Kunio MIKI and Nobutami KASAI : Structure and Function of Modified Hemoglobins and Myoglobins. Crystallographic studies of chemically modified hemoglo

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化 学 修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン ・ミオ グ ロ ビ ンの 構 造 と機 能

大阪大学 ・工学部 三 木 邦 夫,笠 井 暢 民

Kunio MIKI and Nobutami KASAI : Structure and Function of Modified Hemoglo-bins and Myoglobins.

Crystallographic studies of chemically modified hemoglobins and myoglobins are reviewed. Since each subunit of these proteins is composed of polypeptide chain (globin) and heme, two kinds of modification were applied ; that of the globin and of the heme group. The relation between structural change and oxygen affinity has been understood by comparison of the structures of myoglobins reconstituted with a variety of modified hemes with that of native one. •kJ. Cryst _{. Soc. Jpn. 27, 2 (1985)•l.}

1.は じ め に ヘ モ グ ロ ビン(Hb),ミ オ グ ロ ビ ン(Mb)は 我 々 の体 内 で呼 吸 現 象 に 関 与 し_{,酸 素 の運 搬,} 貯 蔵 に た ず さわ る タ ンパ ク質 で あ る.両 者 は 古 くか ら さ まざ まな方 法 で広 く研 究 され て きた が,X線 結 晶 学 に と って は 最 初 に 手 が け られ た タ ンパ ク質 で あ る とい う歴 史 的 意 義 を持 ち1,2), これ らの結 晶 構 造 解 析 の 成 功 は,結 晶 学 は も と よ り,生 化 学,生 物 学,医 学 な ど多 くの 自然 科 学 の 分 野 に 大 きな 影 響 を 与 え た.こ れ ら両 タ ンパ ク質 の研 究 法 と して広 く行 わ れ てい る も の に,化 学 的 あ るい は遺 伝 的 に修 飾 され た もの の構 造 と機 能 を 天 然 の も の と比 較 して,そ の 生 理 機 能 と構 造 との 関 係 の理 解 を深 め る とい う方 法 が あ る.我 々 も こ う した 研 究 法 の 一 つ と して,配 合 群 と して含 まれ,そ こで 酸 素 との反 応 が 行 わ れ る ヘ ムを 化 学 的 に 修 飾 した一 連 の ミオ グ ロ ビ ンの 結 晶構 造 解 析 を行 っ て きた.こ こで は,修 飾 ヘ モ グ ロビ ン及 び ミオ グ ロ ピ ン に つ い て 結 晶 学 的 な 研 究 に焦 点 を あ て て概 説 し,そ の 中で 我 々 の最 近 の研 究 成 果 を 含 め て, ヘ ムを 修 飾 した もの の研 究 を 主 と して紹 介 す る.ま ず 次 章 で,こ れ らの 研 究 の 基 礎 とな る天 然 の ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビン の立 体 構 造 を 最 近 の 報 告 を ま じえ て要 約 す る. 2.ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン の 分 子 構 造 第1図(アー ト頁)に ヘ モ グ ロ ビ ン 及 び ミ オ グ ロ ビ ン の 立 体 構 造 を 示 す.ヘ モ グ ロ ビ ン は 四 つ の ポ リペ プ チ ド鎖 か ら な る.す な わ ち,α 鎖(ヒ トの 場 合,分 子 量15,742,ア ミ ノ 酸141 残 基)と β 鎖(分 子 量16,483,146残 基)そ れ ぞ れ2本 ず つ の α2β2構造 で あ る.一 方,ミ オ グ ロ ビ ン は 単 鎖(マ ッ コ ウ ク ジ ラ の 場 合,分 子 量17,815,ア ミノ 酸153残 基)で,そ の 立 体 構 造 は,ア ミ ノ酸 配 列 が 大 き く異 な る に も か か わ らず,ヘ モ グ ロ ビ ン の α 及 び β鎖 と非 常 に よ く似 て い る.全 体 の 大 き さ は お よ そ45×35×25 で,ら せ ん 部 分 が 全 体 の 約75%を 占 め る.第1表 に ミオ グ ロ ビ ン に お け る らせ ん 部 分 と そ れ ら の 間 の 非 ら せ ん 部 分 の 名 称 を あ げ 27.1-2

