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微生物遺伝資源利用マニュアル (15) ISSN 1344-1159
MAFF Microorganism Genetic Resources Manual No.15
サイレージ発酵乳酸菌
Lactic acid bacteria isolated from silage
蔡 義民
畜産草地研究所・飼料調製研究室
1. はじめに サイレージとは、乳酸菌の力を巧妙に利用して調製された家畜の貯蔵飼料であり、その発酵品質には多くの 微生物が関与するが、勿論その決め手が乳酸菌である。乳酸菌は分類学的にDNA 低 G+C 含量のグラム染色陽 性、カタラーゼ陰性、原則として非運動性、リジン型を中心とした細胞壁ペプチドグリカンなど、多くの共通 の性質をもっている細菌の総称であるが、複雑な栄養要求性から、多くの種類のアミノ酸、ビタミン類が存在 する環境でなければ増殖できない。したがって乳酸菌は動物・植物界を中心に生息し、人間とも親しい細菌と いうことができる。 乳酸菌は植物と共生するが、植物体の付着機構とその役割はまだ知られていない。しかし、乳酸菌が乳酸な どの有機酸やバクテリオシンを生産するため、病原性微生物から植物体を守ると考えられている。このことは 損傷を受けた植物体部位において乳酸菌が優勢となり、その他菌の増殖を抑えたと報告されている（森地1999）。 飼料作物・牧草に付着する微生物菌数は草種、植物体部位、生育ステージおよびその地域性によってそれぞれ 異なるが、いずれの草種においても、サイレージ発酵能力が高い乳酸菌は少ないことが認められている（蔡ら 1991a、1994）。乳酸菌のうち、サイレージ発酵に極めて重要な役割を果たす Lactobacillus plantarum や Lactobacillus caseiのような乳酸桿菌等が最も少なかった。逆に、有害菌とされる大腸菌とブドウ球菌などの 好気性細菌および好気的変敗の原因菌である糸状菌と酵母が高い菌数レベルで生息していた。したがって、野 生 乳 酸 菌 に 依 存 す る“自然発酵”では良質サイレージを調製するための不安定要因になるとも言える （McDonald et al. 1991、蔡 2001、Ohmomo et al. 2002）。サイレージ発酵に関与する乳酸菌は Lactoba illus、Leuconostoc、Lacto occus, Enterococcus、Pediococcus およびWeis llaなど多数の属に分類される（蔡1996、1999、2001、Cai et al. 1999b、1999d、Zhang et al. 2000、 Ennahar 2003）。飼料作物に付着する乳酸菌の種類、その菌数、発酵形式および生成乳酸の光学異性は、サイレ ージの発酵品質ばかりでなく、栄養価値や反芻家畜の生理代謝に影響を与える（蔡2001）。また、材料草に共生 する酪酸菌、好気性細菌、糸状菌および酵母などの微生物は、乳酸菌の発酵を競合的に阻害し、サイレージ品質 の劣化や発酵損失を招く原因となる（大山1971、森地 1973、森地・大山 1982、中江 1986、蔡ら 1991b、蔡・ 大桃 1995、蔡 2001）。したがって高品質サイレージを調製するための微生物的制御が必要であり、サイレージ 乳酸菌の分離、分類及び機能解析など、有用な菌株の探索や発掘は重要である。本稿は、筆者らの研究成果を中 心として、サイレージ発酵乳酸菌について取りまとめたものである。 2. サイレージ発酵乳酸菌の分離法 (1) 小規模サイレージ発酵試験法 分離用サイレージは小規模発酵試験法により調製することができる。すなわち、供試飼料作物を10 mm 細切 し、これをエチレン，ナイロンおよびビニリデンのストマッカー用積層フィルム（飛竜KN タイプ，180ｘ260 mm， 旭化成，東京）袋内に100 g 入れ，バキュームシーラー（SQ-202，シャープ株式会社，大阪）で脱気して密封す る。これらバッグサイロを実験室内に放置し，経時的に開封して乳酸菌の菌種構成と発酵品質を調査する。
(2) 試料の採取 野外でサンプリングする時、サイレージ試料を採取してから乳酸菌の分離操作に取りかかるまでの経過時間 は短ければ短いほど、サイレージの菌叢の変化が少ないため、運送中は可能な限り、低温に保存する。試料は ポリ袋で100 g 無菌的に採取し、口をひねって結ぶ。試料を運搬する際、出来る限りアイスボックスやクール 宅急便を利用する。 (3) 乳酸菌の分離 サイレージ10 gを取り出してストマッカー用ビニール袋に入れ，滅菌した生理食塩水 90 mlを加えてから激 しく振どうして10 倍希釈液とし，つぎにこの液を 10-8まで希釈して平板培養法で計測する。乳酸菌はGYP白 亜寒天培地（小崎ら1992），MRS寒天培地および酢酸寒天培地（山里ら 1986）などを使用して嫌気培養装置 で30℃下に 2-3 日間培養する（図 1）。これらの培地から分離した菌株はグラム染色，形態観察，カタラーゼ 反応，胞子形成及び乳酸生成試験を行ってから乳酸菌数を計測する。なお，各種微生物の菌数は3 反復で計測 し，新鮮飼料1 g当たりのコロニー形成数（cfu/g）で表示する（蔡 2001b）。 M R S ag ar G Y P -C aC O3 B C P ag ar A cetate ag ar 3 0℃
図 １ ． サ イ レ ー ジ 乳 酸 菌 の 分 離 法
S a m p le S alt solution 飼 料 作 物 サ イ レ ー ジ 嫌 気 ジ ャ ー 2 -3 day s 嫌 気 ボ ク ス 3. サイレージ発酵乳酸菌の保存法 乳酸菌の保存法には、一般の微生物保存と同じように、継体培養保存法、凍結保存法および凍結乾燥保存法 が用いられる。 (1) 継体培養保存法 乳酸菌は通性嫌気微生物であることから、その継体培養は通常、MRS 寒天高層培地を使用する。乳酸菌が 乳酸を生成するので、寒天培地に酸の中和剤として沈降性炭酸カルシウムを添加する場合がある。火炎滅菌し た後冷した白金線の先端で乳酸菌コロニーをひっかける。その白金線を高層培地の中心部を通過させるように して、試験管の底に到達するまで刺す。培養は接種した乳酸菌の至適温度で培養する。穿刺溝に沿った乳酸菌 の生育が確認された時点で、その試験管を5℃の冷蔵庫にいれ低温保管する。この保存状態で 2-3 か月間、生 きながらえさせることができる。2-3 か月たった保存培地は、新鮮培地に接種しなおす必要がある。白金線を 乳酸菌が生育している穿刺溝に刺し込み乳酸菌細胞を拾い、そのまま新鮮な高層培地に穿刺して培養・保存する。(2) 凍結保存法
MRS 寒天培地に生育したコロニーを滅菌棉棒で集め、10％ Dimethyl sulfoxide を入れた NA 液体培地 （Bacto-Beef Extract 3 g + Bacto-Peptone 5 g/ℓ）に懸濁し、-80℃のディープフリーザーに入れて保存する。 なお、凍結保存する際、乳酸菌細胞の入った培地はヌックに0.5 ml 何本か小分けしておく。復元させるときは、 凍結培地を室温程度でゆっくりと解凍させたのち、白金耳でMRS 寒天培地に塗抹して、至適温度で培養する。 (3) 凍結乾燥保存法 乳酸菌菌体を凍結障害阻止に役立つ媒体に懸濁した後、凍結乾燥し、真空に保たれた容器の中で保存する方 法である。この方法には、冷蔵庫、真空乾燥機、アンプルチューブ、アンプル溶封器などの道具が必要である。 微生物の保存、分譲、運送にはよく使われている。凍結乾燥保存方法について詳しくは小崎ら（1992）の「乳 酸菌実験マニュアル」に参照したい。 4. 乳酸菌の同定法
