Title
P-tert-Octylphenolのラット生殖内分泌機構および子宮への作
用機序に関する研究( 内容の要旨 )
Author(s)
勝田, 真一
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 乙第040号
Issue Date
2000-09-26
Type
博士論文
Version
publisher
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/2024
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(本籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 勝 田 真 一 (大阪府) 博士(獣医学) 獣医博乙第40号 平成12年9月26日 学位規則第4条第2項該当 P-teZ･tLOctylphenolのラット生殖内分泌機構および 子宮への作用秩序に関する研究 主査 東京農工大学 教 授 田 谷 副査 帯広畜産大学 教 授 山 田 副査 岩 手 大 学 教 授 三 宅 副査 東京農工大学 教 授 小久江 副査 岐 阜 大 学 教 授 武 脇 善 三一一義 一.純 陽 栄 論 文 の 内 容 の 要 旨 近年,人工化学物質による地球規模の汚染が大きな問題となっている｡ある種の化学物
質は,エストロジェン受容鹿を介して内分泌撹乱物質として作用し,生体の生殖機能に重
篤な機能障害を引き起こすことが明らかとなってきた｡また近年,これまでは安全である と考えられていた界面活性剤や,プラスチックめ可塑剤などに含まれる化学物質の中にも エストロジェン作用を有する物質が存在することが明らかとなってきた｡これらの化合物 が,生物の生殖機能にどのような影響を及ぼすかは,今後重大な問題となることが予想さ れ阜が,これらの化合物のエストロジェン様作用を主とする生殖機能への影響については, ダイオキシンなどの研究に比べて報告が少なく,不明な点が多い｡これらの内分泌撹乱物 質は,魚類,両生類,は虫類,鳥類,そして晴乳類といわゆる生物濃縮により動物体内に 蓄積され,最終的にはヒトヘの汚染が重大な社会問題となっている｡これまで水産動物を 中心にして地球環境の汚染が検査され,生殖異変としてクローズアップされてきたが,晴乳類へ内分鱒撹乱物質がどの▲ようなメカニズムで作用し,どの程度の量がいつ作用するこ
とで晴乳類の生殖機能に変化が起こるかについては,未だ知見が乏しく不明の点が多い｡ 本研究は,アルキルフェノールの代表的化合物であるp-tert-Octylphenol(オクテルフ ェノール)について,雌の生殖機能に及ぼす影響を,ラットを用いて解析したものである｡ 第1章では,緒論として内分泌撹乱化学物質,Do血ryuラットの特赦,オクテルフェノール について記述し,本研究の目的を述べた｡ 第2章では,本研究に用いた成熟雌ラットの内分泌環境と子宮内膜の周期的組織変化に関 する知見をまとめた｡子宮および膣などの形態は,発情周期の各ステージごとに卵巣から分泌されるステロイ ドホルモンであるエストロジェンとプロジエステロンの作用により劇的に変化する｡本章 では,本研究に使用したDonryuラットの正常発情周期中における内分泌環境と子宮や膣の 形態的変化を解析し,子宮内膜の細胞増殖活性とエストロジェンレセプター(ER)αmRNAの 発現が発情周期のステージごとに大きく変化することを明らかにした｡ 第3章では,オクテルフェノールを成熟雌ラットに投与した場合の影響に関する知見をま とめた｡ 正常発情周期を回帰する雌Donryuラットに,オクテルフェノールを28日間連続皮下投 与し,腹スメア像の経時的変化を調べた結果,50皿g/kg以上のオクテルフェノールを反復 皮下投与したラットでは,発情周期の乱れが認められた｡