三木邦夫,笠 井暢民 3 第1表 ミオ グ ロ ビン(マ ツコ ウ ク ジ ラ)の らせ ん 部 分 第2図 ヘ ム(左)と ヘ ム 平 面 の 両 側 の 二 つ の ヒ ス チ ジ ン残 基(右).天 然 の ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン に 含 ま れ る ヘ ム は プ ロ トヘ ム(鉄 一プ ロ トポ ル フ ィ リ ンIX) でR1,R2は と も に ビ ニ ル 基.ヘ ム 側 鎖 に あ る 数 字(1∼8)は 置 換 基 の つ く位 置 の 番 号. る.ヘ モ グ ロ ビ ン の 構 造 は,近 似 的 に は ミ オ グ ロ ビ ン 分 子 の 構 造 が 四 つ 集 ま っ た も の と い え る.そ れ ぞ れ の ポ リペ プ チ ド鎖 は 配 合 群 と して ヘ ム を 持 つ.ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン に 含 ま れ る ヘ ム は,鉄― プ ロ トポ ル フ ィ リ ンIX(プ ロ トヘ ム)で あ る(第2図 参 照).鉄 原 子 は ポ ル フ ィ リ ン 環 の 四 つ の ピ ロ ー ル 窒 素 と 結 合 し て い る.さ ら に,鉄 は ポ ル フ ィ リ ン平 面 に 垂 直 な 上 下 方 向 の 一 つ(第 五 配 位 座)で,ポ リペ プ チ ド鎖(グ ロ ビ ン)の ヒ ス チ ジ ン 残 基 (ミ オ グ ロ ビ ン の 場 合His93(F8))の 窒 素 と結 合 し て い る.残 る 一 つ(第 六 配 位 座)は 酸 素 と結 合 す る 部 位 で あ り,こ の 配 位 座 の 近 傍 に は 直 接 鉄 と は 結 合 し て い な い も う一 つ の ヒ ス チ ジ ン 残 基(His64(E7))が 存 在 す る.前 者(第 五 配 位 座)を 近 位 ヒ ス チ ジ ン,後 者(第 六 配 位 座 近 傍)を 遠 位 ヒ ス チ ジ ン と呼 ぶ(第2図 参 照).こ の ヘ ム の 側 鎖 は 周 囲 の グ ロ ビ ン 部 分 と共 有 的 に は 結 合 し て い な い の で,ヘ ム と グ ロ ビ ン 部 分(ア ポ タ ン パ ク質)と を 分 離 す る こ とが で き る.一 度 分 離 した ヘ ム と ア ポ タ ン パ ク 質 と を 再 び 結 合 させ る こ と もで き(再 構 成), こ の 手 法 は 後 述 の 修 飾 ヘ ム を 持 つ ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン の 研 究 の 際 に 用 い られ る. ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン に は,通 常,生 理 的 に 関 係 の あ る三 つ の 状 態 が あ り,そ れ は, 1)デ オ キ シ(deoxy)型,鉄 の 酸 化 状 態 は2価,第 六 配 位 座 は 空,2)オ キ シ(oxy)型,鉄 2価,第 六 配 位 座 に 酸 素 分 子 が 結 合,3)メ ト(met)型,鉄3価,第 六 配 位 座 は 水 分 子,で あ る.前 述 の と お り,ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン の 研 究 は,タ ン パ ク質 結 晶 学 に お い て 最 27.1-3