乳酸菌の分類は1985 年まで、Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconosotocの4 属と提案され てきた。そして鈴木（1996）が指摘したとおり、1986 年に Bergey’s Munual of Systematic Bacteriology Vol.2 が出版された直後から、乳酸菌は16S リボソーム RNA の塩基配列に基づく系統分類学的アプローチにより属 レベルの分類体系の再構築が進められた（鈴木1996）。これまで未知の乳酸菌株が分離された時、その菌株が 持つ表現形質を調べ、既に記載されたどの菌種に性状が近いかを推定し，菌種名を決定してきた。しかし、自 然環境から分離される菌株や非定型的な性状を示す菌株については、菌の形態と生理生化学的性状のほか、細 胞壁の成分とDNA の GC 含量など、化学分類学的手法を駆使しても菌種の同定が出来ない場合がある。また、 類似した特徴を持つ菌種名をいくつか選択できても、ひとつの菌種に確定することが困難な場合、分離菌株の 16S rRNA シークエンスの解析や、基準株と分離株との定量的 DNA ハイブリダイゼーションを実施し、菌種 の同定および系統分類を行う必要がある（Ezaki et al.1989、平石 1997、篠田ら 2000)。 (1) 16S rRNA 遺伝子の塩基配列解析 微生物系統進化の研究は、微生物間で普遍的に存在し、同じ機能を持ち、そして長い進化過程で保存されて きた相同な巨大分子の配列を比較分析することによって行われる。細菌系統学的研究のマーカー分子としても っとも適しているものは、16S rRNA 遺伝子である（Schleifer and Ludwing 1989、Woese1987）。この分子 の一次構造には、保存領域や次第に保存の程度が弱くなった領域で配列の違いが見られ、それは異なる系統発 生レベル、つまり進化の種々の段階を反映している。配列の相同性の程度は、進化の過程で蓄積された塩基あ るいはアミノ酸の変異の数に反映される。距離マトリックス解析やparsimony 解析によって、系統樹を構築し、 菌種間の進化関係を反映することができる。 16S rRNAシークエンスに基づく分子系統の研究手順は図 2 に示す。分離株はMRS寒天培地に植菌し、30℃ での培養物を供試菌体とする。N-Acetylmuramidase（生化学工業株式会社、東京）とLysozyme（生化学工 業株式会社）などの酵素処理と界面活性剤で溶菌させ、菌体からゲノムDNAを抽出する。得られたゲノムDNA を 鋳 形 と し て プ ラ イ マ ー27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) と 1492R (5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’)、TaKaRa TaqTMキット（宝酒造株式会社、京都市）およびGeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems, USA)を使用し、PCR法により 16S rDNAの塩基配列約 1500 bpを増幅する。PCR産物はDNA回 収用フィルター付遠心チューブ（SUPRECTM-02、宝酒造株式会社）を用いて精製する。シークエンス反応お
よび産物の精製はBigDye Primer Cycle Sequencing KitとGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA)を使用して、Applied Biosystemsプロトコールに従って行う。DNAシークエンスの解析にはABI PRISMTM 310 Genetic Analyzerを使用する。得られた 16S rDNAの塩基配列はBLAST Homology Search
（Altsuchul et al. 1997）を用いてDNAデータバンク（GemBank/EMBL/DDBJ）に対する照合検索を行う。 分離菌株と近縁基準株との分子系統樹は、CLUSTAL Wプログラム（Thompson et al. 1994）を使って複数の 配列間の進化距離を計算し、近隣結合法（Saitou and Nei 1987）により作成する。
DNA調 製 PCR シ ー ケ ン ス 反 応 塩 基 配 列 解 析 分 子 系 統 樹 作 成 (GenBank/EMBL/DDBJ) 図 図22．．1616S S rRNArRNA遺 伝 子 の 解 析 に よ る 微 生 物 の 同 定 法遺 伝 子 の 解 析 に よ る 微 生 物 の 同 定 法 (2) DNA-DNA ハイブリダイゼーション法による菌種の同定法 微生物の分類学上、独立した菌種には基準株(type strain)が存在し、菌種の分類同定は分離菌株がこの基準株 にどれだけ近いかによって決定される。近年、分子生物学の手法の発達は、細菌トータルDNA の直接比較によ る系統関係の推定及び菌種の同定を可能とし、実際の進化過程に基づいた分類体系の確立が可能となってきた。 現在、菌種間の類似性を証明するもっとも直接的な方法は、トータルDNA のホモロジーに基づく方法（ハイブ リダイゼーション法）である。この分類法はGold Standard of Taxonomy と言われ、細菌の菌種同定および系統 分類に広く用いられている。国際細菌分類命名委員会は，“種 species は 70％あるいはそれ以上の DNA 相同性が ある菌株を含む”という基準を定めている。一方，50％以下の相同性しか示されない菌株は独立した別の種とみ なされる（図3）。
図 3． DNA-DNA相 同 性 試 験 法 と 菌 種 定 義
DNAの 調 製
菌 培 養 、 集 菌 、 溶 菌 、
精 製 、 透 析 、 純 度 測 定
GC含 量 の 測 定
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
DNA固 定 、 Photobiotin標 識
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
蛍 光 強 度 測 定
D N A相 同 性 D N A -D N A h o m o lo g y v al u e 近 縁 種 C losely related independent species 亜 種 Subspecies 種 Species 100% 70% 20% DNA相 同 性 と 菌 種 の 定 義DNA−DNA ハイブリダイゼーションによる菌種同定は Ezaki ら (1989)のマイクロプレート法により実施 する。すなわち、MRS 液体培地で乳酸菌を培養し、12 時間後に収集した菌体から DNA を抽出・精製する。 DNA の固定はまず一本鎖にした基準株の DNA をマイクロプレートに固定し、次に分離株の DNA をフォトビ オチンで標識して一本鎖にしてから、マイクロプレートに分注する。一定時間のDNA ハイブリダイゼーショ ンの後、未反応の標識 DNA を洗浄する。その後 Streptavidin-conjugated enzyme を加え、ビオチンと streptavidin とを結合させる。洗浄後、酵素の基質を加え、二本鎖になった DNA を定量し、種間の DNA 相 同性を算出した。DNA-DNA 相同性試験はマイクロプレート法によって行う。すなわち、MRS 液体培地で乳 酸菌を培養し、12 時間後、菌体を収集して洗浄する。収集した菌体から DNA を抽出し、精製する。DNA の 固定はまず一本鎖にした基準株のDNA をマイクロプレートに固定し、そして分離株の DNA をフォトビオチ ンで標識し、一本鎖にしてから、マイクロプレートに分注する。一定時間のDNA ハイブリダイゼーションの 後、未反応の標識DNA を洗浄する。また、streptavidin-conjugated enzyme を加え、ビオチンと streptavidin とを結合させ、洗浄してから酵素の基質を加え、二本鎖になったDNA を定量し、種間の DNA 相同性を算出 する（Ezaki ら 1989）。
Lactococcus lactis
subsp.lactis（球菌）
Lactobacillus plantarum
（桿菌）
乳酸菌コロニー
（MRS寒天培地）
図4．乳酸菌のコロニーと細胞形態
