サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート 小林 英夫 顕微鏡観察だけでなく、定量的解析から見える事 顕微鏡観察だけでなく、定量的解析から見える事 顕微鏡観察だけでなく、定量的解析から見える事 顕微鏡観察だけでなく、定量的解析から見える事 ～ ～ ～ ～ハイコンテントアナリシスハイコンテントアナリシスハイコンテントアナリシスハイコンテントアナリシスのメリット～のメリット～のメリット～のメリット～
顕微鏡観察時に苦労していることはありませんか？
• 観察前の操作 • 細胞の状態、染色方法 • 観察時・観察後の操作 • 撮影した画像をどのように解釈すべきか。 • 細胞によって表現系（形状、発現）が異なるため、どの細胞を選択して撮影す べきか判断に困る。 • 感度、褪色の影響。観察前の操作
• 細胞の状態や染色方法 • 実験条件の検討 細胞の播種条件、培養器の素材・コーティング、各試薬の濃度、インキュベー ション時間など このような条件検討の際にも、コントロールを用意して 顕微鏡撮影をおこない、有意な差がみられる条件を探していく。観察時・観察後の操作
• 撮影した画像をどのように解釈すべきか。 • いろいろな視野を観察し、撮影後のことを考えながら、視野を選 んで撮影している。 • 観察・撮影にとても時間がかかる。 • サンプル間で何となく差があるようだが、視野によっても異なるの で何とも言えない。 → どう報告しようか・･･。 • 観察者の主観が入る。 • 撮影すべきか考えているうちに 蛍光シグナルが弱くなってしまう。ケース１
ケース２
ケース３
• たくさん写真を撮影し、母集団を増やして検証したい。
それはそれで収拾がつかなくなる。 どのように有意差を求めるか？
顕微鏡画像の 情報を数値化 さまざまな数値 さまざまな数値 さまざまな数値 さまざまな数値データをデータをデータをデータを取得する取得する取得する取得する
細胞イメージからどのような数値データが取れますか？
個数 面積 蛍光強度画像解析ソフトウェア ImageJ など さまざまな数値 さまざまな数値 さまざまな数値 さまざまな数値データをデータをデータをデータを取得する取得する取得する取得する
細胞イメージからどのような数値データが取れますか？
サンプルが１枚の時 個数 ： 30個 面積平均： 1000 px2 蛍光強度： 10,000細胞イメージからどのような数値データが取れますか？
複数枚、複数サンプルに及ぶと、 全ての画像に対して 数値化し、統計解析。 とても大変、別の視点での解析が行いにくい とても大変、別の視点での解析が行いにくい とても大変、別の視点での解析が行いにくい とても大変、別の視点での解析が行いにくい一つ一つの細胞 一つ一つの細胞 一つ一つの細胞
一つ一つの細胞 ⇔⇔⇔⇔ 一つ一つデータと連動一つ一つデータと連動一つ一つデータと連動一つ一つデータと連動
ハイコンテントアナリシス
(High Content Analysis, HCA)
ハイコンテントアナリシス
(High Content Analysis
、
HCA)
• 定義
• 蛍光標識された細胞の画像イメージを取得し、細胞個々の蛍光情報／形態
情報から、統計学的な解析を自動的に行うアッセイ方法
• ハイコンテントアナリシスを利用したスクリーニングを ハイコンテントスクリー
ニング (High Content Screening, HCS) と呼びます。
• 機械そのものは 細胞イメージアナライザーと呼びます。
• Image Analyzer ⇔ High Content Analysis, High Content Screening
• Thermal Cycler ⇔ PCR
• 撮影条件・解析条件さえ設定すれば、自動的に撮影および解析 を行います。
細胞イメージアナライザー 細胞イメージアナライザー 細胞イメージアナライザー 細胞イメージアナライザー ３つの測定機器の長所を兼ね備えた機器 機器 機器機器 機器 特徴特徴特徴特徴 制約制約制約制約 顕微鏡 多重染色サンプルの観察 ができる。 細胞の形態、分子の細胞 内局在などが確認できる。 定量性が低い。 統計解析が困難。 プレートリーダー 定量性が高い。 簡単、迅速に測定できる。 多重染色ができないため、 複数分子の同時確認ができ ない。 フローサイトメトリー 定量性が高い。 細胞のポピュレーション解 析ができる。 多重染色ができる。 細胞を懸濁する必要がある。 細胞の形態や分子の細胞 内局在などが確認できない。
他の機械との比較
HCA
使用例：
Cell Viability
