池田, 次郎

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

骨髄系細胞におけるPhd2の欠損は高血圧性心血管リ モデリングを抑制する

池田, 次郎

http://hdl.handle.net/2324/1398332

出版情報：Kyushu University, 2013, 博士（医学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：Public access to the fulltext file is restricted for unavoidable reason (2)

氏 名 ： 池 田 次 郎

論 文 題 名 ：Delection of Phd2 in Myeloid Lineage Attenuates Hypertensive Cardiovascular Remodeling

（ 骨 髄 系 細 胞 に お け る Phd2の 欠 損 は 高 血 圧 性 心 血 管 リ モ デ リ ン グ を 抑 制 す る ）

区 分： 甲

論 文 内 容 の 要 旨

【 緒 言 】

高 血 圧 は 細 胞 肥 大 と 線 維 化 な ど の 心 血 管 リ モ デ リ ン グ を 誘 導 す る 。 一 般 的 に レ ニ ン － ア ン ジ オ テ ン シ ン 系（RAS）の 活 性 化 と 一 酸 化 窒 素（NO）レ ベ ル の 低 下 が こ の 課 程 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 。 高 血 圧 は ま た 心 血 管 系 の 炎 症 を 誘 導 し 、 浸 潤 し た マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど の 炎 症 細 胞 は 心 血 管 リ モ デ リ ン グ に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す 。 マ ク ロ フ ァ ー ジ は 線 維 化 の 病 理 学 的 機 序 に も 関 与 し 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 由 来 の Transforming growth factor-β(TGF-β)は 線 維 芽 細 胞 か ら 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス の 蓄 積 を 制 御 す る 筋 線 維 芽 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 す る 。 ま た 筋 線 維 芽 細 胞 に お い て 膠 原 線 維 の 合 成 を 誘 導 す る 。

hypoxia inducible factor（HIF） は 低 酸 素 に 対 す る 細 胞 応 答 を 制 御 す る 重 要 な 転 写 因 子 で あ る 。HIF は 酸 素 感 受 性 の α サ ブ ユ ニ ッ ト と 恒 常 的 に 発 現 し て い る β サ ブ ユ ニ ッ ト か ら 構 成 さ れ る 。 通 常 酸 素 濃 度 下 で は prolyl hydroxylase domain protein（PHD） が HIF-α の プ ロ リ ン 残 基 を 水 酸 化 し 、 ユ ビ キ チ ン 化 と プ ロ テ ア ソ ー ム 分 解 を 誘 導 す る 。 低 酸 素 状 況 下 で は PHD 活 性 は 阻 害 さ れ 、HIF-α は 安 定 化 し 格 へ 蓄 積 す る 。HIF-α と 、HIF-β は ヘ テ ロ 二 量 体 を 形 成 し て 、血 管 形 成 、造 血 、代 謝 を 調 整 す る 標 的 遺 伝 子 の 発 現 を 活 性 化 す る 。 我 々 は マ ク ロ フ ァ ー ジ に お い てPHDの 薬 理 学 的 阻 害 ま た はPHD2の ノ ッ ク ダ ウ ン が リ ポ 多 糖 類 （LPS） に よ る TNF-α の 発 現 誘 導 を 抑 制 す る こ と を 示 し た 。 こ れ ら の 研 究 に 基 づ い て 私 は 骨 髄 系 細 胞 特 異 的 な Phd2 の 欠 損 が 高 血 圧 性 心 血 管 リ モ デ リ ン グ に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た 。

【 方 法 】

骨 髄 特 異 的 Phd2 欠 損 マ ウ ス（MyPHD2KO）は 、Creリ コ ン ビ ナ ー ゼ の 発 現 が リ ゾ チ ー ム M（LysM） 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー に よ り 誘 導 さ れ る LysM-Cre マ ウ ス と ヘ テ ロ 接 合 体 の Phd2-floxed マ ウ ス（Phd2f/+）を 交 配 さ せ る こ と に よ っ て 得 ら れ た 。8～10 週 齢 の マ ウ ス に 0.9%NaCl 中 に 溶 解 し た L-NAME を 14 日 間 経 口 投 与 し た ｡後 半 の 7 日 間 浸 透 圧 ミ ニ ポ ン プ に て ア ン ジ オ テ ン シ ン （Ang） Ⅱ を 皮 下 投 与 し た 。 ジ ゴ キ シ ン は L-NAME の 投 与 開 始 の 7 日 前 よ り 1 日 お き に 腹 腔 内 注 射 し た 。 心 拍 数 （HR） と 収 縮 期 血 圧 （SBP） は 、 非 麻 酔 下 マ ウ ス に お け る テ ー ル カ フ 法 に て 測 定 し た 。経 胸 壁 心 エ コ ー 検 査 は 1.5％ イ ソ フ ル ラ ン に よ る 麻 酔 下 に 行 っ た 。3％ チ オ グ リ コ レ ー ト を 腹 腔 内 注 射 し て 得 ら れ た 腹 腔 内 マ ク ロ フ ァ ー ジ(PM)と 大 腿 骨 と 脛 骨 か ら 単 離 し た 骨 髄 由 来 マ ク ロ フ ァ ー ジ（BMDM）を 使 用 し た 。大 動 脈 お よ び 心 臓 の 凍 結 切 片 は そ れ ぞ れ シ リ ウ ス レ ッ ド 溶 液 、 マ ッ ソ ン ト リ ク ロ ー ム 溶 液 で

