小葉腫瘍を基軸とした早期乳癌の発生、進展に

小葉腫瘍を基軸とした早期乳癌の発生、進展に 関する臨床病理学的、分子生物学的検討

かつらだ ゆか

桂田 由佳

（病理学専攻）

防衛医科大学校

平成 28 年度

目　次

第1章 背　景

1

第2章

4

2-1. 4

2-2. 4

2-2-1. 4

2-2-2.

5

2-2-3.

6

2-2-4.

7

2-2-5.

7

2-3.

7

2-3-1. 7

2-3-2.

8

2-4.

10

第3章

11

3-1. 11

3-2. 11

3-2-1. 11

3-2-2.

12

3-2-3.

12

3-2-4.

13

3-2-5.

14

3-3.

15

3-3-1. 15

3-3-2.

15

3-3-3.

16

3-4.

16

目　的

臨床的に見つかるLNsに関連する臨床病理学的パラメータ 対象症例、材料及び方法

臨床的に指摘されたLN、および早期浸潤を伴うLNの臨床病理学的特徴に関 する検討

DCIS成分とLN成分の混在した非浸潤癌成分を有する乳癌(混合型CISを伴う

目　的

対象症例、材料及び方法 対象症例

対象症例

臨床病理学的パラメータの比較

第4章

18

4-1. 18

4-2. 18

4-2-1.

18

4-2-2.

19

4-2-3. PIK3CA

20

4-2-4. 16q LOH検索 21

4-2-5.

23

4-2-6.

23

4-3.

24

4-3-1. 24

4-3-2. 16q LOHの検討 全般 24

4-3-3. 25

4-3-4. 26

4-3-5. IDC群における16q LOHの比較 26

4-3-6. 27

4-3-7. PIK3CA

27

4-4.

29

第5章

31

第6章

38

第7章

39

謝　辞

40

付　記

41

略語表

42

文　献

43

考　察

総　括

結　論 目　的

対象症例、材料及び方法

非浸潤癌と浸潤癌間でのallelic status共有症例の各群間の比較

小葉癌、乳管癌成分が混在する乳癌におけるPIK3CA遺伝子変異の病理学 的意義および、単一の腫瘍内に混在する小葉癌、乳管癌成分間の遺伝学的 関連性に関する検討

ILC群における16q LOHの比較 PIK3CA

混合群における16q LOHの比較

第

1

背 景

carcinoma in situ, LCIS）および異型小葉過形成（atypical lobular hyperplasia, ALH）が

1

^1,2)

LCIS

50％以上でみ

pagetoid

LCIS

50％未

^1-5)

ALH

LCIS

LN

い

^{1,5-7 ）}

5,8,9)

LN

lobular carcinoma, ILC）が同一の遺伝子プロファイルや対立遺伝子（またはアリル）の

^10-13)

2000

Perou

Sørlie

cDNA

luminal A、luminal B、HER2 enriched、basal-like、

normal-breast-like

5

intrinsic subtype

^{14,15 ）}

human epidermal growth factor receptor type 2（HER2）の発現状態と、乳癌細胞の増

Grade/核 Grade）により浸潤性乳癌を分

intrinsic subtype

luminal A subtype

16q

1q

16q

8q、17q、20q

^{16-20 ）}

LN

DCIS

粘液癌や管状癌のような低異型度な特殊型乳癌とも共存することが報告されている

1,21,22)

1q

た、低悪性度乳癌と共通のものであることが明らかになり

^{20, 23-26)}

low-grade breast neoplasm family

1

2） ^27,28)

しかし、偶然見つかる微小な病変を含め、すべての

LN

LN

LN

違点を明らかにすることを目的とし、第

2

LN、およ

LN

3

DCIS

LN

（混合型

CIS

4

PIK3CA

3）。

2

3~4

第２章

臨床的に指摘された

LN、および早期浸潤を伴う LN

2-1. 目 的

臨床的に指摘される

LN、浸潤癌に移行する可能性のある LN

2-2. 対象症例、材料及び方法

2-2-1. 対象症例

2002

12

4811

LN

88

62

LNs

LNs

10mm

62

46

LNs

41

LNs

5

LNs

LNs

DCIS、3

ILC、粘液

1

20

LNs

LNs

9

20

group）と定義され、LNs

LNs

他

42

LNｓ自身による臨床徴候を伴わず、オカルト

LNs

3

2-2-2.