4 化 学 修 飾 ヘ モ グ ロ ビン ・ミオ グ ロ ビンの 構 造 と機 能 古 の歴 史 を 持 つ が,両 者 の 各 状 態 に お け る高 分解 能 の精 密 構 造 は 最 近 次 々 と報 告 され,立 体 構 造 の違 い を よ り詳 細 に 議 論 で き る よ うに な った.第2表 に現 在 得 られ る最 新 の精 密 化 構 造 を ま とめ る. 第2表 ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ンの精 密 化 され た 結 晶 構 造 解 析 ヘ モ グ ロ ビンに お い て,酸 素 の 結 合 して い ない デ オ キ シ状 態 か ら,酸 素 化 され た オ キ シ状 態 へ 移 る と きの 構 造 変 化 とそ の 協 同 的 な 性 質 との関 係 に つ い て,Perutzの 有 名 な 提 唱 が あ る18).デ オ キ シ状 態 とオ キ シ状 態 で は 四 次 構 造,す な わ ち,α2β2四 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト間 の 相 互 配 置 の 大 きな 変 化 が あ り,デ オ キ シ状 態 で は 四 つ のサ ブ ユ ニ ッ トは 数 本 の 塩 結 合 で 結 ば れ て 酸 素 に 対 す る親 和性 の 低 いT(tense)状 態 を と るの に 対 し,オ キ シ状 態 で は サ ブユ ニ ッ ト 間 の結 合 が 切 られ,束 縛 の ゆ るいR(relaxed)状 態 を と る と され て い る.こ の 四 次 構造 の変 化 は ヘ ム の鉄 の変 化 に 帰 因 す る と考 え られ,デ オ キ シ型 で は 鉄 は 高 ス ピ ン状態 で ポ ル フ ィ リ ン環 の平 面 か ら近 位 ヒス チ ジ ン側 に 飛 び 出 してい るが,オ キ シ型 に な る こ とで 鉄 は 低 ス ピ ン に な りポ ル フ ィ リン環 平 面 上 に ほ とん どの る よ うに な る.こ の 鉄 原 子 の 変 化 が,近 位 ヒス チ ジ ン側 の らせ ん部 分 の相 互 位 置 の 構 造 変 化 を もた ら し,最 終 的 に は サ ブユ ニッ ト間 の結 合 を 切 断 す る まで に至 る と説 明 され てい る.最 近 の デ オ キ シ,オ キ シ両 状 態 の 精 密構 造 の報 告5,6) は,こ の提 唱 につ い て,両 状 態 に お け る構 造 の 変 化 の 程 度 や 特 定 の 残 基 の 役割 の見 積 りな ど の見 直 しを含 め た 詳 細 な再 検 討 を 可 能 に して い る.た とえ ば,デ オ キ シか らオ キ シへ の変 化 に伴 う鉄 原子 の ポ ル フ ィ リン平 面 か らの変 位 は,α 鎖 の ヘ ムで0.58か ら0.16A.,β 鎖 で は 0.50か ら0.00 とな り,鉄 とポ ル フ ィ リン環 の ピ ロール 窒 素 との 結 合 の 平均 距 離 は,デ オ キ シ状 態 で2.06 オ キ シ状 態 で1.98 で あ る.ま た,オ キ シ型 で の 酸 素 の 鉄 へ の結 合角 度(∠Fe-O-O)は,α,β 鎖 でそ れ ぞ れ153,159° と な っ てい る. 一 方,オ キ シ型 ミオ グ ロ ピンの 精 密 構 造 も最 近 報 告 され9),デ _{オ キ シ,オ キ シ両状態 の詳} しい比 較 が で き る.