博 士 （ 薬 学 ） 吉 永 壮 佐
学位論文題名
Solution structures and classification of novel protein binding modules ，the PBl domain ● ●
and the PC motifcontalnlngreg10n
（新規夕ンパク質結合モジュールPB1 メイドと PC モ チ ー フ 含 有 領 域 の 溶 液 構 造 と 分 類 ）
学位論文内容の要旨
【序論】
近年，新規に見出さ れたPB1ドメインは，酵母から高等植物，ヒトに至る広い生物種の 様々な細胞内シグナル伝達夕ンパク質に含まれる機能モジュールである．PB1ドメインば，
酸性残基に富んだ28残 基からなる配列相同領域(PCモチーフ）を認識する，しかし，そ の結合には，PCモチー フの前後の，有意な相同性が見られない領域を含む80‑100残基の 領域(PC motif‑containing l:egion: PCCR)を必要とする．新規のタンパク質結合モジュしル で あるPB1ドメ イ ンとPCCRの特 徴付 けを 立体 構造 に基 づいて行うことは，細胞内シグ ナル伝達機構を理解する，あるいは応用する上で重要である．
我々のグループは， 以前，出芽酵母の細胞極性の確立に必須な足場夕ンバク 質Bemlp に 含ま れるPB1ド メイ ンと その 結合 バー トナ ーで あるCdc24p (Cdc42pのGDP/GTP交換 因 子） に含 まれ るPCCRのNMR解 析を 行っ た． その 結果 ，PB1ドメ イン の立 体構 造を決 定し，ユピキチン様の フオールド（基本構造）をとることを示したが，PCCRの立体構造 決定には至らなかった．
本研究では，Cdc24pのPCCRの立体構造決定，および，ヒト好中球にIよる活性酸素産 生の活性化因子であるp67 p,'oxのPB1ドメインとp40 phoxのPCCRの複合体のNMR解析を 行った．
【 出 芽 酵 母 細 胞 極 性 決 定 系 Cdc24pのPCCR (780ー854)の 立 体 構 造 決 定 】 コ ンス トラ クト は， 以前 同定 され た，BemlpのPB1ドメインとの結合能を有する領域 (780‑854)を 採用 した ．NMR法を 用い て立 体構造を決定した．全体構造は，4本のBスト ラ ン ドか らな るロ シー トと2本 のaへ ルッ クスで構成されている，PCモチーフ部分は，
おBaの二 次構 造を とる コン バク トな 立体 構造をとり，PCモチーフ間で保存されている チ ロシンがその構造コアとなっている，また，フェニルアラニンがロシート上に覆い被さ る こ と と コ ン セン サス 配列 のDEDGD部分 が タイ プI十Glロバ ルジ とい う 特有 のタ ーン 構 造を形成することによってロシートに歪みが生じている．そのため，夕ーンに位置する さ れ た酸 性残 基が 同一 方向 に提 示さ れて いる．これらの酸性残基はBemlpのPB1ドメイ ン との相互作用に必須であることが以前示されている．
また，立体構造上相同性を有するタンパク質を検索した 結果，結合バートナーである BemlpのPB1ド メイ ンを はじ め， ユビ キチ ン様のフォールドをもつタンパク質群と相同 ―792−
性を有していた ．PCモチーフに相当する領域は，上記フオールドにおいて多様性に富む 領域であり，PCCR特有の立体構造をとっている．また，上記フオールドにおいて，最初 のロストランド は最後のロストランドと平行ロシートを形成するのが特徴であるが，最初 のロストランド に相当する領域は解析に用いたコンストラクトには含まれていなかった．
【 出 芽 酵 母 細 胞 極 性 決 定 系Cdc24pの PCCR (761‑854)の 立 体 構 造 決 定 】 天然 のPCCRが ュピ キチ ン 様の フォールドをとるか確かめるため，N末端側を伸長した コ ンス 卜ラ クト(761‑854)を採 用し て立 体構 造決 定をNMR法 にて行った．その結果，、
(761‑854)で は，(780‑854)の最 初と 最後 のロ スト ラン ドの 間にN末端 側に 伸ば した 領 域 が割 り込み，ユビキチン様のフォールドをとることが立 体構造上示された．PCモチー フ 部分 の立体構造はほとんど変わらず，新たに伸長した配 列は，相互作用部位であるPC モ チ ー フ 部 分 を 保 持 す る 裏 打 ち 構 造 を 強 化 し て い る と 考 え ら れ る ． BemlpのPB1ド メ イ ン と の 結 合様 式を 知る ため ，Cdc24pのPCCRのア ミノ 酸置 換に よ る結合能への 影響をin vitroのプルダウン法で調べた．また，この結果とタンパク質表面 の 電 荷 分 布 や 疎 水 性 分 布 の 相 補 性 を 考 慮 し て そ れ ぞ れ の 結 合 面 を 予 測 し た ．
【ヒト好中球活性酸素産 生系p67P＾¨のPB1ドメインとp40 phoxのPCCRの複合体の立体構 造解析】
それ ぞれの二次構造トポロジーをNOEに基づく水素核間距離情報と重 水素交換実験に 基づく水素結合情報から得た．ともにユビキチン様のフオールドをとるが，両者で二次構 造，ループやターンの長 さが異なる．p40P＾ のPCモチーフ部分の骨格構造はCdc24pと ほとんど同じであることが示唆された．さらに，p40 pho はユピキチン様のフオールド外の C末端側10残基程度が立体構造をとって，p67 pho.rと特異的な相互作用をしていることが 示唆された．
【Pblドメインの分類】
