．Tannahill ＆ J．M．Slack ” Expression of novel FGF i n the. Xenop”s embrye． A new cand i date i nducing factor for mesoderm formation and anteropesterior spec i f i cation ” Deve l opment 114，711−72e（1992）. 一27一.
(32) VH 図版 図1 NBCS濃度のキンギョFBDF細胞に対する細胞成長効果 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Ol：を表し、1は標準誤差を示す。. 図2 ドジョウ胚（受精直後卵）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞 成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．01：を表し、1は標準誤差を示す。. 図3 ドジョウ胚（胞胚期）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞成長 因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Ol：を表し、1は標準誤差を示す。. 図4 ドジョウ胚（原腸期）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞成長 因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図5 ドジョウ胚（4∼8体節期）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細 胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図6 ドジョウ胚（12∼16体節期）PD−10カラム画分のFBDF細胞に対す る細胞成長因子活性濃度曲綜 ＊：Pく0．05、赫：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。.
(33) 図7 ドジョウ胚抽出タンパク質のヘパリンカラム溶出画分280n．mUV吸収. 図8 NaCl溶液中の塩濃度のFBDF細胞に対する細胞成長効果. 図9 ドジョウ胚（受精直後卵）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl 溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図10 ドジョウ胚（胞胚期）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：P《0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図11 ドジョウ胚（原腸期）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：PくO．OIを表し、1は標準誤差を示す。. 図12 ドジョウ胚（4∼8体節期）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M. NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．01を表し、1は標準誤差を示す。. 図13 ドジョウ胚（12∼16体節期）ヘパリン結合性タンパク質画分（0．5M. NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。.
(34) 図14 ドジョウ胚（受精直後卵）ヘパリン結合性タンパク質画分（1．OMNaC1 溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．01を表し、1は標準誤差を示す。. 図15 ドジョウ胚（胞胚期）ヘパリン結合性タンパク質画分（1．OMNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．01を表し、1は標準誤差を示す。. 図16 ドジョウ胚（原腸期）ヘパリン結合性タンパク質三分（1．OMNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図17 ドジョウ胚（4∼8体節期）ヘパリン結合性タンパク質画分（1．OM. NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．01を表し、1は標準誤差：を示す。. 図18 ドジョウ胚（12∼16体節期）ヘパリン結合性タンパク質三分（1．OM. NaC1溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：P《0．05、＊＊：PくO．Olig表し、1は標準誤差を示す。. 図19 ドジョウ胚（受精直後卵）ヘパリン結合性タンパク質画分（2．OMNaC1 溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：PくO．Ol ig表し、1は標準誤差を示す。.
(35) 図20 ドジョウ胚（胞胚期）ヘパリン結合性タンパク質画分（2．OMNaC五溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Ol：を表し、1は標準誤差を示す。. 図21 ドジョウ胚（原腸期）ヘパリン結合性タンパク質三分（2．OMNaC1溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：Pく0．05、＊＊：Pく0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図22 ドジョウ胚（4∼8体予期）ヘパリン結合性タンパク質画分（2．OM. NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲線 ＊：P＜〕．05、＊＊：P《0．Olを表し、1は標準誤差を示す。. 図23 ドジョウ胚（12∼16体節期）ヘパリン結合性タンパク質画分（2．OM. NaCl溶出）のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性濃度曲纏 ＊：Pく0．05、＊＊：P《0．Olを表し、1は標準誤差：を示す。. 図24 ドジョウ胚発生段階別PD−10カラム画分のタンパク質量. 図25 ドジョウ胚発生段階別ヘパリン結合性タンパク質丁丁（0．5M 1．OM. 2．OMNaCl溶出）の割合 ただし、PD−10カラム溶出画分のタンパク質量ig 100とする。. 図26 ドジョウ胚発生段階別PD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞成長 因子の全活性.
(36) 図27 ドジョウ胚発生段階別春バリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子の全活性. 図28 ドジョウ胚発生段階別ヘパリン結合性タンパク質画分（1．OMNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子の全活性. 図29 Western Blotting Analysis of Hepari’n Binding Fraction（1．OM NaCl溶出） of Loach Embryo （Data by Dr．M．Seno）. A．抗ヒトFGF−1抗体に対する免疫反応 lanel：ac i d i cFGF．1ane2：basicFGF．1ane3：Blastu l a．1ane4：Gastru l a lane5：4’v8som i te．1ane6：12’s−16som i te. B．抗ヒトFGF−2抗体に対する免疫反応 1anei：bas i cFGF．1ane2：Blastula． I ane3：GastruIa l ane4：4−v8somite． 1ane5：12一一16som i te.