デ オ キ シ及 び オキ シ型 の 構造 で,鉄 原 子 の ポ ル フ ィ リン環 平 面 か らの変 位 はそ れ ぞ れ0.42,0.18A,ま た,鉄 と ピ ロー ル窒 素 との 平 均 結 合 距 離 は そ れ ぞれ2.03, 1.95Aと な って い る.ミ オ グ ロ ビ ンの結 晶構 造 に つ い て の最 近 の トピ ックス は,中 性 子 線 に よ って オ キ シ ミオ グ ロ ビンの 結 晶 構 造 が 決 定 され,遠 位 ヒス チ ジ ン とヘ ム鉄 に結 合 した 酸 素 との間 に 水 素 結 合 が 認 め られ た こ とで あ ろ う14).第3図 に 示 す よ うに 生 理 的pHに お い て は, 水 素 は 遠 位 ヒス チ ジ ン のNε とNδ の ど ち らに もつ く可 能 性 を もつ が,中 性 子線 回折 の結 果, 水 素(実 際 は 置 換 され た 重 水 素)が は っ き りとN,に 結 合 して い る こ とが わ か った.Nε-D

とO2… …Dの 距 離 は そ れ ぞ れ1.04,1.98 ,Ne-D… …O2の 角 度 は157° で,中 程 度 の 強

三木 邦夫,笠 井暢民 5 第3図 中性 子線 回折 に よる結 晶構 造 解 析 で確 認 され た 遠 位 ヒス チ ジ ン (Ngに つ くH)と 酸 素(O2)と の 間 の 水素 結 合14) さ の水 素 結 合 を 形 成 して い る と考 え られ る.遠 位 ヒス チ ジ ンは,単 な る フ ァンデ ル ワール ス 接 触 だ け で は な く,酸 素 と水 素 結 合 に よ って この オキ シ型 の 構造 を 安定 化 して い る とい え る. ヘ モ グ ロ ビ ン と ミオ グ ロ ビ ンの 構造 と機 能,及 び そ の 関 係 な どに つ い て は ,多 くの詳 しく わ か りや す い 解 説 が あ る15-19). 3.修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン ヘ ム タ ンパ ク質 の構 造 と機 能 の関 係 を解 明す る手 段 と して広 く用 い られ てい る も のに ,タ ンパ ク質 分 子 の特 定 の部 位 を天 然 に存 在 す る状 態 と異 な る よ うに 化学 的 に修 飾 して,こ れ を 主 と して物 理 化 学 的 方 法 で 研 究 す る も のが あ る.同 様 の研 究 は,遺 伝 的 に特 定 の ア ミノ酸 配 列 が天 然 の もの と異 な る ヘ モ グ ロ ビン,い わ ゆ る異 常 ヘ モ グ ロ ビン につ い て も多 く行 わ れ て い る.こ れ ら化 学 的 あ るい は 遺 伝 的 に 修 飾 され た ヘ モ グ ロ ビン,ミ オ グ ロ ビン のX線 結 晶 解 析 につ い て も多 くの例 が あ る. 3.1ヘ モ ゲ ロビ ン,ミ オ グ ロビ ン に対 す る修 飾 の種 類 ヘ モ グ ロ ビン,ミ オ グ ロ ビンの 修 飾 方 法 は,修 飾 され る部 分 が グ ロ ビ ンか ヘ ム か で まず 二 つ に 大 別 で き る. グ ロ ビ ン の 修 飾 {化 学 的 修 飾 SH基(シ ス テ イ ン残 基)の 修 飾 N末 端 の 修 飾 C末 端 の 修 飾 遺 伝 的 修 飾 異 常 ヘ モ グ ロ ビン に おけ る ア ミノ酸 配 列 の変 異 ヘ ム の 修 飾 {ヘ ム再 構 成 ヘ ム中心 金属 の置 換 ヘ ム側 鎖 の化 学 的 修 飾 ヘ ム鉄 の種 々 の配 位 子 と の結 合(第 六 配 位 座) 27.1-5