表 MA 1. MAFFジーンバンクが保存しているサイレージ発酵乳酸菌 FF番号 菌種名 分離源 採取地 採集年 同定者 寄託者 登録時株名 516027 Leuconostoc pseudomesenteroides 飼料イネ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ1 516028 Leuconostoc sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ13 516029 Leuconostoc sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ29 516030 Leuconostoc sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ65 516031 Leuconostoc sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ100516032 Lactococcus lactis subsp. lactis サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ3
516033 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ4
516034 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ15
516035 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ30
516036 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ52
516037 Lactococcus lactis subsp. lactis サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ6
516038 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ16 516039 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ67 516040 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ21 516041 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ23 516042 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ37 516043 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ44 516044 Lactococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ57 516045 Weissella confusa サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ5 516046 Pediococcus acidilactici サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ17 516047 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ36 516048 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ39 516049 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ53 516050 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ70
表 FF番号 菌種名 分離源 採取地 採集年 同定者 寄託者 登録時株名 516051 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ83 516052 Pediococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ85 516053 Lactobacillus brevis サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ66 516054 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ77 516055 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ78 516056 Pediococcus pentosaceus サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ95 516057 Enterococcus faecalis サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ90 516058 Enterococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ92a 516059 Enterococcus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ92b 516060 Lactobacillus rhamnosus サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ22 516061 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ40 516062 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ43 516063 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ69 516064 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ73 516065 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ81 516066 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ87 516067 Lactobacillus plantarum サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ7 516068 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ8 516069 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ48 516070 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ64 516071 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ68 516072 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ80 516073 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ88 516074 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ91 516075 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ94 516076 Lactobacillus sp. サイレージ 栃木県大田原市 1999/11 蔡義民 蔡義民 ＲＯ101
516077 Lactococcus lactis subsp. lactis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ1