PB1ドメイ ンとPCCRは全て同一のユビキチン様のフオールドをとっ ており，その一部 の相同性の 高い領域をPCモチーフと特別に呼んでいたことになる．立体構造に基づぃて アミノ酸配 列を並べたところ，全体で10‑20％の低い相同性ながら配列アラインメントを とることが できた．保存されている疎水性残基のほとんどは二次構造に含まれており，こ れらの残基 はユビキチン様のフオールドを形成するために必要であることを示している．
以 上の こと から ，PB1ドメ インとPCCRと 呼んでいた二，つのドメインをPB1ドメインの 名でまとめ ることにした，そのため，PB1ドヌインの機能は特定のPB1ドメイン同士で異 種二量体を 形成することと言える．また，結合面に関して，Cdc24pのようにPCモチーフ 部 分を 用い るも のと ，Bemlpの よう にロ1，ロ2， ロ5とalのC末端側 を用いるものがあ る．よって ，PB1ドメインは互いに異なる部位を用いて非対称的に異種二量体を形成する と言うこと ができ，Cdc24pのような結合面をもつp40 phox，aPKCなどをタイプI，Bemlp のような結合面をもつp67 po.r，p62／ZIP，PAR‑6などをタイプIIと分類した．なお，現在 150個 程 のPB1ド メ イ ン を 含 むタ ンバ ク質 がデ ー タベ ースSMARTに 登録 され て いる ．
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 稲 垣 冬 彦 副 査 教 授 加 茂 直 樹 副 査 助 教 授 三 宅 教 尚 副 査 助 教 授 森 岡 弘 志
学位論文題名
Solution structures and classification of novel protein binding modules ，the PBl domain and tlie PC motifcontaining region
（新規夕ンパク質結合モジュールPB1 メイドと PC モチーフ含有領域の溶液構造と分類）
シグナル伝達蛋白質は多くの機能ドメインから構成されていることが特徴である。これ ら の機能 ドメインの多くは80―200残基程度から構成されており，構造ドメイシとしても 同 定され ている。NMRによる構造生物学的な研究は，これらのドメインの構造を明らかに するとともに，シグナル伝達におけるドメインの機能について，明確な結論を与えた点で 重 要な役 割を果た してる 。今回， 吉永壮 佐君が研 究対象と したPB1ドメイン，PCモチー フ は 酵 母 の極 性 維 持に 関 与 して いるBeml，Cdc24，好中球 活性酸 素発生系 細胞質 因子 p67phox. p40,カ oxに見出された機能ドメインである．PCモチーフは28残基の特徴的な酸性 残基と疎水性残基の繰り返し配列として最初に同定され，その後，PCモチーフの結合相手 と し てPB1ド メ イン が 新 たに み いだ された 。その後 ，aPKCやPARの系に もPB1ドメイ，
PCモチーフが見出され，一般的に細胞極性維持に関与した機能を果たしていることが明ら かにされている。吉永壮佐君はまず，Cclc24に含まれるPCモチーフを対象として構造研究 を 開 始し7 Ctwo‑hybridに よりPCモチ ー フ のみ で はPB1と の 結合 に 不 十分 で あ り，
PCモ チ ち響 響 瀦 域75懾 基くPCCRに つ いて 構 造 決定 を 行 っ た。興 味深いこ とに，PCモ チーフはロヘアピンおよびC末端側ヘリックス構造をとってコア構造上に提示されていた。
Daliをもちい てPDBに登録さ れた構造 に基づ いて，PCCRに類似し た構造をサーチした結 果 ，BemlpのPB1ド メイ ン と 類似 した 構造を とること がわか った。PB1ドメイ ンはユ ビ キ チンと 類似した 構造を とるが，PCCRは典型 的なユビ キチン フオールドと比較して，N 末 端側ヘ リックスの欠如が見られた。そこで，N末端側に20残基ほど伸ばしたコンストラ ク 卜(PCCRL)に つ いて 構 造 解析 を 行 った 。PCCRLはN末 端 側 に新 た な ロシ ー ト が形 成 され，C末端側のロ鎖とパラレルなシートを形成し，典型的なユビキチンフオールドを取る
、ことが明らかと成った。また，NMRスペクトル上，ロシー卜形成に関わる残基は大きな化 学 シフト 変化を示 したの に対し，PCモチーフ上の残基はPCCRと比較し，ほとんど変化は な かった 。以上の 結果は ，配列上 の相同 性は10％程 度と低 いにもかかわらず，PCCRLは PB1同様 にユビキチンスーパーフオルドをとることを示している。また，PCモチーフは構 造 モチー フであり，ユビキチン骨格の上に提示され，PB1ドメインとの相互作用部位とし て使われていることを明らかにした。蛋白質はユビキチンフオールドというありふれたフ オールド上に相互作用部位を提示することにより，多様な蛋白質問相互作用を生み出した と考えられる。
つ いで， 変異実験 を組み 合わせてPB1ド メインとPCCRLの 相互作用 部位を同 定した 。 PCCRおよ びPCCRLでは ，PCモ チ ーフ の構造 はきわめ て類似 しており ，結合に 必須な 酸 性残基は一方の面に提示していた。変異体実験の結果を構造上にマップした結果，PCモチ ーフを中心とする相互作用面を明らかにした。同様な解析をp67phox, p40phoxの構造解析と ‑ 794―
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