6 化 学 修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン ・ ミオ グ ロ ビ ンの構 造 と機 能 3.2グ ロ ビ ン部 分(ポリ ペ プ チ ド鎖)が 修飾 され たヘ モグ ロビ ン† グ ロ ビ ン部 分 の修 飾 は ヘ モ グ ロ ビン に対 して行 わ れ た も のが 大 部 分 で,化 学 的 な修 飾 と葦 伝 的 な 修 飾 に 分 け られ る.両 者 の 研 究 で は修 飾 に よる構 造 変化 とそ の酸 素 平 衡 特 性 を あ らわ す 諸 性 質(酸 素 親和 力,Bohr効 果,協 同 性 な ど††)の パ ラ メー タの 変 化 との 関連 が 議 論 さ れ て い る.前 者 は シス テ イ ン残 基(ほ とん どが β鎖Cys93(F9))のSH,N末 端,C末 端 を 化 学 的 修 飾 した もの で あ るが,こ れ らのX線 解析 例 は まず 見 当 た ら な い.後 者 は特 定 の部 分 ア ミノ酸 配 列 が 正 常 な ヘ モ グ ロ ビ ン と異 な る異 常 ヘ モ グ ロ ビ ンで,こ のX線 解 析 に よる研 究 例 は30近 くあ る†††.ま た,胎 児 の ヘ モ グ ロ ビ ン(HbF)は 成 人 ρ正 常 な も の(HbA)の β 鎖 が γ鎖(β 鎖 に比 べ て39の ア ミノ酸 が 異 な る)に 置 きか わ ったa2γ2構 造 を 持 って い るが, このX線 解 析 も行 わ れ て い る20). 3.3ヘ ムが 修 飾 され た ヘ モグ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ン ヘ ムの 修 飾 に は,ヘ ムの 中 心 金 属 を 鉄 か ら他 の 原 子(Co,Mnな ど)に 置 き換 えた もの と ヘ ムの 側 鎖 置 換 基(ビ ニル基,メ チ ル基 及 び プ ロ ピオ ン酸 基)を 他 の 置 換 基 に 変 え た もの と が あ る.こ れ らは,酸 性 条 件 に す る こ とで 天 然 の ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ンか らヘ ムを抜 き と り,代 りに 中 心 金 属 や 側 鎖 を 置 換 した ヘ ムで再 構 成 す る こ とに よ って得 られ る.ま た, 厳 密 に は ヘ ム修 飾 とは い え な い が,本 来 酸 素 の 結 合 す るヘ ムの 第 六配 位 座 に,酸 素 以外 の種 々 の配 位 子 を 結 合 させ た ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ンを 作 る こ と もで き る.再 構 成 に よ り修 飾 ヘ ムが 導 入 され た もの,及 び ヘ ム鉄 に 種 々 の配 位 子 を 結 合 させ た もの に つ い て は,い くつ か の分 子 構 造 がX線 解 析 に よ って 明 らか に な って い る. 3.3.1金 属置換ヘモグ ロビン,ミ オグ ロビン†††† ヘ ム鉄 を 他 の金 属 に 置 換 した ヘ モ グ ロ ビン,ミ オ グ ロ ビ ンの研 究 は,Co,Ni,Cu,Mnな どを対 象 に 比 較 的 古 くか ら行 わ れ て きた.X線 解 析 も第3表 に あ げ る よ うに3例 ほ どあ る. これ らの うち,コ バ ル ト置 換 の もの は 本 来 の 機 能 で あ る酸 素 との 可 逆 的 な 結 合 を 行 い,コ バ ル トが2価 で 奇 数 個 の3d電 子 を 持 つ た め 還 元型 でEPRの 観 測 が 可 能 で あ る こ とな ど の 理 由で,最 も よ く研 究 され て い る.デ オキ シ型 コバ ル ト置 換 ヘ モ グ ロ ビ ンのX線 解 析23)では, ヘ ムの ポル フ ィ リン環 平 面 か らの 金 属 の 変 位 が0.33 と元 の鉄 の場 合 よ り小 さ くな っ て お 第3表 金 属 置 換 及 び ヘ ム側 鎖 修 飾 ヘ モ グ ロ ビン,ミ オ グ ロ ビン の結 晶 構 造 解 析 *第4表 _{に あ げ た も のを 除 く.} † この修 飾 に お け る種 類,意 義,研 究 例 な ど の詳 細 につ い ては 今 井19),中 馬17)の解 説 に ま とめ られ て い る. †† こ こで は これ らにつ い て述 べ る紙 数 は な い ので,前 述 の 文 献 を 参 照 され た い15-19). †††Dickersonら の 成 書 に ま とめ られ て い る15). ††††コバ ル ト置 換 に代 表 され る この研 究 の概 要 につ い ては,斎 藤,山 本 の 解 説 を 参 照 され た い21). 27.1-6