10%ホルマリン溶液にて一晩固定し、翌日切り出しを施行した。切り出

25

4μm

核異型スコア（1、2、3）、LN部の組織分類（LCISないし

ALH）、高倍 10

Ki67 labeling index（Ki67 LI）を 2

²⁹⁾

核の大きさが均一なものをスコア

1、核の大小不同や核形不整が目立つものをスコア 3、

スコア

1

3

2、とし、核異型スコア 1

pagetoid

4

4

³⁰⁾

小葉が高度に拡張し、明瞭な結節を形成するもの、充実型は、腫瘍細胞が小葉の拡 張を伴いつつ充実性に充満するが、明らかな結節形成はみられないもの、置換型は 小葉の内腔が腫瘍細胞に大部分置換されているものの、小葉の拡張を伴わないもの、

そして

pagetoid

pagetoid

展するものとした。

62

20

42

8

54

ALH）、組織形態、核分裂数、同時同側乳癌の有無、Ki67 LI

2-2-3. 免疫組織化学法

切片に対し、キシレンによる脱パラフィン処理及び希釈系エタノールによる親水処理 を行った。TRSバッファー（DAKO社, Glostrup, Denmark）ないしは

pH6

121℃ 10

E-cadherin

Ki67

（clone MIB-1, 1:100; DAKO社）を使用した。一次抗体および、二次抗体（Envision,

DAKO

Dako

LNs19

ため、E-cadherinと

Ki67

2

5）。2

EnVision G/2

Doublestain System, Rabbit/Mouse

2-2-4. 免疫組織化学の評価

E-cadherinは細胞膜における免疫反応を評価対象とし、全例陰性であることを確認

Ki67は核における免疫反応を評価対象とし、最も染色細胞の多い領域で、高倍1

2重染色では、E-cadherin陰性の腫瘍細胞数とE-cadherin陰性かつKi67陽性の腫瘍細

2-2-5. 統計学的解析

Statview software

2

Fisher

討には

Welch

t

理学的パラメータの検索にはロジスティック回帰分析を使用した。P値が

0.05

2-3. 結 果

2-3-1.

LNs

有症候群とオカルト群の各パラメータの比較を表

1

41.5mm（10~100mm）、オカ

ルト群で

18.7mm（0.7~96mm）であり、有症候群で有意に大きかった。また、LNs

30mm

（65%、13/20）で有意に高かった（P < 0.001）。

平均

Ki67 LI

10.5%（1~38%）、オカルト群で 3.7%（0~26.1%）と、有症

核分裂数が多く、結節型、充実型の組織像を呈しやすいことが明らかになった（いず れも

P < 0.001）。オカルト群では、核異型スコア 3、結節型、核分裂像が高倍 10

2

1

5

41

有症候群の

5

3

LNs

30

7

43%

ロジスティック回帰分析の単変量解析を行ったところ、大きい腫瘍径、高い核異型、

結節ないしは充実型の増殖形態、核分裂像の存在、高い

Ki67 LI

LNｓの

2

5

30mm

1

10

Ki67 LI 10%

以上が、有症候の

LNs

2）。

2-3-2. 早期浸潤を伴う LNs

62

LNs

LNs（早期浸潤群）で、54

を伴わない （非浸潤群）であった（表 ）。平均患者年齢は早期浸潤群 歳

（38~77歳）、非浸潤群

53.0

有意差はみられなかった。平均腫瘍径は、早期浸潤群

59.0mm（22~96mm）、非浸潤

21.1mm（0.7~100mm）と、早期浸潤群で有意に大きく（P < 0.05）、腫瘍径が 30mm

LNs

87%、非浸潤群 24%、P = 0.001）。平均 Ki67 LI

13.4%（1.2~38.0%）、非浸潤群で 4.8%（0~26.1%）と、早期浸潤群で有意に高く（P < 0.005）、Ki67 LI 10%以上の例は早

38%、非浸潤群で 13%とこれも早期浸潤群で有意に高頻度であった（P <

0.005）。

Ki67 LI

LNs

2

30mm

10%以上のいずれも早期

4）。

早期浸潤群

8

5

LN

LCIS

8

ILC

5

4

IDC

1

DCIS

早期浸潤群

8

5

3

LCIS

LN

LCIS

P = 0.236

5）。

2-4. 小 括

LNs

10mm

LNs

(1) 有症候群は、オカルト群に比べ、腫瘍径が大きい、核異型スコアが高い、核分裂

高倍

10

Ki67 LI（≧10%）が、臨床的に見つかる LNs

(2)

LNs

Ki67 LI（≧10%）

が、早期浸潤を伴う

LNs

(3)

LNs 8

5

3

LNs

LNs

第

3

DCIS

LN

CIS

の臨床病理学的特徴

3-1. 目 的

DCIS

LN

CIS

癌）の臨床病理学的パラメータを、その他の乳癌と比較することで、その臨床病理学的 特徴を明らかにする。

3-2. 対象症例、材料及び方法

3-2-1.