516078 Lactococcus lactis subsp. lactis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ2
516079 Lactococcus lactis subsp. lactis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ10
516080 Lactococcus lactis subsp. lactis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ12
516081 Pediococcus acidilactici 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ11 516082 Pediococcus acidilactici 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ24 516083 Pediococcus acidilactici 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ25 516084 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ13 516085 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ15 516086 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ17 516087 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ22 516088 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ26 516089 Lactobacillus plantarum 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ28 516090 Enterococcus faecalis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ16 516091 Enterococcus faecalis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ30 516092 Enterococcus mundtii 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ18 516093 Lactobacillus sakei 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ19 516094 Pediococcus pentosaceus 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ20 516095 Lactobacillus brevis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ21 516096 Lactobacillus brevis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ23 516097 Lactobacillus brevis 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ29 516098 Pediococcus acidilactici 飼料作物 栃木県西那須野町 2000/6 蔡義民 蔡義民 ＡＬ27 516099 Leuconostoc citreum 食品副産物 栃木県西那須野町 2000/2 蔡義民 蔡義民 ＮＪ1 516100 Leuconostoc lactis 食品副産物 栃木県西那須野町 2000/2 蔡義民 蔡義民 ＮＪ2 516101 Lactobacillus casei 食品副産物 栃木県西那須野町 2000/2 蔡義民 蔡義民 ＮＪ3 516102 Lactobacillus ferintoshensis 食品副産物 栃木県西那須野町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＮＪ4 516103 Lactobacillus ferintoshensis 食品副産物 栃木県西那須野町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＮＪ5 516104 Leuconostoc citreum 飼料作物 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ1
516105 Lactococcus lactis subsp. lactis 飼料作物 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ2
MA
表1． MAFFジーンバンクが保存しているサイレージ発酵乳酸菌（続き） 516106 Enterococcus gallinarum 飼料作物 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ3 516107 Leuconostoc citreum サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ4 516108 Lactobacillus plantarum サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ5 516109 Leuconostoc citreum サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ6 516110 Weissella paramensenteroides サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ7 516111 Pediococcus acidilactici サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ9 516112 Leuconostoc citreum サイレージ 熊本県西合志町 2000/9 蔡義民 蔡義民 ＧＵ10
516113 Lactobacillus casei トウモロコシ 栃木県西那須野町 2001/9 蔡義民 蔡義民 CO70
516114 Lactobacillus casei トウモロコシ 栃木県西那須野町 2001/9 蔡義民 蔡義民 CO71
516115 Lactobacillus casei トウモロコシ 栃木県西那須野町 2001/9 蔡義民 蔡義民 CO73
516116 Leuconostoc pseudomesenteroides トウモロコシ 栃木県西那須野町 2001/9 蔡義民 蔡義民 CO74
Groups E F G H Number of strains Representative strain Shape Gram stain Fermentation type Catalase Glycerol A B C D I J Erythritol D-Arabinose L-Arabinose Ribose D-Xylose L-Xylose Adonitol Methyl-xyloside Galactose D-Glucose D-Fructose D-Mannose L-Sorbose Rhamnose Dulcitol Inositol Mannitol Sorbitol Methyl-D-mannoside Methyl-D-glucoside N acetyl glucosamine Amygdaline Arbutine Esculine Salicine Cellobiose Maltose Lactose Melibiose Saccharose Trehalose Inulin Melezitose D-Raffinose Starch Glycogene Xylitol Gentiobiose D-Turanose D-Lyxose D-Tagatose D-Fucose L-Fucose D-Arabitol L-Arabitol Gluconate 2 ceto-gluconate 14 21 4 18 11 32 39 4 11 7 6
Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Rods Rods Rods Rods
Homo Homo Homo Homo Homo Hetero Homo Hetero Hetero Hetero RO RO3 RO95 RO17 RO90 RO1 RO7 RO5 RO66 RO97
+ + + + + + + + + + − − + − − − − − − − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − + − + + − + + + + + + + + + + + + + + + + + + − − + − + + + − − − − − − − − − − − − − − + − + + + + + + + − + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − + + − − + − + − − − − − − − + − + − − − − − − − − − + − − − − − − − − + − − + + + + + + + + + + − + + + + + + − + + − − + + + + + + + + − − + + + + + + + + − + + + + + + + + + − − + + + + + + + + − − − + + + + + + + + − − + − + − − − − − − − − + + − + − + + − − + + + + − − + + + − + + + − − − − − − − − − − + − + − − − − − − − − + + − − − − − − − − − − − − − − − − + + + + + + − − − − − − − − + + − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − + + + + + + + + + + − − − − − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − β α α β w w w w w w w w w w w w w w w
TABLE 1. Phenotypic characteristics of lactic acid bacteria isolated from paddy rice silagea
a
+, positive; , negative; w, weakly positive; Homo, homofermentative; Hetero, heterofermentative.−
5. MAFF ジーンバンクが保存しているサイレージ発酵乳酸菌の特性 MRS（Difco）等の寒天培地を用いて飼料作物やサイレージなどから多種多様な乳酸菌を分離した（図４、 表１）。これら乳酸菌の生理・生化学性状試験、16S rRNA 遺伝子シークエンスの解析と DNA-DNA 相同性試 験により、菌種の同定を行った。同定結果の一部は表2 に示したように、それら分離株の表現形質から 10 菌 群（A-J group）に分けられた。分離菌株はすべてグラム陽性、タカラーゼ陰性で多量の乳酸を生成する乳酸 菌であった。RO3、RO6、RO95、RO17 および RO90 菌株はグルコースからガスを産生しないホモ発酵型で、 主にL(+)乳酸異性体を生産する乳酸球菌であったが、RO1 と RO5 菌株はグルコースからガスを産生するヘテ ロ発酵型で、主にD(-)型乳酸異性体を生成する乳酸球菌であった。一方、RO7 菌株はホモ発酵型で、DL 型乳 酸異性体を生成する乳酸桿菌であったが、RO66 と RO97 はヘテロ発酵型で DL 型乳酸異性体を生成する乳酸 菌であった。各菌群の代表株について全領域の16S rRNA シークエンスを決定し、他菌種の分子系統位置と比 較したところ、これら菌群の代表株ではRO1 がLeuconostoc属, RO3 と RO6 がLactococcus属、RO17 と RO95 がPediococcus属、RO90 が Enterococcus属、RO7、RO66 と RO97 がLactobacillus属、RO5 がWeissella 属のクラスターにあった（図5，図 6）。
s e
t e
c
aracteristic Lactococcus lacti
分離菌株の DNAG+C 含量と DNA-DNA 相同性は表 3 に示した。これら分離菌株の DNA G+C 含量は 36.9-48.5％の範囲であった。DNA-DNA 相同性試験の結果、これらの分離株はそれぞれの基準株との間に 85％ 以上のDNA-DNA 相同性を示した。このため、RO1 はLeuconostoc p eudomesenteroid s, RO3 と RO6 は Lactococcus lactis subsp. lac is、RO17 はPediococcus pentosaceus、RO95 はPediococcusp ntosaceus、RO90 は Enterococcus faecalis、RO7 はLactobacillus plantarum、RO66 と RO97 はLactobacillus brevis、RO5 はWeissella kimchiiとそれぞれ同定された。これらの菌の生理的性質およびサイレージの調製適性試験を行 い、発酵品質を評価した。乳酸菌のうち、Leu onostoc属と Weissella属の菌株は、ヘテロ発酵型および主に D(−)乳酸を生成する球菌であったため、添加サイレージの D(-)乳酸生成比率、ガス生成量および乾物損失率を 増大させた（Cai et al. 1998）。一方、Pediococcus acidilacticiとLactobacillus plantarumは耐酸性が強く、 低pH 条件下でよく生育し、MRS 液体培地で培養した場合、多量の乳酸を生成し､培養液の最終 pH を 3.6 ま で低下させた。両菌株の添加によって、サイレージ発酵初期に旺盛に増殖し、好気性細菌および酪酸菌の増殖 を抑えた。また添加サイレージはpH 値、酪酸およびアンモニア態窒素含量が低く、乳酸含量が高く、かつガ ス生成量と乾物損失率が減少し、高品質であった。とくにPediococcus acidilacticiは50℃まで生育できるた め、高温（48℃）条件下で貯蔵したサイレージでは、市販乳酸菌に比べてより高品質で調製された（Cai et al. 1999c、蔡 2001a、2002）。このように、飼料作物には多種多様な乳酸菌が分布しており、その中には優れた機 能を示す菌株が存在していた。これらの結果は、乳酸菌の分類とサイレージの発酵機能の探索について興味深 い示唆を与えている。 乳酸菌は有史以来、今日まで人類に多大な恩恵を与え続けている安全性の高い菌群である（森地 1999、富田 2000）。近年、動物腸管に定着した乳酸菌によるプロバイオティクス効果が取り上げられ、乳酸菌による動物の 整腸効果および家畜生産性向上への応用について注目を浴びている（Tannock 1999）。畜産の分野でも先端的な 視点から乳酸菌の役割を見つめることにより、未知乳酸菌の探索や潜在している機能の発掘が期待されている。 表3. 分離菌株のDNAG+C含量および分離菌株と基準株間のDNA−DNA相同性 s
subsp. lactis RO6
Lactococcus lactis subsp. lactis RO3