三木邦夫,笠 井暢民 7 り,コ バ ル トと 近 位 ヒ ス チ ジ ン のN,と の 結 合 距 離 は 逆 に0.1∼0.2A長 くな っ て い る.し か し,こ の コ バ ル ト置 換 ヘ モ グ ロ ビ ン の 協 同 性 の 自 由 エ ネ ル ギ ー は 元 の 鉄 の 場 合 の お よ そ 半 分 近 く に 減 少 す る が,こ れ に つ い て は そ の 構 造 か ら の は っ き り した 証 拠 は 見 つ け られ て い な い. 3.3.2ヘ ム の 側 鎖 を 修 飾 した ヘ モグ ロ ビ ン,ミ オグ ロ ビ ン ヘ ム の 側 鎖 の 修 飾 は,ヘ ム の2位 及 び4位(第2図(左)のR1及 びR2の 置 換 基)を ビ ニ ル 基 か ら他 の 置 換 基 に 変 え た も の が 大 部 分 で あ る.X線 結 晶 解 析 で 構 造 が 明 らか に な っ た ヘ ム 側 鎖 修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン,ミオ グ ロ ビ ン を 第3表 及 び 第4表 に 示 す. 第4表 合 成 され た 側 鎖 修 飾 ヘ ムで 再 構 成 され た ミオ グ ロ ビ ン(マ ッ コ ウ クジ ラ,メ ト型)の 結 晶 構 造 解 析27) *第2図 参 照 **50%酸 素 飽 和 を 示 す と き の酸 素 分 圧(こ れ らはpH7 _{.4,25℃ にお け る測 定).こ の値 が 小 さけ れ} ば 酸 素 親 和 性 が 高 い.天 然 の ミオ グ ロ ビ ン(R1=R2=-CH=CH2)で の値 は0.93mmHg. Moffatら は ヘ ム と して ジ ューテ ロヘ ム(R1=R2=水 素)† と メ ソヘ ム(R1=R2=エ チ ル基) を 持 つ ヘ モ グ ロ ビンのX線 解 析 を 行 って い る25,26).これ ら修 飾 ヘ モ グ ロ ビン の酸 素 との親 和 力 を プ ロ トヘ ム(R1=R2=ビ ニル基)を 持 つ 天 然 のヘ モ グ ロ ビン と比 較 す る と,プ ロ トヘ ム Hb<ジ ュ ーテ ロヘ ムHb<メ ソヘ ムHbの _{順 で 高 くな って い る.こ れ は2位 及 び4位 の 置} 換 基 の電 子 吸 引 性 の大 き さが ビニル 基,水 素,エ チ ル 基 の 順 に 減 少 す る こ と と一 致 して い る. す なわ ち,ヘ ム側 鎖 置 換 基 の電 子 吸 引 性 の 減 少,換 言 す れば電 子 供 与 性 の増 加 が,鉄 原 子 の π電 子 を 増 加 させ,金 属― 配 位 子(酸 素)の 逆 供 与 の 結 合 を 強 め て 酸 素親 和 性 を 高 め る とい うふ うに 電 子 的 効果 だ け か らで も解 釈 で き る.ヘ ムの側 鎖 置換 基 が ビ ニル基 か ら水 素 と小 さ くな った ジ ュー テ ロヘ ムHbに お い て 大 きな 立体 的 変 化 が 予想 され るに もかか わ らず,X線 解 析 の結 果 で は グ ロ ビ ン部 分 に局 在 的 な小 さ い変 化 が 起 って い るに す ぎ な い.一 方,ヘ ム の 側 鎖 が ビ ニル基 か らエ チ ル基 に 置 き換 え られ た メ ソヘ ムHbで は,ジ ュー テ ロヘ ムHbに 比 べ て構 造 が変 化 す る と ころが 多 く,グ ロ ビ ン部 分 とヘ ム 自身 の両 方 に 及 んで い る .こ の構造 変 化量 の大 小 を酸 素 親 和 性 の差 に 関 連 づ け る こ ともで き るが,そ れ が 立 体 的 な効 果 か らきて い るの か,電 子 的 効 果 か らな のか,そ の両 方 か らな のか は,構 造 変 化 の検 討 か ら確 証 す る こ とは で き て い な い.な お,こ の二 つ の修 飾 ヘ モ グ ロ ビンで は,ヘ ムは 元 のヘ モ グ ロ ビン と同 じ配 向 で再 構 成 され て い る こ とがX線 解 析 か ら確 認 され て い る. 我 々 の研 究 室 で は,こ れ ま で化 学 的 に 合 成 され た ヘ ムを 用 い て 再 構 成 した 一 連 の 修 飾 ミオ グ ロ ビン のX線 結 晶 解 析 を 行 っ て きた27).対 象 と した7種 の 修 飾 ミオ グ ロ ビ ンを 第4表 に示 す.こ れ らは ヘ ムの側 鎖R1とR2を そ れ ぞ れ 交互 に ビ ニル基 か らエ チ ル基,水 素 及 び イ ソ プ ロ ピル 基 へ と系 統 的 に 変 え た もの で,吉 田,生 越 らの グル ー プで ヘ ムの 合成,再 構 成,酸 素 平 衡 曲 線 の 解 析 が 行 わ れ た28).第4表 に あ げ たP50(50%酸 素 飽 和 を示 す と き の酸 素 分 † こ こ で の ジ ュ ー テ ロ(deutero-)の 名 は_{,重 水 素 化 の 意 味 と は 関 係 が な い.} 27.1-7

