2005 年１月 31 日 受理 1) 石川県農業総合研究センター生産環境部農産加工科 2) 石川県南加賀農林総合事務所 3) 大阪府立大学大学院農学生命科学研究科 4) 石川県農業短期大学食品科学科
研究ノート
金 時 草 色 素 粉 末 の 食 品 化 学 的 特 性
林 美央
１ ）・太田 礼子
２ ）・三輪 章志
１ ）・竹中 重雄
３ ）・榎本 俊樹
４ ）Food Chemical Properties of Kinjisou Coloring Matter and The Structure of Anthocyanin．
Mio HAYASHI
１ ）, Reiko OTA
２ ）, Syouji MIWA
１ ）Sigeo TAKENAKA
３ ）, Toshiki ENOMOTO
４ ）Summary
This study was pursued to elucidate the food chemical properties of the Kinjisou
coloring matter. The heat resistant and the light stability of the coloring matter was higher
than those of other commercial red coloring matters from edible plants, and similar to the
coloring matter from purple sweet potatoes. The Kinjisou coloring matter was freely
soluble in hot water or 50% ethanol but slightly soluble in cold water and insoluble in
100% ethanol, methanol, acetone or dimethyl sulfoxide (DMSO).The anthocyanin in
Kinjisou was isolated and identified by column chromatographies, and FT/MS/MS.
Prepared Kinjisou coloring matter powder contained about 1.4% anthocyanin, and it was
suggested
that
theanthocyanin
is
Rubrocinerarin(3-O-(6-O-malon yl-
β
-D-glucopyranosyl)-7-O-(6-O-(4-O-(6-O-caffeyl-
β
-D-glucopyranosyl)caffeyl)-
β
-D-glucopyranosyl-3'-O-(6-O-caffeyl-β-D-glucopyranosyl)cyanidin).
Ⅰ 緒 言
金時草の色素を新規の食品、着色料、食品添加物 や染料として利用するためには、原料素材の食品化 学的特性を明確にしておくことが不可欠である。そ こで、金時草より得られる赤紫色素粉末について、 一般成分分析、耐熱性、耐光性、pH の違いによる色 調、溶媒溶解性を調べた。また、金時草の特徴であ る赤紫色素成分の精製と成分の同定を行ったので報 告する。Ⅱ 実験方法
１．色素の抽出および粉末調整法 石川県内で栽培された金時草（Gynura bicolor DC.）地上部を用いた。金時草地上部の茎部分を除き、 葉部分 50g に対して 500ml の熱水を用い、100℃で 30 分抽出した。得られた抽出液を噴霧乾燥機（大河 原工業社製 L-８型）で粉末試料に調整した。金時 草 50g より約 1g の粉末試料が得られた。 ２．金時草抽出液粉末の一般成分分析 金時草抽出液粉末の一般成分は５訂日本食品標準 成分表の成分測定法に基づき，水分は常圧加熱乾燥 法、タンパク質はケルダール法、脂質はソックスレ ー抽出法、灰分は直接灰化法、炭水化物は水分、タ ンパク質、脂質、および灰分を 100 より減じて求め る減算法により求めた。３．耐熱性 金時草抽出液粉末を McIlvaine buffer(pH3.0)に 530nm における吸光度が 0.8∼1.0 になるように溶か し、0.45μm ﾒﾝﾌﾞﾗﾝﾌｨﾙﾀｰでろ過した。この溶液 5ml を 12ml 容ネジ蓋付きガラス試験管に入れ密栓して、 沸騰湯浴中に置き、30、60、120 分ごとにサンプル を取り出し冷却後、530nm の吸光度を測定した。加 熱前の吸光度を 100 として、加熱後の色素残存率を 計算した。比較として、市販赤色系色素（赤キャベ ツ色素、紫コーン色素、赤ダイコン色素、シソ色素、 紫イモ色素）についても同様に検討した。 ４．耐光性 耐熱性試験と同一に調製した溶液を蓋付きガラス シャーレ（φ4cm×深さ 2cm）に入れ、光源（TOSHIBA メロウ５D ３波長形昼光色 １５ワット）約 2000 lux 下に並べて 4℃で４週間放置した。光照射前後の 色素溶液の吸光度変化から色素残存率を計算した。 比較として、耐熱性試験で用いた市販赤色系色素に ついても同様の実験を行った。 ５．