Pediococcus pentosaceus RO95 Pediococcus acidilactici RO17 Enterococcus faecalis RO90 Ch DNAG+C含量(%) 38.0 36.9 39.3 44.4 39.2 離株と基準株間の -DN 分 DNA A相同性(%) 95.5 88.6 85.5 98.2 85.0
aracteristic Leuconostoc pseudo
Ch -mensenteroides RO1 Lactobacillus plantarum RO7 Weissella confusa RO5 Lactobacillus brevis RO66 Lactobacillus brevis RO97 AG+C含量(%) 40.8 45.5 48.5 48.0 46.1 離株と基準株間の -DN DN 分 DNA A相同性(%) 90.5 81.6 93.8 87.7 85.9
L. piscium L. plantarum L. raffinolactis RO90 RO17 P. acidilactici RO95 P. pentosaceus P. damnosus P. inopinatus P. parvulus P. dextrinicus P. urinaeequi RO3 RO6
L. lactis subsp. lactis L. lactis subsp. cremoris
L. garvieae 0.02 nuc K E. sulfureus E. solitarius E. columbae E. cecorum E. saccharolyticus E. gallinarum E. flavescens E. casseliflavus E. dispar E. asini E. hirae E. villorum E. mundtii E. pseudoavium E. faecium E. durans E. malodoratus E. raffinosus E. avium E. moraviensis E. haemoperoxidus E. faecalis B. subtilis RO1 Le. pseudomesenteroides Le. gelidum
Le. mesenteroides subsp. cremoris Le. mesenteroides subsp. mesenteroides Le. mesenteroides subsp. dextranicum
Le. argentinum Le. citreum Le. lactis Le. carnosum Le. gasicomitatum Le. fallax O. Oeni 94 99 100 87 52 95 37 63 97 99 100 95 100 100 100 100 98 100 100 100 99 83 66 37 51 75 100 56 59 85 87 86 82 100 100 97 100 100 100 100 96 18 97 31 10 44 48 87 78 NCDO 617 (T X54261) NCDO 1869 (T X54259) ATCC 700018 (T X53905) JCM 8735 (T AB012306) ATCC 19257 (T M58836) ATCC 19435 (T M58837) This study (AF515224) This study (AF515225) IFO 12173 (T D87677) JCM 5887 (T D87679) JCM 5889 (T D88528) DSM 20285 (T AJ271383) DSM 20331 (T AJ318414) DSM 20336 (T AJ305321) DSM 20284 (T AJ305320) This study (AF515227) This study (AF515229) JCM 6125 (M35820T ) DSM 20189 (T S63851) LMG 18811 (T AF231131) NRIC 1722 (T AB022925) JCM 6123 (T AB023968) NRIC 1776 (T AB022923) DSM 8581 (T AF175403) NRIC 1539 (T AB023246) DSM 20343 (T M23035) DSM 20346 (T M23034) NRIC 1778 (T AB022921) NRIC 1777 (T AB023237) This study (AF515228) LMG 13084 (T AJ301841) DSM 5634 (T AJ301840) LMG 11740 (T AJ301828) LMG 12902 (T AJ301827) LMG 11427 (T AJ301839) LMG 13129 (T AJ301833) LMG 13518 (T AJ301832) LMG 10745 (T AJ301826) LMG 13521 (T AJ301829) ATCC 700915 (T Y11621) LMG 6399 (T AJ301834) LMG 12287 (T AJ271329) LMG 10748 (T AJ301836) LMG 11426 (T AJ301837) LMG 11423 (T AJ301830) DSM 20633 (T AJ276354) LMG 10747 (T AJ301835) NCIMB 12901 (T Y18296) LMG 10744 (T AJ301825) LMG 19486 (T AF286831) LMG 19487 (T AF286832) LMG 7937 (T AJ301831) NCDO 1769 (T X60646) This study (AF515223) 図5．サイレージから分離されたLeuconostoc、Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus属菌種と 関連乳酸菌の１６S ｒRNA分子系統樹（Knucで求めた進化距離をNJ法で作成）
B. subtilis R 7O L. pentosus L. plantarum L. paraplantarum L. arizonensis L. collinoides L. alimentarius L. farciminis L. kimchii L. paralimentarius L. curvatus L. sakei subsp. sakei
L. fructivorans L. lindneri L. sanfranciscensis L. kunkeei L. acidipiscis L. cypricasei L. aviarius subsp. araffinosus L. aviarius subsp. aviarius L. salivarius subsp. saliciniusL. salivarius subsp. salivarius L. agilis L. ruminis L. animalis L. mali L. nagelii L. algidus L. perolens P. selangorensis L. bifermentans L. coryniformis L. casei L. zeae L. rhamnosus L. manihotivorans L. murinus L. sharpeae L. acetotolerans L. acidophilus L. gallinarum L. helveticus L. amylolyticus L. hamsteri L. intestinalis