染 色 し た 。心 筋 細 胞 の 断 面 領 域 を 測 定 す る 際 に は コ ム ギ 胚 芽 ア グ ル チ ニ ン-Alexa Fluor488 色 素 で 染 色 し た 。Mac-2 免 疫 組 織 科 学 染 色 に は パ ラ フ ィ ン 包 埋 組 織 切 片 を 用 い た 。 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、大 動 脈 と 心 臓 組 織 に お け る 遺 伝 子 発 現 は 、リ ア ル タ イ ム RT-qPCR に て 評 価 し た 。 走 化 性 分 析 に は PM を 用 い た 。NF-κB の 転 写 活 性 は PM を 用 い ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に て 評 価 し た 。LPS（100ng/ml）に よ る 刺 激 後 、細 胞 を 溶 解 し ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 を 測 定 し 、 タ ン パ ク 質 濃 度 に よ っ て 標 準 化 し た 。

【 結 果 】

Phd2 を 欠 損 し た PM で は 、Tnfa、I16、Il1b、Rantes、Mcpl、iNOS な ど の M1 マ ク ロ フ ァ ー ジ マ ー カ ー 、Pdgfb、Tgfbと Ctgf な ど の 線 維 化 促 進 因 子 の 発 現 が 有 意 に 減 少 し た 。M2 マ ク ロ フ ァ ー ジ マ ー カ ー の 発 現 に は 一 貫 し た 傾 向 は な か っ た 。MyPHD2KO マ ウ ス の PM の NF-kB 活 性 は 統 計 学 的 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た が 、ベ ー ス ラ イ ン お よ び LPS 刺 激 後 と も に コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の そ れ よ り 低 か っ た 。Phd2 を 欠 損 し た PM で は MCP-1 に よ る 細 胞 遊 走 が 低 下 し て い た 。L-NAME/Ang II 負 荷 に よ り 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス お よ び MyPHD2KO マ ウ ス に お い て 収 縮 期 血 圧 は 同 等 に 上 昇 し た が 、MyPHD2KO マ ウ ス に お い て 大 動 脈 中 膜 お よ び 外 膜 肥 厚 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 が 抑 制 さ れ た 。 ま た 、 心 筋 間 質 の 線 維 化 お よ び 心 筋 細 胞 の 肥 大,マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 も MyPHD2KO マ ウ ス で 有 意 に 抑 制 さ れ た 。炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 、線 維 化 関 連 因 子 の 発 現 は 、MyPHD2KO マ ウ ス の 大 動 脈 と 心 臓 で 減 少 し て い た 。コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス で は L-NAME/Ang II負 荷 に よ る 左 室 肥 大 と 駆 出 率 の 減 少 が 心 エ コ ー 法 に よ り 観 察 さ れ た が MyPHD2KOマ ウ ス で は 観 察 さ れ な か っ た 。 L-NAME/Ang II 負 荷 を 行 っ た MyPHD2KO マ ウ ス に HIF-α の 合 成 を 阻 害 す る ジ ゴ キ シ ン を 投 与 す る と 抑 制 さ れ て い た 線 維 化 関 連 因 子 の 発 現 誘 導 、 左 室 肥 大 が 生 じ た 。 ま た 駆 出 率 が 低 下 し た 。

【 考 察 】

本 研 究 に お い て 、 私 は 骨 髄 系 細 胞 の Phd2欠 損 が L-NAME/Ang IIに よ り 誘 導 さ れ る 細 胞 の 肥 大 や 線 維 化 を 含 む 心 血 管 リ モ デ リ ン グ を 抑 制 す る こ と を 示 し た 。MyPHD2KO マ ウ ス で はL-NAME/Ang II負 荷 に よ る 心 臓 や 大 動 脈 外 膜 へ の マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 が 抑 制 さ れ た 。MyPHD2KO マ ウ ス の 抗 肥 大 お よ び 抗 線 維 化 効 果 の 詳 細 な 機 序 は 不 明 で あ る が 、マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る TGF-β の 発 現 減 少 が 一 役 を 担 っ て い る 可 能 性 が あ る 。ジ ゴ キ シ ン の 併 用 投 与 を 行 っ た 群 で は 、MyPHD2KO マ ウ ス で 抑 制 さ れ て い た 心 臓 お よ び 大 動 脈 の 肥 大 と 線 維 化 は 元 に 戻 っ た が 、 サ イ ト カ イ ン の 発 現 は 増 加 し な か っ た 。 以 上 か ら 線 維 化 促 進 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 は HIF に 依 存 し 、サ イ ト カ イ ン の 発 現 は HIF に 依 存 し て い な い 可 能 性 が あ る 。NF-kB の 活 性 は 対 照 群 と 比 較 し MyPHD2KO マ ウ ス の PM で 減 少 傾 向 が み ら れ 、 HIF 経 路 と 独 立 し て NF-kB の 転 写 活 性 の 抑 制 が 炎 症 促 進 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 の 抑 制 に 関 し て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る か も し れ な い 。 近 年 HIF-α に 加 え て Sprouty-2 や β -arrestin な ど 新 し い PHD 基 質 が 同 定 さ れ て い る が 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と MyPHD2KO マ ウ ス の 腹 腔 内 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る こ れ ら の 発 現 レ ベ ル を 調 べ た が 変 化 は み ら れ ず 、PHD2 に よ る 遺 伝 子 制 御 を 明 ら か に す る た め に は さ ら な る 研 究 が 必 要 で あ る 。 私 は 骨 髄 系 細 胞 の PHD2 が 高 血 圧 に よ っ て 誘 導 さ れ る 肥 大 と 線 維 化 に お い て 重 要 な 役 割 を と い う 確 証 的 な 証 拠 を 示 し た 。PHD の 阻 害 が 心 血 管 疾 患 の 新 し い 薬 物 療 法 と な る 可 能 性 が あ る 。