連続発情に陥った子宮の形態は, 正常発情周期におけるいずれのステージとも異なっており,子宮内膜の細胞増殖活性がわ ずかながら克進していた｡ 以上の結果から,オクテルフェノールは,生殖器に対して用量依存性にエストロジェン 様作用を示し,屋スメア像が最も明瞭かつ高感度な指標であることが判明した｡ 第4章では,成熟雌ラットの子宮に対するオクテルフェノールの直接作用に関する知見を まとめた｡ 卵巣摘出により内因性ホルモンの影響を排除したラットにオクチルフェノールを2日あ るいは14日間連続皮下投与した｡また,実際の動物の体内でのオクテルフェノール濃度を 投与した動物の血中オクテルフェノール濃度を測定することにより解析した｡その結果, オクテルフェノールは,腱スメアのestrousconversion,子宮重量増加,細胞増殖活性先 進,子宮内膜上皮丈の増加および内膜上皮におけるERα皿RⅣAの発現性の増強などの作用を 有する事実が判明した｡これらの作用は,オクチルフェノール投与を繰り返すことにより 増強し,14日間投与においては,25mg/kg以上の用量で子宮増殖作用が認められた｡この ときのオクテルフェノールの血中濃度は約80ng/山であった｡ 以上の結果から,オクテルウエノールは,子宮に対して直接的にエストロジェン様作用 を示し,かつその作用は投与用･量および投与期間依存性に増加することが明らかとなった｡ 第5章では,新生子期のオクテルフェノール投与が生殖器に及ぼす影響に関する知見をま とめた｡ 生後1日から15日までの間にオクチルフェノール_100皿g/kgを8回隔日投与することに より膣開口が早期化し,かつ,すべての動物が性成熟期以降速やかに連続発情に移行した｡
また,幼若期の卵胞刺激ホルモン(アSE)や黄体形成ホルモン(LH)の分泌は,低下し子畠腺の
発育も抑制された｡連続発情を示した動物では,排卵が認められず卵巣には,各種サイズ の卵胞のみが存在した｡子宮内膜では,被覆上皮の過形成および腺上皮の数の減少が認められ卑｡血中エストラジオール濃度は,比較的低値であり,血中プロジエステロン濃度は
基底レベルを示した｡ 以上の結果から,オクテルフェノールの新生子期投与により,成熟後に生殖器系の分化･ 発育が不可逆的に障害されることが判明した｡-266-第6章では,オクチルフェノール投与により誘起した連続発情ラットでの子宮の増殖性変 化に関する知見をまとめた｡ 新生子期のオクテルフェノール投与による連続発情(無排卵)誘起が視床下部性か否か を調べる目的で,Ⅶ放出ホル亨ン(LHRH)を投与した結果,排卵が誘導され連続発情はいっ
たん消失して発情周期様の膣スメヤー像の変化が出現した｡子宮甲過形鱒変化は,消失し
たが子宮腺の数は低値のまま維持された｡次に,内因性の性ステロイドホルモンの関与を 調べる目的で,連続発情に陥ったラットの卵巣を摘出した結果,子宮や膣は速やかに萎喝 し子宮の過形成変化も消失したが,子宮腺の数は依然として低値のまま維持された｡これ らの結果から,新生子期のオクテルフェノール処置による内分泌撹乱が連続発情や子宮の 増殖性変化の原因であることが判明した｡しかし,卵巣摘出後にエ大トラジオールを皮下 投与して経時的に子宮を観察した結果,内膜被覆上皮の増殖性変化が再現した｡また,エ ストラジオール投与から1日後にはすでに被覆上皮には細胞死が明らかに認められたが, 子宮腺の数には変化が認められなかった｡最後に,エストロジェンの子宮に対する作用を 抑制するプロジェネテロンを連続発情ラットに投与した結果,内膜上皮甲過形成変化は消失し上皮の痴態も発情休止期様を示した｡