L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. delbrueckii subsp. delbrueckii L. delbrueckii subsp. lactis L. fornicalis L. jensenii L. psittaci L. gasseri L. johnsonii L. iners L. coleohominis L. frumenti L. oris L. panis L. reuteri L. mucosae L. amylophilus L. amylovorus L. crispatus L. vaginalis L. pontis 0.01 nuc K RO5 W. soli W. confusa W. cibaria W. hellenica W. paramesenteroides W. thailandensis W. kandleri W. halotolerans W. viridescens L. fructosus W. kimchii L. brevis L. buchneriL. parakefiri L. parabuchneri L. kefiri L. hilgardii R 97O R 66O 94 61 93 100 68 100 100 100 33 22 43 99 93 65 95 38 100 100 64 40 62 82 4 11 84 61 80 18 91 93 59 100 100 100 100 100 98 69 87 46 66 90 92 100 74 33 99 100 100 100 100 100 100 100 100 94 86 94 93 70 61 49 44 91 90 100 100 100 100 100 100 68 94 71 61 58 74 83 68 47 76 58 100 100 100 100 DSM 20249 (T M58804) ATCC 29644 (T M58817) JCM 10707 (T AF183558) DSM 13238 (T AJ417500) DSM 20010 (TAJ270951) DSM 20017 (TM58829) DSM 20203 (T X76330) DSM 20690 (T X95421) ATCC 27651 (TM58830) ATCC 700308 (T Y11374) DSM 20509 (T M58803) JCM 10991 (T AB048833) DSM 20403 (T M58828) DSM 20602 (T M58807) DSM 20444 (T M58824) ATCC 700692 (T Y17500) JCM 10491 T(AB033209) DSM 12744 (T Y19167) LMG 17710 (T AF049745) DSM 20003 (T M58809) DSM 20001 (T M58813) ATCC 334 (T D86517) ATCC 15820 (T D86516) ATCC 7469 (T M58815) LMG 18010 (T AF000162) DSM 20452 (T M58826) DSM 20505 (T M58831) JCM 10692 T (AB023836) CCUG 42961 (TAJ251560) JCM 5667 (AB001837)T DSM 20655 (T M58808) DSM 20554 (T M59054) ATCC 11741 (T AF089108) ATCC 700934 (T Y18654) ATCC 25258 (T AF243176) CCUG 42378 (T AJ272391) DSM 20243 (T M58820) ATCC 33200 (T AJ002515) CCUG 28746 (T Y16329) CCUG 44007 (T AJ292530) DSM 13145 (T AJ250074) DSM 4864 (T X94229) DSM 6035 (T X94230) DSM 20016 (T L23507) DSM 13345 (T AF126738) DSM 20533 (T M58806) NCTC 12197 (T X61136) ATCC 51518 (T X76329) DSM 20749 (TM58801) ATCC 4356 (T M58802) ATCC 33199 (T AJ242968) NCDO 2712 (T X61141) DSM 11664 (T Y17361) DSM 5661 (T AJ306298) DSM 6629 (T AJ306299) JCM 1002 (T AB007908) ATCC 9649 (T M58814) ATCC 12315 (T M58823) DSM 20531 (TM58805) DSM 20584 (T Y17362) NCDO 2345 (T X61140) NCDO 1769 (T X60646) This study (AF515221) DSM 14420 (T AY028260) JCM 1093 (T M23036) LMG 17699 (T AJ295989) NCFB 2973 (T X95981) NCFB 803 T (AB023238) JCM 10695 (T AB023838) DSM 20593 (T M23038) DSM 20190 (T M23037) DSM 20410 (T M23040) DSM 14295 (TAF312874) This study (AF515222) JCM 1558 (T D79211) JCM 1149 (T D79210) DSM 10667 (T AJ306297) JCM 11125 (T AF093757) ATCC 27612 (T AB005893) ATCC 14869 (T M58810) DSM 20057 (T M58811) LMG 15133 (T AY026750) LMG 11457 (T AY026751) NRIC 1693 T(AB024300) DSM 20176 (T M58821) This study (AF515219) This study (AF515220) 図6．サイレージから分離されたLactobacillus属とWeissella属菌種と関連乳酸菌の１６S ｒRNA分子系統樹 （Knucで求めた進化距離をNJ法で作成）
c r t s c c se 6. 引用文献
Altschul, S.F., T.F. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, W. Miller and D.J. Lipman (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic A ids Res. 25: 3389-3402. 蔡義民 (1996) サイレージ乳酸菌の分類と生態 (理研シンポジウム). 乳酸菌の分類と生態. 和光. pp. 29-32. Cai, Y. (1999) Identification and characterization of Enterococcus species isolated from forage crops and their
influence on silage fermentation. J. Dai y Sci. 82: 2466-2471.
蔡義民 (2001a) サイレージ乳酸菌の役割と高品質化調製. 日本草地学会誌 47: 527-533.
蔡義民 (2001b) サイレージの分析法。改訂粗飼料の品質評価ガイドブック（自給飼料品質評価研究会編）.日本 草地種子協会. 東京. pp. 25-35.
蔡義民 (2002) サイレージ発酵の微生物的制御. 土と微生物 56: 75-83.
Cai, Y. and S. Kumai (1994) The proportion of lactate isomers in farm silage and the influence of inoculation with lactic acid bacteria on the proportion of L-lactate in silage. Jan. J. Zoo ech.l Sci. 65: 14-21.
Cai Y., H. Okada, H. Mori, Y. Benno and T. Nakase. (1999a) Lactobacillu paraalimentarius sp. nov. isolated from sourdough. International Journal of Systematic Bacteriology 49: 1451-1455.