8 化 学 修 飾 ヘ モ グ ロ ビ ン ・ ミオ グ ロ ビン の構 造 と機 能 圧)で あ らわ され る酸 素 親 和 性 の変 化 の 傾 向 は,必 ず しも置換 基 の電 子 吸 引性 の大 小 の傾 向 とは一 致 して お らず,電 子 的 な効 果 か らだ け で は 説 明 で きな い.こ の こ とは,こ れ ら修 飾 ミ オ グ ロ ビン に お け る酸 素 親 和 性 に 対 す る立 体 的 効 果 の 重 要 性 を示 唆 して い る よ うに思 われ る. 解 析 の 手順 と して は,ま ず これ ら7種 の修 飾 ミオ グ ロ ビン結 晶(メ ト型)は 元 の天 然 メ トミ オ グ ロビ ン10)と同 型 で あ る こ とか ら,初 期 の電 子 密 度 計 算 は メ ト ミオ グ ロ ビン の位 相 を 用 い て 行 い,後 にHendricksonとKonnertの 方 法 に よる立 体 化 学 的 条 件 制 約 下 で の逆 空 間 精 密 化29)を2.2A分 解 能 の デ ー タで そ れ ぞ れ に つ い て 行 った.精 密 化 の 結果,R値 は どの場 合 も20%前 後 に まで 収束 した. 解 析 初 期 に 近 似 の 位 相 を 用 い て ヘ ム近 傍 の 構 造 変 化 を 検 討 した と こ ろ,4一 エチ ル ジュー テ ロヘ ム及 び2-ビ ニ ル-4一 イ ソプ ロ ピル ジ ュ ー テ ロヘ ムを 含 む ミオ グ ロ ビンに お い て は, 第2図(左)に 示 され た 矢 印 の軸 の まわ りに 180。回 転 して元 の も の の裏 返 しの配 向 で 再 構 成 され て い る こ とが 判 明,こ の こ とは 後 の精 密 化 に よ り確 認 され た.第4図 に2-ビ ニ ル-4-イ ソ プ ロ ピル ジ ュー テ ロヘ ム ミオ グ ロ ピ ン (以 下,2-Vn,4-Ip-Mbと 略 記)に おけ る ヘ ム平 面 の￨Fo(再 構 成Mb)￨-￨Fo(天 然 の Mb)￨を 係 数 とす る差 フ ー リエ 合 成 図 を 示 す.1∼4位 の側 鎖 の位 置 に 現 れ た 正 負 の ピ ー クは 裏 返 った ヘ ムの 配 向(元 の1位 が4位 に,2位 が3位 に な る)を 考 えれ ば 矛 盾 な く 解 釈 で き る.こ の ヘ ムの配 向 は,ま ず4位 の 置 換 基 の か さ高 さに 支 配 され る と考 え られ る が,元 の3位 の 近 傍 は グ ロビ ン部 分 の 主 鎖 原 子 に近 くあ ま り余 分 の 空 間 が な い た め,も し 裏 返 しの配 向 を とれ ば 元 の3位 に か さ高 い置 換 基 の くる2,4-ジ イ ソ プ ロ ピル ジ ュ ーテ ロ ヘ ム ミオ グ ロ ビ ン(2-Ip,4-lp-Mb)の 場 合 に 第4図2-ビ ニ ル-4-イ ソ プ ロ ピ ル ジュー テ ロ ヘ ム ミ オ グ ロ ビ ン(2-Vn,4-Ip-Mb)の ヘ ム 平 面 に お け るIF。(再 構 成Mb)￨-￨Fo(天 然 のMb)￨を 係 数 とす る 差 フ ー リエ 合 成 図27).正 の ピ ー ク を 実 線 で,負 の ピー ク を 破 線 で あ らわ す.ヘ ム が 裏 返 しの 配 向 で 再 構 成 さ れ た と 考 え る と(本 文 参 照), 1位 は イ ソ プ ロ ピ ル 基(再 構 成Mb)一 メ チ ル 基(天 然 のMb)=正,2位 は メ チ ル ー ビ ニ ル=負,3位 は ビ ニ ル ー メ チ ル=正,4 位 は メ チ ル ー ビ ニ ル=負 と な り,図 上 の 四 つ の ピ ー クが 解 釈 で き る. は ヘ ムの 反 転 は み られ な い よ うで あ る.裏 返 しの配 向 の ヘ ムを 持 つ これ ら二 つ の ミオ グ ロ ビ ンで は,ヘ ムの周 囲 の グ ロ ビ ン部 分 の ヘ ムに 対 す る相 対 的 変 化 も他 の も のに 比 べ て 大 き くな って い る. 修 飾 ヘ ム 導 入 が も た ら す 構 造 の 変 化 を,か さ 高 い 置 換 基 で あ る イ ソ プ ロ ピ ル 基 で 修 飾 され た ヘ ム を 持 つ 三 つ の ミ オ グ ロ ビ ン に つ い て 検 討 した と こ ろ,構 造 変 化 と 酸 素 親 和 性 と の 関 係 に 興 味 深 い 結 果 が 得 られ た.こ れ ら3種 の 修 飾 ミ オ グ ロ ビ ン に つ い て,修 飾 さ れ た も の と元 の 天 然 の も の と を 重 ね 合 わ せ て 描 い た ヘ ム 近 傍 の 構 造 を 第5図(ア ー ト頁)に 示 す.こ の 図 で,2位 に か さ 高 い イ ソ プ ロ ピ ル 基 の あ る2-lp,4-Ip-Mb及 び2-イ ソ プ ロ ピ ル-4-ビ ニ ル ジ ュ ー テ ロ ヘ ム ミオ グ ロ ビ ン(以 下2-Ip,4-Vn-Mb)に お い て は,イ ソ プ ロ ピ ル 基 と の 接 触 を 避 け る た めPhe138の フ ェ ニ ル 基 が 大 き く そ の 向 き を 変 化 さ せ て い る の が わ か る.ま た,第 4表 のP50の 値 を み る と,2-Ip,4-Ip-Mbと2-Vn,4-Ip-Mbに お い て 著 し く大 き く な っ て 27.1-8