(37) （x io. n）. 3．0. 細2．5 胞. seed（植え込み）. 2．0. 数. 5％o. ／ 1．ro. 旧ediUl闘. change. W. ＊＊. （NBCSIX）. E 1．U L L. 2％. medium change. 1％o. （NBCSIX，2X，5％）. o．Jr. o o. 2. 1. 3 4 〈d ay s）. 5. 6. 図1. （X工0. 4）. 6. 細. 5. 胞. 4 ＊＊. 数. ／. 3. W. E 2 L L 1 7．8 31. o O 16. 63. 125. 250. （ ll g／WELL）. 図2. 500.
(38) （×10 4）. 6. 細 5 胞. 4. 数 ＊ ＊. ／ 3. W E L L. ＊＊. ＊＊ ＊. 2 2： ＊. 1 10 41. o. 0 20 82. 163. 325. 650. （ ll ’g ／WELL）. 図3. （×10 4）. 6. 細 5. ＊＊ ＊一＊. ＊. ＊＊. 胞. 4. ＊＊. ＊＊. 数. ／ 3. W. EL 2 L. 1 16 63. o. 図4. 0 31 125 250. 500 （u g／WELL）. 1000.
(39) （XIO 4） 6. 紬 5 ＊＊. 胞. 4 数. ＊＊. ＊＊. 3. ／. W E L. L. ＊＊. ＊. 2. 1. ＊＊. t6 63. o. ＊＊. 0 31 125. 250. 500. 10QO. （ ／i g／WELL）. 図5. （×10 4）. 6. 細 5 ＊＊. 胞. 4. ＊＊. ＊＊. ＊＊ ＊＊. 数. ／. 3. ＊. W. E 2 L L. ＊＊. 1. 16 63. o. 0 31 125. 250’. 」roo. （ 1i g／WELL）. 図6. 1000.
(40) O．3. 0. O．5M NaC1. D. O．2. 2 8. 0 O．1. n. m. o 受精直後卵. o D O．2. 胞胚期. 原腸期. 4∼8体節期. 12∼16体節期. 胞胚期. 原腸期. 4∼8体節期. 12∼16体節期. 1．OM NaC1. 2 8 O．1. 0. n. m. O. 受精直後卵. o D O．2. 2．OM NaC 1. 2 8 O．1. 0 n m. o. 一‘L一 4 A 一A一 “2L 受精直後卵. 図7. 胞胚期. 原腸期. 4∼8体節期. 12∼16体節期.
(41) （×10. 4）. 6. 細 5 胞. 4 数. ／. 3. W. ．x一．一一一一．一一一一一一一．一．．一．一一．一一一一一N一．一za一一ke一一N一．一一一一一：EL＊. E 2 L. L 1. o O．18 図8’. O．20 O．22. o．2Jr. （M）. O．5.
(42) ＊＊. （×10. 4）. 6. ＊＊. ＊＊. 細. 5. ＊＊. 胞. 4 数. ／. 3. W. E 2 L L 1. o o. 1．q. 2．8. 11. 」rSJ. （ li g／WELL）. 図9. （×10 4）. 6. 細 5 ＊＊. ＊＊. ＊＊. 胞. 4. ＊＊. 数. ／. 3. W. E 2 L L 1. o o. 1．2. 2．4. 4．8. （ ／i g／WELL）. 図10. 9．5.
(43) （×10. 4）. 6. ＊＊. 細. 5. 胞. 4 数. ／. W E L L. 3. 2 1. o o. 4．4. 8．8. 18. 35. （ li g／WELL）. 図11. （×10. q）. 6. ＊＊. 細. 5. 胞. 4 数. ／. 3. W. E 2 L L 1. o o. 図12. 3．Jr. 7．0. 14 （ iL g／WELL）. 28.
(44) （×lo 4）. 6. ＊＊. 細5 4 胞. 数. ／ 3. W. E 2 し し. 1 0. 図13. O 2．0 4．0. 8．0. （ pt g／WELL）. 16.
(45) （XIO 4） 6. 細. 5. ＊＊ ＊. 胞. 4. ＊. 数. ／. 3. W. E 2 L L 1. o o. O．6. 1．2. 2．4 （ lt g／WELL）. 4．8. 図14. （×10. 4）. 6. 細. 5. 胞. 4. ＊＊. 数 ＊＊. ／. 3. W. E 2 L L 工. 。. o. O．5. ユ．0. 2．0. （ li g／WEL 1． ）. 図15. 4．0.
(46) （×10 4） 6. 細 5 胞. 4. ＊＊. 数. ／. W E L L. ＊＊. ＊＊. 3. 2. 1 o o. O．8. 1．6. 3．3. 6．5. （li g／WELL）. 図16. （×10 4） 6. 細 5 ＊＊. 胞. ＊. 4. ＊. 数. 3. ／. W E L L. 2. 1 o o. 図17. 1．0 2．0. 4．0. （ pt g／WELL）. 8．0.