蔡 義民 ・熊井清雄・福見良平 (1991a) 標高と季節の差異が飼料作物・牧草に付着する微生物、とくに乳酸菌数 に及ぼす影響. 日草誌 37: 247-253. 蔡 義民 ・熊井清雄・福見良平 (1991b) 乳酸菌添加が各種サイレージの乾物回収率、乳酸異性体産生比率および 飼料価値に及ぼす影響. 日草誌 37: 428-434. 蔡 義民 ・大桃定洋 (1995) 乳酸菌とセルラーゼ添加がサイレージ発酵過程における微生物相、ガス生成量及び 乾物損失率に及ぼす影響. 日畜会報 66: 941-948. 蔡 義民 ・大桃定洋・熊井清雄 (1994) 飼料作物に付着する乳酸菌の分布とその乳酸発酵特性. 日草誌 39: 420-428.
Cai, Y., S. Kumai, J. Zhang and Y. Benno (1999b) Comparative studies of lactobacilli and enterococci associated with forage crops as silage inoculants. Anim. Sci. J. 70: 188-194.
Cai, Y., S. Kumai, M. Ogawa, Y. Benno and T. Nakase (1999c) Characterization and Identification of Pedio occus species isolated from forage crops and their application for silage preparation. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2901-2906.
Cai, Y., Y. Benno, M. Ogawa and S. Kumai (1999d) Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics and aerobic deterioration of silage. J. Dairy Sci. 82: 520-526.
Cai, Y., Y. Benno, M. Ogawa, S. Ohmomo, S. Kumai and T. Nakase (1998) Influence of Lactoba illus spp. from an inoculant and of Weis lla and Leuconostoc spp. from forage crops on silage fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2982-2987.
Ennahar, S., Y. Cai and Y. Fujita (2003) Phylogenetic Diversity of Lactic Acid Bacteria Associated with Paddy Rice Silage as Determined by 16S Ribosomal DNA Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 69: 444-451.
Ezaki, T., Y. Hashimoto and E. Yabuuchi (1989) Fluorometric deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization in microdilution wells as an alternative to membrane filter hybridization in which radioisotopes are used to determine genetic relatedness among bacteria strains. International Journal of Systematic Bacteriology 39: 224-229.
平石明 (1997) PCR を利用した 16S rRNA 遺伝子の解析と系統研究-追補版-，日本微生物生態学会報 12: 19-26. McDonald P., N. Henderson and S. Heron (1991) The Biochemistry of Silage. 2nd ed. Chalcombe
Publications. Berkshire. pp.11-162.
森地敏樹 (1973) 畜産における乳酸菌. 日畜会報 44: 535-553.
森地敏樹 (1999) 乳酸菌利用技術の発達と今後の展望. 乳酸菌学会誌 9: 69-81.
森地敏樹・大山嘉信（1982）サイレージにおける微生物の動態. 土と微生物 24: 7-15. 中江利孝 (1986) 畜産における乳酸菌の利用：最近の動向. 日畜会報 57: 279-287.
Ohmomo, S., O. Tanaka, H. Kitamoto and Y. Cai (2002) Silage and microbial performance, old story but new problems. Japan Agricultural Research Quarterly 36: 59-71.
小崎道雄・内村泰・岡田早苗 (1992) 乳酸菌実験マニュアル. 朝倉書店. 東京. pp. 34-64. 大山嘉信 (1971) サイレージ発酵に関連する諸問題. 日畜会報 42: 301-317.
o
c s
Saitou, N. and M. Nei (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Bi l.Evol. 4: 406-425.
Schleifer, K.H. and W. Ludwing (1989) Phylogenetic relationships among bacteria. In: The Hierarchy of life. Fernholm B, Bremer K, Jprnwall (Eds.), Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam. pp. 103-117.
篠田吉史・加藤暢夫・森田直樹 (2000) 16S rRNA 遺伝子解析による細菌の系統分類法. 島津評論 57: 121-132. 鈴木健一郎 (1996) 乳酸菌の分類体系と分子系統 (乳酸菌研究集談会編). 乳酸菌の科学と技術. 学会出版センタ
ー. pp. 24-26.
Tannock, G.W. (1999) Probiotics -A Critical Review. Horizon Scientific Press, Norfolk, pp.1-4.
Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic A id Re . 22: 4673-4680.
富田房男 (2000) 乳酸菌のニューバイオテクノロジー：乳酸菌研究の動向。HEALTH DIGEST 15: 1-8. Woese C. R.(1987) Bacterial Evolution. Microbiol. Rev. 51: 221-222.
山里一英・宇田川俊一・児玉徹・森地敏樹 (1986) 微生物の分離法. R and D プランニング. 東京. pp. 435-444. Zhang, J., Y. Cai, R. Kobayashi and S. Kumai (2000) Characteristics of lactic acid bacteria isolated from
forage crops and their effects on silage fermentation. J. Sci. Food Agric. 80: 1455-1460.
生 物 研 資 料 平成16 年 1 月 January, 2004 微生物遺伝資源利用マニュアル （15） 2004 年 1 月 24 日 印刷 2004 年 1 月 31 日 発行 発行者 編集兼 独立行政法人農業生物資源研究所
National Institute of Agrobiological Sciences 〒305-8602 茨城県つくば市観音台 2-1-2