513

391

CIS

28

363

CIS

DCIS

LN

DCIS

LN

E-cadherin

E-cadherin

LN

3-2-2.

15%中性緩衝ホルマリン溶液にて一晩固定し、翌日切り出しを施行し、

パラフィン包埋した。各ブロックとも

4μm

各症例につき、腫瘍径、浸潤径、核グレード、リンパ節転移の有無、ER発現の有無、

PgR

2

CIS

核グレードは乳癌取扱い規約

²⁹⁾

1～3

（核が均一：1点、スコア

1

3

と核分裂像スコア

1

3

10

5

1

5

10

2

11

3

1、4

2、5～6

3

が腫瘍の

75%

25~75%

extensive intraductal component,

EIC（+）の癌］、25%未満［EIC（－）の癌］の 3

なお、3例（混合群

1

2

2

Paget

3-2-3. 免疫組織化学法

京）に浸した状態で

100℃ 60

1

E-cadherin

USA）、マウス抗ヒト Ki67

ER

SP1, Roche Diagnostics

PgR

Diagnostics

HER2

Diagnostics

E-cadherin

Ki67

MAX-PO（MULT）およ

DAB

2

（HISTOSTAINER48A、ニチレイ）を用いた。ER、PgR、HER2の

2

I-VIEW DAB

BENCHMARK XT

Roche

Diagnostics

1

3-2-4. 免疫組織化学の評価

E-cadherinの免疫染色は混合群28例で施行した。E-cadherinは細胞膜における免

Ki67免疫染色は混合群28例とその他群338例、計366例で施行した。Ki67免疫染

腫瘍細胞数をカウントし、陽性細胞比率（

Ki67 LI

ER、PgR免疫染色は混合群28例とその他群360例、計388例で施行した。ER、PgR

1点：0~1%未満、2点：1~10%未満、3点：10~33%、4点：34~66%、5点：>66%）、染色強

6） ^{31 ， 32 ）}

HER2免疫染色は混合群26例とその他群333例、計359例で施行した。HER2免疫

32

Paget

1mm

/

ASCO/CAP

7） ^{33 ）}

3-2-5. 統計学的解析

2

Fisher

Welch

t

0.05

3-3. 結 果

3-3-1. 臨床病理学的パラメータの比較

6

391

混合群の平均腫瘍径は

50.1mm（8~150mm）、その他群の平均腫瘍径は 37.0mm

（4~130mm）で、混合群はその他群に比べ、有意に腫瘍径が大きく（P < 0.05）、有意 差は認めなかったものの、浸潤径が小さい傾向がみられた。また、混合群は

28

18

64%

1

361

147

1

Ki67 LI

14%とその他群の 24.6%に比べて有意に

Ki67 LI < 20％である luminal A subtype

28

21

360

146

luminal A subtype

3-3-2. 乳管内成分の割合の比較

乳管内成分の割合を比較した結果を表

7

4

（

14%

5

18%

9

32%

10

36%

64%に及ぶのに対し、その他群ではそれぞれ 30

（8%）、22例（6%）、84例（23%）、227例（63%）で、前

3

37%にとどまり、

両群間に有意差が認められた（P < 0.05）。

3-3-3. 主診断組織型の比較

両群の主診断部の組織型を表

8

17

269

IDC269

DCIS

LN

4

30

CIS、その他

DCIS

混合群は

IDC

7

2

ILC

1

64

18%と、有意差はみられないものの混合群より低頻度で、

組織型も

ILC、管状癌、粘液癌、アポクリン癌だけでなく、髄様癌や基質産生癌、化生

癌（扁平上皮癌、骨軟骨化生を伴う癌、紡錘細胞癌）などの高異型度乳癌も散見され た。

3-4. 小 括

DCIS

LCIS

CIS

(1)