(47) 〈×10 4） 6. 細5 胞. 4 数. ／3 W E L L. 2. 鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈 一一一. 1 o. O O．5 1．0 図18. 2．0. （／i g／WELL）. 4．0.
(48) （X星04）. 3．0. 細2．5 胞. 2．0. 数. W E1 ．O. L. L. o． r）. OLL−k一一L一一一一一L一一一一r一一一一一．一一．一 ff一一一一ff一一一. 図19. 〇 o．07s o．br o．3 o．6 （ pt g／WELL）. （×10 4）. 3．0 細2．5 胞. 2．0. 数. ／i．5t．／一一pt一一一＋一一一一一一一一一一一一M＋一．一一一一一一一ptL一一一一一一. W E1 ．O. L L. O．5. 0. 図20. 0 O．05 O．1 O．2 O．4 （ pt g／WELL）.
(49) （×10 4）. 3．0 細2．5 胞. 2．0. 数. ／1 So. W E1 ．0 し し. O．or. o o. O．15. O．3. O．6. 1．2. （ ll g／ VV ELL）. 図21. （’. 10 4）. 3．0. 細2．5 胞. 2．0. 数. ＊. ＊. ／1．5. W E1 ．O. L L O．5. o o. 図22. O．18 O．35. O．7 （ ll g／WELL）. 1．4.
(50) （×10 4）. 3．0. 細2．5 胞 数. 2．0 ＊ ＊. ＊. ／1．Jr. ＊. W LE1．O L O．or. o o. 図23. O．2. O．4. O．8. （ll g／WELL）. 1．6.
(51) 1四 9臼. 聞 夕. 鴨. ／s. G臼. 裟. 5日. 昏. 頁. 4日. m g. 銅. 63. 3. 四 1臼. 臼. 受精心後卵. 胞胚期. 4∼8体節期12−16体節期. IJ VJJPJi. 発生劇階. 図24. 16 14 夕 ／s. 12. 歪. kミ. 1U. 壷. 、∼. 8. 三. 〆 9．9. 魅、・． 、. 蜜虚2躍露. 6 子. 4. v. 2 日. 受精置後置. 胞胚期. 原. 4∼8節期12’一16体節期. 発生段階. ％ O． 5MNaC1. 図25. ge 1． OMNaC1. X 2． OMNaC1.
(52) （×置0. 3）. 8. ’ir. 6. 毒. 5. 曾. 4 3. 豊. 2 1. s 受精置後卵. 胞胚期. 4∼8体節期12’一16体節期. 原. 発生殿階. 図26 （× l O 3） 3．e. 2．5. 蓮. 2． 1. 9. 1．5. 1．g. 豊. 臼．5. 臼. 受精e後卵. 胞胚期. 原腸期. 4一’8体節期12’一16体節期. 発生段階. 図27. （× 1 0 3） 3．m. 2．5. 軽 禽. 豊. 2．g一. 1．5. 1．g一. Z．5. 臼. 受精且後卵. 図28. 胞胚期. 原. 発生段階. 4∼8体節期12一一16体節期.
(53) 麟鵜夢 97．4k. 97．4k. 69k 46k. 69k 46k. 30k. 30k 21．5k. 21．5k. 14．3k. 14．3k. 勤蜜1 無・洲 デレ㌧・鰍・ 懇∫・1． ，. ｛鄭. r；ewi．i’．，． sg， ． ，：．tf’・，：’s．｛，‘，r”’1；．：・ ． ’. MAb Afi−52. 図29. MAb 78.
(54) 表1 ドジョウ胚（1g）のPD−10カラム画分のFBDF細胞に対する細胞成長 因子活性. 発生段階. 全タンパク質量. 全活性. （” g） （uni ts￥） 受精直後卵. 6．3×1e. 7． 0×1 di. 胞胚期. 5． 5×le. 3． 2×1 di. 5． 8×1 di. 2． 8×1 di. 6． sxi 04. 5． 2×1 di. 5． 3×IS. 2． 9×1 di. 原腸期. 4∼8体節期. 12∼16体節期. 比活性. （unit／”g） O． 11. 0．058 0．048 0．077 0．056. ＊1 unitとは、199＋1％NBCS培養液0．5ml中に含まれるFBDF細胞. に対する因子の示す1／2最大細胞成長因子活性を誘導するタンパク質量とする。.