Nuclear Stain Nuclear Stain Nuclear Stain Nuclear Stain 生細胞 生細胞 生細胞 生細胞////死細胞染色死細胞染色死細胞染色死細胞染色 核 核核核：：：： Hoechst 33342 (Hoechst 33342 (Hoechst 33342 (Hoechst 33342 (青青青青))))
生細胞 生細胞生細胞
生細胞：：：： CaCaCaCaｌｌｌｌcein AM (ceinceincein AM (AM (AM (緑緑緑緑))))
死細胞 死細胞死細胞
死細胞：：：： PropidiumPropidiumPropidiumPropidium Iodide Iodide Iodide Iodide ((((赤赤赤赤))))
― ― ― ―緑色（生細胞）緑色（生細胞）緑色（生細胞）緑色（生細胞） ― ― ― ―赤色（死細胞）赤色（死細胞）赤色（死細胞）赤色（死細胞） －両方染色 －両方染色 －両方染色 －両方染色 核染色 核染色 核染色 核染色 1 Well
Analyzed Image Raw Image Hoechst 33342で染色された核の蛍光強度を 測定し、各細胞を2n ～4n に分類 （核の蛍光強度 ≒ 染色体量） 2n 4n 死細胞 死細胞 死細胞 死細胞 アポトーシス アポトーシス アポトーシス アポトーシス 細 胞 数 細 胞 数 細 胞 数 細 胞 数 G0/G1期期期期 S期期期期 G2/M期期期期 凝集した細胞 凝集した細胞凝集した細胞 凝集した細胞 他倍体化した細胞 他倍体化した細胞 他倍体化した細胞 他倍体化した細胞
HCA
使用例：
Cell Cycle
核の蛍光強度 （DNA量） EdU染色の蛍光強度 （S期細胞の判定） 核の蛍光強度 （DNA量） E d U 染色の蛍光強度 （ S 期細胞の判定） A549 細胞の細胞周期の解析GFP-ββββ-Arrestin の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量
HCA
使用例：スポットの検出１
GFPを融を融を融を融合した合した合した合したβ-Arrestin は、は、は、は、 Vasopressin を投を投を投を投与すると与すると与すると与すると 顆粒状に観察される。 顆粒状に観察される。 顆粒状に観察される。 顆粒状に観察される。 Control Untreated Vasopressin 30 min Treated Vasopressin•
HCA
使用例：スポットの検出１
Control Untreated Vasopressin 30 min Treated GFP-ββββ-Arrestin の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量の細胞内スポットのカウントと定量 １ 細胞あ た り のス ポ ッ ト 数 Vasopressin の濃度HCA
使用例：スポットの検出２
EGF-EGF Receptor の細胞内の細胞内の細胞内の細胞内インターナリゼーションとインターナリゼーションとインターナリゼーションとインターナリゼーションと ERK(MAPK) の核への移行の核への移行の核への移行の核への移行 EGFERK
EGF
ERK・EGFEGFEGFEGF は EGF Receptor と 結合し、インターナリゼーションを起こす。 ⇒ 橙色橙色橙色橙色： スポットの個数や蛍光強度を定量。
・ERKERKERKERK が活性化し、核内へ移行する。
HCA
使用例：スポットの検出２
Nucleus
Hoechst 33342 (対比染色対比染色対比染色対比染色)ERK
抗体染色 抗体染色 抗体染色 抗体染色 (核内の蛍光強度核内の蛍光強度核内の蛍光強度核内の蛍光強度)EGF
Texas Red-EGF (スポットの個数、スポットの個数、スポットの個数、スポットの個数、 蛍光強度 蛍光強度 蛍光強度 蛍光強度)1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05
1.0E+04 1.0E+05
ERK (circ total intensity)
E G F ( ri n g s p o t to ta l in te n s it y ) 0 minutes 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+04 1.0E+05
ERK (circ total intensity)
E G F ( ri n g s p o t to ta l in te n s it y ) 0 minutes 5 minutes 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+04 1.0E+05
