Title
Efficient cardiomyogenic differentiation of embryonic stem cell
by fibroblast growth factor 2 and bone morphogenetic protein 2(
内容の要旨(Summary) )
Author(s)
河合, 隆雄
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第616号
Issue Date
2005-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14505
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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 貞 河 合 隆 雄(岐阜県) 博 士(医学) 甲第 616 号 平成17 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Efficient cardiomyogenic differentiation of embryonic stem cellby fibroblast growth factor2and bone morphogenetic protein2
(主査)教授 藤 原 久 義 (副査)教授 国 貞 隆 弘 教授 柴 田 敏 之 論文内容の要旨 多分化能を有するES(胚性幹)細胞は,移植医療のドナー細胞候補として期待されるにも関わらず,心筋細胞 をはじめとしてある特定の細胞にのみ分化させることは未だに困難である｡ 今回,我々は発生期の心臓形成に関与するいくつかの増殖因子(TGF-β,aCtivin,FGF-2,BMP-2)を種々の 濃度と添加時期でES細胞へ作用させる事により,各々の増殖因子のJL､筋分化促進効果の有無を検討した｡その 結乳 FGF-2及びBMP-2は濃度依存性にES細胞からの心筋細胞分化を促進したため,更に詳細な解析を行なっ た｡ 対象と方法 マウスES細胞(Rl)を3日間,浮遊培養し,EBs(胚様体)を作製後,様々な濃度とスケジュールで組換え型 増殖因子(TGF-β,aCtivin,FGF-2,BMP-2)もしくはその阻害抗体を添加し,培養した｡ 各々の因子のES細胞に対する心筋分化促進効果は,分化誘導後10日目ならびに17日目に心筋特異的な転写因 子であるNkx2.5,GATA4,MEF2C,SarCOmeric蛋白であるaMHCの遺伝子発現をRT-PCR法により解析し, さらにsarcomericmyosin(sMHC),trOPOmyOSin,a-aCtinin蛋白質の発現を免疫染色により解析することで 評価した｡ 結果 RT-PCR法による解析の結果,増殖因子として添加した4種の中でも,特にFGF-2ならびにBMP-2を添加した もので,濃度依存性のJL､筋分化促進効果が認められた｡また,その至適濃度は,FGF-2とBMP-2それぞれ1.Ong /ml,0.2ng/mlと比較的低濃度であった｡ さらにFGF-2,BMP-2ともに持続的に添加するものよりは,むしろEBs作製中の分化初期のみ短時間の添加 で効果的であることがわかった｡その効果を免疫染色により詳細に評価したところ,SMHC陽性細胞は増殖因子 を添加しないコントロール群(21.1±3.4%)に対して,FGF-2,BMP-2を至適濃度で短時間作用することでFGF-2群(31.8±2.5%),BMP-2群(28.0±6.0%),FGF-2,BMP-2両者添加群(35.1±3.6%)と最大約1.5倍の心筋分 化促進効果が認められた｡またtropomyosin,Nkx2.5陽性細胞を評価した場合も同様の結果が得られた｡ これに対して阻害抗体を用いて内因性FGF-2,BMP-2を阻害した結果,心筋細胞分化の抑制が認められたこ とから,FGF-2,BMP-2はES細胞のJL､筋細胞分化に重要な因子であることがわかった｡ 考察 TGF-β,aCtivin,FGF-2,BMP-2は個体の発生過程において重要な役割を担っており,とりわけ心臓の形態
ー55-形成には必須の増殖因子である｡しかしながら,これまで,ES細胞の心､筋分化に及ぼす詳細な解析ははとんど 行われていなかった｡ 今回,マウスES細胞から作製したEBsに対するFGF-2ならびにBMP-2の添加は,心筋特異的な転写因子であ るNkx2.5,MEF2C,GATA4遺伝子やsarcomeric蛋白であるaMHC遺伝子,さらにはtropomyosin,a-actinin蛋白の発現を促進した｡これに対して,各々の阻害抗体添加による内因性のシグナルの阻害は,Nkx2.5,
aMHC,MEF2C遺伝子の発現を著しく抑制することから,FGF-2及びBMP-2はES細胞のJ[､筋細胞分化に必須
の分化誘導促進因子であると考えられる｡ 重要なことに,我々のES細胞による心筋細胞分化系において,FGF-2やBMP-2はともに心筋分化を促進する 至適濃度を有していることが明らかとなった｡このような増殖因子の濃度依存性はニワトリ胚を用いたFGFやBMPによる心筋分化誘導系においても報告されている｡これは分化促進因子といえど,多く作用させれば分イヒ
が促進するわけではなく,生理的な濃度内の適した濃度が存在し,ES細胞による効率の良い心筋分化系の確立 には添加する分化促進因子の至適濃度を考慮する必要があることを示している｡ また興味深いことに,ES細胞による心筋細胞分化系において,EBsが形成される間の分化初期の3日間のみ FGF-2やBMP-2を添加すれば,効率的に心筋分化誘導の促進を行うことが示された｡FGF-2やBMP-2は心臓の 発生に先だって起こる中胚葉の誘導因子であり,このES細胞分化初期の3日間は,個体発生過程における3葉形 成の時期に相当する｡また,ニワトリ胚ではFGFとBMPを胚葉形成期の30分間曝露するのみで,最大の心筋分 化促進効果を示す事が報告されており,短時間でも適切な時期にFGFやBMPを作用させることが重要であるこ とを示している｡これらの事から,我々のマウスES細胞の系ではEBsが形成される3日間に,心筋細胞への分化 能が運命付けられており,効率良く心筋分化誘導する為にはES細胞の分化の初期にFGF-2やBMP-2を添加する 事が重要であると考えられる｡ 結論 以上の事から,FGF-2ならびにBMP-2は,ES細胞から心筋分化を誘導するための至適濃度,有効な作用時間 が存在し,心筋細胞の分化を促進する必須の因子であることが明らかとなった｡今後,ES細胞を用いた再生医 療において,至適条件でFGF-2ならびにBMP-2を用いることは,効率的に移植心筋細胞ソpスを得る方法の確 立に役立っものと考えられる｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 河合隆雄は,FGF-2ならびにBMP-2が,ES細胞から心筋分化を誘導するための至適濃度,有効な作 用時間を有し,JL､筋細胞の分化を促進する必須の因子であることを明らかにした｡これらの知見は,循環器病学 やES細胞を用いた再生医療の進歩に寄与するものと考える｡ [主論文公表誌]Efficient Cardiomyogenic Differentiation of Embryonic Stem Cellby Fibroblast Growth Factor2and Bone Morphogenetic Protein2
CirculationJourna168,691-702(2004).