三 木邦夫,笠 井暢民 9

お り,そ の 他 の5種 が い ず れ も 天 然 の も の と比 べ て 小 さ い 値 を と っ て い る こ と と 対 照 的 に, 酸 素 親 和 性 の 低 下 を 示 し て い る.第5図 に 示 さ れ る よ うに,こ の 酸 素 親 和 性 の 低 下 す る 二 つ の も の で は,遠 位 ヒス チ ジ ン(His64)に 近 接 す るPhe43が2-Ip _{,4-Ip-Mb,2-Vn,4-Ip-Mb}

で そ れ ぞ れ 約0.7及 び0.4 ？is64に 近 づ く方 向 に 移 動 し て い る.加 え て2-Vn _,4-Ip-Mb で はHis64を 含 むEら せ ん 全 体(His64-Ala71)が ヘ ム か ら遠 ざ か る よ う に,大 き い と こ ろ で は1A近 く も 動 い て い る.こ れ ら は と も に 酸 素 が ヘ ム 鉄 に 結 合 す る と き にHis64が ヘ ム 方 向 へ 接 近 す る の を 妨 げ,オ キ シ状 態 を 不 安 定 化 す る た め に,酸 素 親 和 性 の 低 下 を も た ら し た と 考 え ら れ る.イ ソ プ ロ ピ ル 基 を ヘ ム に 持 ち な が ら酸 素 親 和 性 の 低 下 し な い2-Ip ,4-Vn-Mbに お い て は,こ の よ うに 特 徴 的 な 方 向 性 の 持 っ た 構 造 変 化 は 認 め られ な い. 3・3・3種 々の配位子がヘム鉄 と結合 したヘモグ ロビン,ミ オグ ロビン 広 義 に 考 え れ ば,ヘ ム の第 六 配 位 座 に 酸 素 以外 の配 位子 を結 合 させ る こ とも,ヘ ム 修飾 の 一部 とみ な す こ とが で き る.ま た,3.2節 の異 常 ヘ モ グ ロ ビ ンの うち,近 位 ヒス チ ジ ンが チ ロシ ンに 置 き換 わ って い るM型 ヘ モ グ ロ ビ ン(Hb M Iwate_{,Hb M Hyde Parkな ど)は 第} 五 配 位 座 の 修 飾 と考 え る こ とが で き る.第 六 配 位 座 に 酸 素 以 外 の配 位 子 が 結 合 した もの のX 線 解 析 例 を第5表 に ま とめ て示 す.導 入 され た 配 位 子 は 単 元 子,二 原 子,三 原 子 の もの,さ らに大 き い有 機 配 位 子 な どに 分 類 す る こ とが で き る. 第5表 ヘ ム鉄 に種 々 の配 位 子 を 結 合 させ た ヘ モ グ ロ ビン,ミ オ グ ロ ビ ンの 結 晶構 造 解 析 *IHP=inositol hexaphosphate **NでFeに 結 合 ***中 性 子 線 回 折 これ らのX線 解析 に よる研 究 は,主 に二 原 子 配 位 子 の結 合 した ヘ モ グ ロビ ンに お い て,自 動 酸 化 で メ ト型 に な りや す いた め に ご く最 近 まで 精 密 構 造 の 得 られ な か った オ キ シヘ モ グ ロ ビ ンに対 して の モ デ ル と して の意 義 が 大 きか った.配 位 子 の 結 合 した ヘ モ グ ロ ビ ンは いず れ も前 述 のR状 態 を と るが,そ の ヘ ム鉄 の ス ピ ン状 態,配 位 子 の鉄 へ の結 合様 式 は配 位 子 の種 類 に よ って 異 な って い る.た とえ ば,配 位 子 の鉄 の結 合様 式 は,COやCN-で は ほぼ ヘ ム の 法 線 軸 方 向 に 直 線 状 に 結 合 す るの に対 し,NOやN3-,NCS-で は 傾 きを 持 ち折 れ て(bent) 結 合 して い る.Moffatら は,こ の 配 位子 の結 合様 式 の違 い と結 合 の反 応 速 度 論 的 挙 動 との 関 係 を 議 論 して い る42).ま た,よ り大 き な イ ミダ ゾー ルや フ ェニ ルな どの 有 機 配 位 子 が 結 合 し た もの の構 造 で は,酸 素 化 の際 の酸 素 の反 応 経 路 を 推 測 で き る可 能性 を示 唆 して い る. 27.1-9

10 化 学 修 飾 ヘ モ グ ロ ビン ・ミオ グ ロ ビンの 構 造 と機 能 4.お わ り に 以 上,化 学 修 飾 され た ヘ モ グ ロ ビ ン,ミ オ グ ロ ビ ンのX線 結 晶 解 析 に よる研 究 を 概 観 した が,紙 数 の都 合 上,興 味 あ る構 造上 の 問 題 や そ の 他 の研 究 との関 連 な どに つ い て触 れ る こ と ので き なか った こ とが 多 い.こ れ らの 点 に つ い て は,各 節 で あげ た 多 くのす ぐれ た 成 書,総 説 で 補 っ てい た だ きた い.こ れ らの 研 究 は 歴 史 も長 く,か な りの 問題 が 明 らか に な った 一 方, まだ 議 論 の余 地 を 残 す 点 も多 くあ る よ うに 思 わ れ る. 3.3.3で 紹 介 した 修 飾 ミオ グ ロ ビ ンの 研 究 は,我 々の 研 究室 の 多 くの 共 同研 究 者 と共 に行 われ た もので あ り,加 え て京 都 大 学 工 学 部 吉 田研 究 室,長 岡 技 術 科学 大 学 生 越 研 究 室,大 阪 大 学 蛋 白質 研 究 所 角 戸 ・勝 部 研 究 室 と の共 同 研 究 で あ る.ま た,第1図 と第5図 を グ ラ フ ィ ックス で描 く際 に は,こ の プ ログ ラ ム シス テ ムVENUS4)の 開 発 者 で あ る大 阪 大学 蛋 白質 研 究所 結 晶 解 析研 究 セ ン タ ー安 岡則 武 博 士,伊 賀 祐 一 氏 の御 協 力 を い た だ い た.記 して 感謝 の 意 を表 します. 文 献

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