ERK (circ total intensity)
E G F ( ri n g s p o t to ta l in te n s it y ) 0 minutes 5 minutes 15 minutes 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+04 1.0E+05
ERK (circ total intensity)
E G F ( ri n g s p o t to ta l in te n s it y ) 0 minutes 5 minutes 15 minutes 30 minutes ERK E G Fイ ン タ ー ナ リ ゼ ー シ ョ ン イ ン タ ー ナ リ ゼ ー シ ョ ン イ ン タ ー ナ リ ゼ ー シ ョ ン イ ン タ ー ナ リ ゼ ー シ ョ ン ( 橙 色 ： ス ポ ッ ト の総 蛍 光強 度 橙 色 ： ス ポ ッ ト の総 蛍 光強 度 橙 色 ： ス ポ ッ ト の総 蛍 光強 度 橙 色 ： ス ポ ッ ト の総 蛍 光強 度 ) 複数分子の 複数分子の 複数分子の 複数分子の 局在変化を 局在変化を 局在変化を 局在変化を 同時解析 同時解析 同時解析 同時解析
HCA
使用例：スポットの検出２
核染色 Anti-Tubulin
Hoechst染色
⇒ 全細胞の核 (nuclear) を認識
anti-Tubulin + 二次抗体
結果： 結果：結果： 結果： • 平均細胞質面積の減少 • 2種類のキナーゼ阻害剤(青)、 (赤) を高濃度で添加した場合、 神経突起はほとんど見られなか った。 • dopamine (緑) とThyroxine (紫) の結果は、コントロールと 類似。 平均 平均平均 平均 細胞質面積細胞質面積細胞質面積細胞質面積 神経細胞あたりの神経細胞あたりの神経細胞あたりの神経細胞あたりの神経突起本数神経突起本数神経突起本数神経突起本数 撮影視野あたりの 撮影視野あたりの 撮影視野あたりの 撮影視野あたりの総神経突起長総神経突起長総神経突起長総神経突起長 撮影視野あたりの撮影視野あたりの撮影視野あたりの撮影視野あたりの神経突起分岐点数神経突起分岐点数神経突起分岐点数神経突起分岐点数
HCA
使用例：神経突起の伸長
実験： 実験：実験： 実験： 以下の薬剤を処理後 7日目に染色し、 HCA機で撮影・解析SU6656: Src family Kinase阻害剤阻害剤阻害剤阻害剤
Bis-1: PKC 阻害剤阻害剤阻害剤阻害剤
Dopamine: 神経伝達物質神経伝達物質神経伝達物質神経伝達物質
HSF-6 human embryonic stem cells growing on a feeder layer of mouse embryonic fibroblasts
HCA
使用例：
ES
細胞のコロニー解析
1. 核染色を用いてコロニーを認識 • 密集した細胞は 一つの塊として認識させる。 • その面積が小さいものは除外。 （フィーダー細胞が除外される） 2. コロニーのみを解析 • サイズ • 細胞数 (核染色) • 未分化の細胞数（anti-Oct4） • 分裂中の細胞数（anti-phospho Histone H3) フィーダー細胞(MEF) ヒトES細胞(HSF-6)Channels 1- 2 Channel 3 Channel 4
HCA
使用例：
ES
細胞のコロニー解析
コロニーの認識 コロニーの認識 コロニーの認識 コロニーの認識 フィーダー細胞の除外 フィーダー細胞の除外 フィーダー細胞の除外 フィーダー細胞の除外 細胞数をカウント 細胞数をカウント 細胞数をカウント 細胞数をカウント 未分化の細胞をカウント 未分化の細胞をカウント未分化の細胞をカウント 未分化の細胞をカウント 分裂中の細胞をカウント分裂中の細胞をカウント分裂中の細胞をカウント分裂中の細胞をカウントまとめ
•
イメージング画像から定量解析を行うことにより、
• 客観的なデータを得ることができます。 • 統計学的に解析できます。 • 細胞内の局在やトランスロケーションなどの解析も簡単です。•
今まで見えなかったものが見えてきます。
•
日々の研究にも活躍する実験手法です。
本セミナー終了後、ご不明な点などがございましたら、
テクニカルサポートまでご連絡ください。
電話 0120-477-392
E-mail jptech＠lifetech.com
Web http://www.lifetechnologies.com/
ご清聴ありがとうございました
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