(55) 表2 ドジョウ胚（19）に含まれるヘパリン結合性タンパク質とその割合 発生段階. 分画. 回収率￥. タンパク質量 （” g）. 受精直後卵. （％）. 3. O． 5M NaC1. 2．8×10. 4． 0. 1． OM NaC1. 1．9×10. 2． 8. 2． OM NaCl. 9． 4×10. 0．1. 3. 合計 胞胚期. 3. O． 5M NaC1 1． OM NaC1 2． bM Naci. 原腸期. 6． 9. O． 5M NaC1. 2．2×10. 3． 9. 3 1． 5×10. 2． 8. 7．3×10. 0．1. 合計. 6． 8. 3 5． 3×10 3. 8． 6. 1． OM NaC1. 2．0×10. 3． 2. 2． OM NaCl. 3．0×10. 0． 5. 2. 合計. 4∼8体節期. 12． 3. 3. O． 5M NaC1. 3．3×10. 4． 5. 1． OM NaC1. 1． 6× 1．0. 2． 2. 2． OM NaCl. 2．5×10. 3 2. 0．4. 合計. 12∼16体節期. O． 5M NaC1 1． OM NaC1. 2． OM NaC1. 7．1. 3．8×玉♂. 5． 5. 3. 1．9×10. 2． 8. 2 5． 0×10. 0． 7. 合計. 9． 0. ＊ただし、回収率は、PD−10カラム両分のタンパク質量：を100として求めた。.
(56) 表3 ドジョウ胚（1g）のヘパリン結合性タンパク質画分（0．5MNaCI溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 発生段階. 全タンパク質量 （pt ’g）. 受精直後卵 胞胚期 原腸期. 4∼8体節期. 12∼16体節期. 3. 2． 8×10 3. 2． 2×10 3. 5．3×10 3. 3．3×10 3. 3．8×10. 全活性 （しtnits＃）. 3 1． 9×10 3. 2．2×10 3 1． 5×10 3. 0．9×10 3 1． 9×10. 比活性 （uni t／” g）. O．68 1．0. O．28 0．27 O．50. ＊1 unitとは、199＋1％NBCS培養液0．5m1中に含まれるFBDF細胞 に対する因子の示す1／2最大細胞成長因子活性を誘導するタンパク質量とする。.
(57) 表4 ドジョウ胚（1g）のヘパリン結合性タンパク質画分（1．OMNaCl溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 発生段階. 全タンパク質量. 全活性. 比活性. ’（ll g） （units￥） 受精直後卵 胞胚期 原腸期. 4∼8体節期 12∼16｛本節其月. 3 1． 9×10 3. 1．5×10 3. 2． 0×10 3 1． 6×10 3 1． 9×10. 3 1． 9×10 3 1． 5×10 3. （u nit／u g）. 1． 0 1． 0. 2．0×10. 1． 0. 1．1×10. O．69. 3. ±. 1＝. ＊1uni七とは、199＋1％NBCS培養液0．5ml中に含まれるFBDF細胞に 対する因子の示す1／2最大細胞成長因子活性を誘導するタンパク質量とする。. ±とは、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性が見られたが、他の発生段階と同様に 比較することができない低い活性であることを表す。.
(58) 表5 ドジョウ胚（1g）のヘパリン結合性タンパク質画分（2．OMNaC1溶出） のFBDF細胞に対する細胞成長因子活性 発生段階. 全タンパク質量. 全活性. （pt g） （units一） 受精直後卵. 9． 4×10. 胞胚期. 7． 3×10. 原腸期. 3． 0×10. 4∼8体節期. 2． 5×10. 12∼16体節期. 比活性 （u nit／u g）. 2 2 2. 5． 0×10. ±. ±. ±. ±. ＊1 unitとは、199＋1％NBCS培養液0．5ml中に含まれるFBDF細胞に 対する因子の示す1／2最大細胞成長因子活性を誘導するタンパク質量とする。. 一とは、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性が見られないことを表す。. ±とは、FBDF細胞に対する細胞成長因子活性が見られたが、他のNaC1溶出 画分と同様に比較することができない極めて低い活性であることを表す。.
(59) 写真1 ドジョウ胚PD−10カラム画分とヘパ．リン結合性タンパク質画分（1．OM. NaCl溶出）のFBDF細胞の細胞成長に対する濃度効果。. タンパク質を添加後、4日経過しtaFBDF細胞 1目盛り＝100μm。. A．1％NBCS B．10％NBCS C∼G：PD−10カラム画分（4∼8体節期）. C． 63”g／ VVELL D． 125 pt g／WELL. E． 250 pt g／WELL F． 500ug／ WELL G． IOOO pt g／WELL H：ヘパリン結合性タンパク質画分（4∼8体節期） 8μg／WELL.
(60) ta，swpTl［rpi. 1欝麟1・111. 灘 舳勘. ﾙ. IlrlF／；：ic／. 1」lll・1糊. 齢蝿輝. C．63”g／WELL. D． 125 pt g／WELL.
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