ｐＨの違いによる色調変化 色 素 を 溶 解 さ せ る buffer の pH を 0.1M の McIlvaine buffer（pH3.0）及び塩酸と水酸化ナトリ ウム溶液（pH 1、2、3、4、5、6、7、8）を用いて pH1∼8 まで調整し、色素溶液の色調変化について観 察を行った。 ６．金時草抽出液粉末の溶媒溶解性 金時草抽出液粉末 250mg を 10ml の水、熱水、エタ ノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO） にそれぞれ溶かし、溶けやすさについて検討した。 ７．色素成分の抽出及び精製 乾燥金時草 60g に対して 1000ml の熱水を加え約 30 分間抽出を行った。得られた抽出液は噴霧乾燥機 （大河原工業社製、Ｌ-８型）により粉末試料とした。 粉末試料約 12ｇを水に溶かした後、2∼3 倍量のエタ ノールを加え 4℃に静置した。一晩静置後、遠心分 離（3,000rpm、10min）し、上清をロータリーエバポ レーターで減圧濃縮した。この粗色素抽出液に、抽 出液量の 2∼3 倍量の酢酸エチルを加え撹拌後、遠心 分離（3,000rpm、10min）により、下層（水層）を得 た。この操作を 2∼3 回繰り返し、得られた水層を合 わせてロータリーエバポレーターで 40℃以下で減 圧濃縮した。 粗色素液は、AmberliteXAD-7（Sigma 社製）を充 填したカラム（φ3.3cm×27cm）に吸着させ、水で洗 浄した後、50%メタノール、100%メタノール（いずれ も１%ギ酸を含む）の順で溶出し、主要なアントシア ニンを含む 50%メタノール溶出画分を減圧濃縮乾固 した。次いで、乾固した色素を適量の 30%メタノー ルに溶かし、SephadexLH20（Amersham Biosciences 社製）を充填したカラム（φ1.2cm×67cm）に添加し、 30%メタノールで流速 0.7ml/min で溶出した。なお、 溶出液はフラクションコレクターを用いて 5ml ずつ 分取した。このうち、主要なアントシアニンを含む 溶液を集め、40℃以下で減圧濃縮乾固した。乾固し た 色 素 は 少 量 の 水 で 溶 か し 、 SepPakC18 カ ラ ム （Waters 社製）に供し、非吸着画分を水で洗浄後、 吸着画分を 100%メタノールで溶出させた。得られた 吸着画分をロータリーエバポレーターにより濃縮乾 固し、精製アントシアニン（約 170mg）とした。 EtOH is add precipitate supernatant Filtrate Concentrate
Dissolve in a small amount water EtAc is add
Upper layer（EtAc） Lower layer（water） Concentrate
Dissolve a little water AmberliteXAD-7 column chromatography
Wash with 1% Formic acid
Elute with 0,50,100%MeOH 50%MeOH fraction
Concentrate
Dissolve in a small amount water SephadexLH20 column chromatography ( 30% MeOH ) Concentrate
Dissolve in a small amount water SepPakC18 column chromatography
Wash with water Elute with MeOH MeOH fraction Desiccate in vacuo anthocyanin sample in water EtOH is add precipitate supernatant Filtrate Concentrate
Dissolve in a small amount water EtAc is add
Upper layer（EtAc） Lower layer（water） Concentrate
Dissolve a little water AmberliteXAD-7 column chromatography
Wash with 1% Formic acid
Elute with 0,50,100%MeOH 50%MeOH fraction
Concentrate
Dissolve in a small amount water SephadexLH20 column chromatography ( 30% MeOH ) Concentrate
Dissolve in a small amount water SepPakC18 column chromatography
Wash with water Elute with MeOH MeOH fraction
Desiccate in vacuo anthocyanin
sample in water