Ki67 LI

(2)

(3)

有意差は認められなかった。また、混合群の特殊型は

ILC

以上から、混合型

CIS

浸潤部は、大部分がホルモン受容体陽性で増殖能が低い、いわゆる

luminal A

subtype

IDC

の特殊型乳癌の形態も呈し得ることがわかった。

第

4

小葉癌、乳管癌成分が混在する乳癌における

PIK3CA

に関する検討

4-1. 目 的

第

16

PIK3CA

4-2. 対象症例、材料及び方法

4-2-1. 対象症例

2010

1

2016

3

DNA

12

DNA

ILC 9

13

1

12

9

ILC

LN、DCIS、IDC

IDC 13

20%未満の luminal A subtype

これら

34

12

ILC、

IDC

4-2-2. 細胞採取と DNA

10 µm

スライドグラスに乗せて乾燥させたのち、パラフィン切片はキシレンによる脱パラフィン 処理及び希釈系エタノールによる親水処理を行った。続いて

HE

PENfoil

MembraneSlides（Leica

HE

LN

DCIS

ILC

IDC

MembraneSlides（Leica

HE

DNA

NucleoSpin Tissue

MACHEREY-NAGEL

社、Duren、Germany）を用い、DNA抽出を行った。

4-2-3. PIK3CA

PIK3CA変異の大部分は、hot spotであるexon 9（E542、E545およびQ546）ないし exon 20（H1047）で生じるため、過去の論文 ^{34 ）}

（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参考にし、これらの領域を含むプライマーペア配列 をそれぞれデザインし、FASMAC社（厚木、神奈川県）にて精製依頼・購入した。

PIK3CA exon 9およびexon 20のプライマー配列は以下のとおりである。

exon 9: forward primer 5’-CCAGAGGGGAAAAATATGACAA-3’

reverse primer 5’-ACCTGTGACTCCATAGAAA-3’

exon 20: forward primer 5’-CTCAATGATGCTTGGCTCTG-3’

reverse primer 5’-AATTGTGTGGAAGATCCAATCC-3’

PCR

DNA

GeneAmp PCR system 9600

（Applied Biosystem社）を用い、1μlの

DNA

& reverse

0.63 U

AmpliTaq Gold DNA polymerase

Applied Biosystems

200 μM

dNTP、及び 4 mM

MgCl ₂

25 μl

DNA

72 °C 40

72 °C 5

度は、exon 9が

55

60

PCR

forward primer

DNA

Sequence labeling

Xterminator（Applied Biosystem

ABI 3500xL system（Applied Biosystems

DNA sequence

Sequencing Analysis

4-2-4. 16q LOH

^{35, 36 ）}

による当該染色体領域の遺伝子増幅産物が250塩基長未満と推定される、染色体16q に位置する

5

polymorphic marker

Web上のゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照し、それぞれの polymorphic markerに対するプライマーペア（forward & reverse）配列をデザインし、

Perkin-Elmer

Applied Biosystems

forward

5′

16q領域に存在する5種のpolymorphic markerを以下に示す： 16q22.1（D16S265）;

16q22.1（D16S752）; 16q22.1（D16S3025）; 16q24.1（D16S393）;

（D16S402）。これらのプライマーの配列は以下のとおりである。

D16S265: forward primer 5’-CCAGACATGGCAGTCTCTA-3’

reverse primer 5’-AGTCCTCTGTGCACTTTGT-3’

D16S752: forward primer 5’-AATTGACGGTATATCTATCTGTCTG-3’

reverse primer 5’-GATTGGAGGAGGGTGATTCT-3’

D16S3025: forward primer 5’-TCCATTGGACTTATAACCATG-3’

reverse primer 5’-AGCTGAGAGACATCTGGG-3’

D16S393: forward primer 5’-GAGGACATTTATTCATAGGAAGGAGG-3’

reverse primer 5’-CGACTCTAGAGGATCCCAGACTTCG-3’

D16S402: forward primer 5’-TTTTGTAACCATGTACCCCC-3’

reverse primer 5’-ATTTATAGGGCCATGACCAG-3’