８．色素成分の分析 精製した金時草アントシアニンを 100%メタノー ルに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（以下、 HPLC と略す：島津製作所 SPD-M10A）を用いて分析 を行った。HPLC の分析条件は第 1 表に示す。また、 精製したアントシアニンは 0.1%ギ酸を含むアセト リニトリル：水（50：50）に溶解し、最終濃度で 0.01mg/ml に調整した後、フーリエ変換質量分析装 置（IonSpec 社製 Exploler,7.0T）で主要ピークの 質量分析を行った。イオン化条件は ESI で、付加電 圧は 3000V、導入速度は１uL/min のインフュージョ ン、MS/MS 解析は SORI-CID で行った。
Ⅲ 実験結果及び考察
１．一般成分分析 金時草抽出液粉末の一般成分は炭水化物が約 55% とほとんどで，残りを灰分（無機質）が占めており， 脂質，タンパク質含量は少なかった（第２表）。灰分 の中では，カリウム（K），マグネシウム（Mg），カル シウム（Ca）の含量が高かった（第３表）。 ２．耐熱性，耐光性，pH による色調の違い，溶媒溶 解性 色素の耐熱性は、金時草色素は沸騰浴中で 120 分 加熱した後でも、色素残存率が約 80%であり、同じ 赤系の色素では紫イモ色素と同程度の耐熱性であっ た（第２図）。色素の耐光性は、金時草抽出液粉末の 溶液は糖質を多く含んでいるため、２週間ほどでカ ビが発生し、測定不可能であった。そのため、金時 草色素については、色素溶液からエタノール沈殿法 により多糖類を取り除いた溶液について測定を行っ た。この結果、金時草色素は同じ赤系の色素の中で は光による安定性が最も高かった（第３図）。 pH の違いによる色調は、pH1∼pH3 までは鮮やかな 赤色（オレンジ色）、pH4、5、6 では赤紫色、pH7、8 では黒みがかかった紫色を呈した（第４図）。アント シアニンは pH によって大きく色調が変化し、pH が 高くなるにつれて色調が青味がかってくるとともに 発色も悪く鮮やかさが低下する。また、その安定性 に関しては pH が低いほど安定であると言われてい る１）。今回の結果でも、金時草の色素粉末は pH が高 くなるほど特有の赤紫色の発色が悪く、黒みがかっ た色となった。 溶媒溶解性では金時草抽出液粉末は水にやや溶け にくく、熱水、50%エタノールで溶けやすかった。ま た、エタノール、メタノール、アセトン、DMSO には 水分 灰分 炭水化物 脂質 タンパク質 5.6 26.6 56.79 0.24 10.77 第２表 金時草抽出液粉末の一般成分（ｇ／株） Ｃａ Ｆｅ Ｍｇ Ｐｂ Ｎａ Ｋ 12 6.9 1370 0.58 90 15400 第３表 金時草抽出液粉末の無機成分（㎎／株） カ ラ ム ： Inertsil ＯＤＳ−３Ｖ（ＧＬ Science社製 φ4.6×150 ㎜） カラム温度： ４０℃ 溶 媒 ： １％ギ酸水溶液（Ａ）：１％ギ酸アセトニトリル（Ｂ）＝９５：５ Ｂの濃度を ０−５分 ５％ ５−３０分 ５→４０％に直線的にグラジエント 流 速 ： １ml／分 検出波長 ： ２８０nm ５３０nm 第１表 ＨＰＬＣ測定条件 4 0 6 0 8 0 1 0 0 照 射 前 1 w e e k s 2 w e e k s 3 w e e k s 金 時 草 シ ソ 色 素 紫 コ ー ン 紫 イモ 赤 キ ャ ベツ 赤 ダイコ ン ( % ) 第３図 色素粉末溶液の耐光性 6 0 8 0 1 0 0 0 m in 3 0 m in 6 0 m in 1 2 0 m in 金時草 シソ色 素 紫コー ン 紫イモ 赤キ ャベツ 赤ダイコン ( % ) 第２図 色素粉末溶液の耐熱性溶けなかった（第４表）。しかし、金時草より精製し たアントシアニン色素はメタノールに可溶であった。 金時草は、食感にぬめりが感じられるのが特徴の野 菜であり、一般成分分析の結果、色素粉末には、約 55％の炭水化物が含まれていた。金時草のぬめりの 成分は、モロヘイヤやオクラなどに含まれる多糖類 と考えられる。多糖類は一般に水への溶解はまちま ちで、有機溶媒に不溶である２）。このことから、金 時草抽出液粉末の有機溶媒に対する溶解度の低さは、 含まれる多糖類の影響であるものと思われる。 ３．金時草アントシアニンの構造 精製した金時草アントシアニンは、約 170mg で、 色素粉末の約 1.4%がアントシアニンであった。金時 草アントシアニンの HPLC パターンを第５図に示し た。530nm の検出波長で得られたクロマトグラムで は、１つのメインピーク（保持時間 23.955 分）と サブピーク（保持時間 24.453 分）が認められた。吸 収スペクトルは、236、290、322 及び 538nm に吸収 極大があった（第６図）。質量分析の結果、金時草ア ントシアニンの分子量は 1507 と 1421 であった（第７図）。 以上の結果をふまえ、既往の 文献と対比したところ、金時草 のアントシアニンは吉玉ら３）が 報告したキク科植物であるサイ ネ リ ア （ Senecio x hybridus(Willd)Regel）の赤紫色花弁から単離され た ポ リ ア シ ル 化 ア ン ト シ ア ニ ン の 一 種 、 Rubrocinerarin（第８図）と考えられた。すなわち、 Rubrocinerarin と金時草アントシアニンは HPLC の 保持時間、吸収スペクトルが一致した。また、分子量、 MS/MS スペクトルも一致した。なお、金時草アントシアニ ンの質量分析測定で検出された分子量 1421 の物質は、 色素の単離・精製過程で、Rubrocinerarin のマロン酸が はずれたものと推定される。
Ⅳ 摘 要
金時草から抽出したアント シアニン色素粉末について以 下の食品化学的特性を色素溶 液で測定した。比較した他の 赤系色素５系統と比べ、耐熱 性、耐光性ともに高く、紫イ モ色素と同等の強さであった。 pH の違いによる色調は、pH１ ∼pH３ ま で は 鮮や か な 赤色 （オレンジ色）、pH４、５、６ では赤紫色、pH７、８では黒 みがかかった紫色を呈した。 溶媒溶解性では、熱水、50% エタノール溶液には容易に溶 けるが、水ではやや溶けにく く、エタノール、メタノール、 第４図 pH の違いによる金時草抽出液の色調 水 熱水 エタノール 50%エタノール メタノール アセトン ＤＭＳＯ △ ○ × ○ × × × ○：溶けやすい、△：やや溶けにくい、×：溶けない 第4 表 金時草抽出液粉末の溶媒溶解性Spectrum at time 24.01 min.
nm 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 mA U 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m A U 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 24.01 min λmax : 199 292 324 539 392 λmin : 313 263 393 391 653
Spectrum at time 24.01 min.
nm 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 m A U 0 50 100 150 200 250 300 m A U 0 50 100 150 200 250 300 24.01 min λmax : 195 290 324 539 485 λmin : 313 263 486 471 461 第 6 図 金時草アントシアニン（左）と Rubrocinerarin の吸収スペクトル m in 0 . 0 2. 5 5 .0 7 . 5 10 .0 1 2. 5 1 5.0 17 .5 20. 0 2 2 .5 25 .0 2 7 .5 3 0 .0 3 2.5 3 5 .0 37.5 4 0. 0 42 .5 45 .0 m A U 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 10 0 0 m A U 0 20 0 40 0 60 0 80 0 10 0 0 14 .3 7 3 1 6 .5 01 1 7. 0 9 9 1 8 .3 2 7 1 9. 0 1 2 2 0. 4 3 1 2 1. 3 55 2 1. 57 9 22 .4 7 5 2 3 .2 80 23 .9 5 5 2 4. 4 53 25 .6 7 5 27 .1 0 4 4 : 5 3 0 nm , 8 nm 0 30 7 0 3 0 30 7 0 3s e p h a fr am a in 保 持 時 間 ｍ A U 10.00 20.00 30.00 40.00 1000 200 600 min 第 5 図 金時草アントシアニンの HPLC による溶出パターン
アセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)には溶けな かった。 金時草の主要アントシアニンを各種クロマトグラ フィーにより単離・精製した。金時草アントシアニ ンは、金時草色素粉末の約 1.4%含まれていた。精製 し た ア ン ト シ ア ニ ン を 機 器 分 析 し た 結 果 、 Rubrocinerarin と推定された。
Ⅴ 参考文献
1) 大庭理一郎・五十嵐喜治・津久井亜紀夫 (2000) アントシアン−食品の色と健康−．建帛社． 2) 生化学事典第３版．東京化学同人.3) Kunijiro Yoshitama, Masahiko Kaneshige, Nariyuki Ishikura, Fukumi Araki, Shoji Yahara and Kenzo Abe（1994）A Stable Reddishi Purple Anthocyanin in the Leaf of Gynura aura nitiaca cv．‘Puple Passion’．J．Plant．Res． 107：209-214. １５０７．２９２８８ １４２１．２９９９４ １５０７．２９２８８ １４２１．２９９９４ 第７図 金時草アントシアニンの質量分析データ 第８図 Rubrocinerarin 構造式 3-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-7-O-(6-O-(4-O-(6-O-caffeyl-β-D-glucopyranosyl)caffeyl) -β-D-glucopyranosyl-3′-O-(6-O-caffeyl-β-D-glucopyranosyl)cyanidin