PCR

DNA

PCR

polymorphic marker

95 °C 11

DNA

72 °C 5

PCR

GeneScan-500LIZ size standard

Applied Biosystems

ABI 3500xL system（Applied Biosystems

DNA

PCR

2

polymorphic marker

LOH

（informative）と解釈した。非腫瘍性組織における

2

2

0.67

1.35

8）。一方これらの泳動ピーク比が

0.67~1.35

LOH

れた。

該当領域はhomozygousであると判定し、評価不能とした。また、PCRにてゲノムDNA の増幅が得られない場合、あるいはPCRによる増幅は得られるものの、明らかな泳動

ピークを形成しない場合についても評価不能とした。

4-2-5. 複数の腫瘍病変間におけるクローナリティの推定方法

2

1、腫瘍 2

16q LOH

（probability, P）を算出し、複数の腫瘍病変間におけるクローナリティの有無を推定す ることとした。P値は、Fisherの正確検定をもとに

Begg

³⁷⁾

Concordant mutations test

0.05

混合群で

3

1、腫瘍 2、腫瘍 3）の腫瘍成分がみられる場合は、それぞ

1

2、腫瘍 2

3、腫瘍 1

3）での上記のクローナリティ推定を行っ

4-2-6. 統計学的解析

LOH

PIK3CA

2

いし

Fisher

0.05

ありと判定した。

4-3. 結 果

4-3-1. PIK3CA

PIK3CA

9

1

13

5

12

7

10）。統計学的有意差はみられなかったものの、混

合群での

PIK3CA

ずれも

exon 9

exon 20

hot spot

11）。各群とも変異部位に偏り

混合群で変異のみられた

7

4

3

MIX1

3

（DCIS、IDC）のみに、MIX7では小葉癌成分（LN、ILC）のみに変異がみられた。乳 管癌、小葉癌成分に同一の変異がみられた症例と、いずれかのみに変異がみられた 症例を形態学的に鑑別することは困難であった（図

9、図 10）。

4-3-2. 16q LOH

ILC

5

16q LOH

9

13

12

1

IDC

1

1

locus

LOH

ILC

8

IDC

12

10

12

1

LOH

例；93%）。

4-3-3. 混合群における 16q LOH

混合群

12

locus

170 loci

109 loci（LN 35 loci、DCIS 33 loci、ILC 17 loci、IDC 24 loci）であった。情報の得られた locus

LOH

60%（21/35 loci）、DCIS

97%（32/33 loci）、ILC

71%（12/17）、IDC

で

92%（22/24）であり、非浸潤癌成分（LN+DCIS）と浸潤癌成分間（ILC+IDC）に有意

差はみられなかったものの（

P = 0.63

LN

DCIS+ILC+IDC

12

2

LN

10

1

LOH

MIX1、4、5、6、10、12

6

1

LOH

4

11）。MIX2、8、11

LOH

合性が保持されており、異なるクローンの可能性とクローン進化の可能性の両方が考 えられた。また、MIX9では小葉癌成分と乳管癌成分で異なった

LOH

各成分が互いに異なるクローンの可能性が高いと考えられた。

4-3-4. ILC

16q LOH

ILC

9

locus

90 loci

46 loci（非浸潤部 18 loci、浸

28 loci）であった（図 11）。これらの locus

LOH

67%（12/18 loci）、浸潤部で 89%（25/28 loci）であり、有意差はみられなかったものの

（P = 0.12）、浸潤癌で

LOH

9

3

6

1

2

（

ILC6

8

1

LOH

4

LOH

4

尐なくとも

1

LOH

4-3-5. IDC

16q LOH

IDC

13

locus

130 loci

73 loci（非浸潤部 37 loci、

浸潤部

36 loci）であった（図 11）。情報の得られた locus

LOH

78%（29/37 loci）、浸潤部で 64%（23/36 loci）と有意差はみられず（P = 0.2）、

各マイクロサテライトマーカーにおける浸潤部と非浸潤部の

LOH

非浸潤部のみの

LOH

5

LOH

例中 例（ 、 、 ）では、尐なくとも か所のマイクロサテライトマーカ

ーにおいて、LOHが認められ、10例全例において、尐なくとも

1

LOH

4-3-6.

allelic status

非浸潤部と浸潤部の両成分から

allelic status

allelic status

LOH

56%（10/18

86%（31/36

48%（16/33）であり、ILC

IDC

P < 0.05

ILC

4-3-7. PIK3CA

16q LOH

Concordant mutations test

LN

2

10

3

LN

IDC

= 0.02）、LN

DCIS、DCIS

IDC

（それぞれ

P = 0.19、0.08）。2

LOH