以上の結果から,新生子期のオクテルフェノール処置によって生じた内膜被覆上皮のエ ストラジオールに対する反応性の先進と,プロジエステロンの分泌低下による相対的なエ ストロジェン高値の内分泌環境が内膜上皮の過形成に関与するものと推察された｡しかし, 子宮腺については,新生子期のオクテルフェノール投与によって,その後のホルモン非依 存性の影響を受けたものと推察された｡ 第7章では,オクチルフェノールの発癌修飾作用に関する知見をまとめた｡ オクチルフエノ⊥ルの発癌修飾作用を検討した｡初めに,成熟した正常および卵巣摘出 雌ラットに発癌剤であるN-ethyトN'-nitro一打-nitrosoguanidine(E椚沌)を子宮腔内に 単回投与し,引き続き100mg/kgのオクチルフェノールを12カ月間皮下投与した｡次に, 生後の子宮の発育時期であるト15日齢までの間100mg/kgのオクチルフェノールを隔日皮下鱒与し;3カ月齢時に甜耶を投与した｡その結果,成熟期のオクテルフェノーノレ投与で
は子宮内膜癌の発生頻度が増加した｡一方,新生子期のオクテルフェノール投与では,腫 瘍の発生頻度の増加は認められなかったが,組織学的異型度と転移や周辺臓器への浸潤度 など,腫瘍の悪性度が増強した｡ 以上の結果から,オクチルフェノヤル処置により誘起した子宮内膜癌は,オクチルフェ ノールの投与時期によtり腫瘍の発生頻度や増殖形態が異なる事実が判明した｡す寧わち, 成熟期投与では子宮の直接的細胞増殖作用を示すがブ新生子期投与では直接作用としての 内膜上皮細胞分化の不可逆的な障害と,間接作用としての無排卵,連続発情という内分泌 撹乱作用により,オクテルフェノールの発癌プロモ｣ション作用が発現するもぁと推察さ れた｡このように投与時期による生体例の反応性の相違により発癌修飾作用も異なる事実 が明らかになった｡審 査 結 果 の 要 旨 近代社会の発展と共に,これまで地球上に存在していなかった多くの化学物質が合成さ れ,長期間にわたって環境中に放出されてきた｡そのうち,エストロジェン様作用を有する 化学物質が生体の内分泌作用を撹乱する疑いがあるとして近年国際的に大きな問題となっ ている｡アルキルフェノールは,エストロジェンレセプターとの結合能を有し,雌では子宮 重量増加作用などのエストロジェン様作用を示す化学物質であり環境エストロジェンとし
て知られている｡近年,この環境エストロジェンによる魚類の虚化現象などが世界各国で報
告され大きな国際間是に発展しているが,晴乳類の生殖機能に対する影響を総合的に検討 した研究は乏しい｡本研究は,アルキルフェノールの代表的化合物であるp-tert-Qctylphenol(オクテルフェ
ノール)について,雌の生殖機能に及ぼす影響を,ラットを用いて解析したものである｡ 1.成熟雌ラットの内分泌環境と子宮内膜の周期的組織変化 子宮および膣などの形態は,発情周期の各ステージごとに卵巣から分泌されるステロイ ドホルモンであるエストロジェンとプロジエステロンの作用により劇的に変化する｡本章 では,本研究に使用したDonrmラットの正常発情周期における内分泌環境と子宮や膣の形 態的変化を解析し,子宮内膜の細胞増殖活性とエストロジ土ンレセプター(ER)α血ⅧAの発 現が発情周期のステージごとに大きく変化することを明らかにした｡ 2.オクテルフェノールの成熟期投与における影響正常発情周期を回帰する雌Donr叩ラットに,オクテルフェノールを28早聞達続皮下投
与し,膣スメア像の経時的変化を調べた結果,50喝/kg以上のオクチルフェノールを反復 皮下投与したラットでは,発情周期の乱れが認められた｡連続発情に陥っ.た子宮の形態は,正常発噂周期におけるいずれのステージとも異なっており,子宮内膜の細胞増殖活性がわ
ずかながら売進しセいた｡オクテルフェノールは,生殖器に対して用量依存性にエストロ
ジェン様作用を示し,膣スメア像が最も明瞭かつ高感度な指標であることが判明した卜 3.成熟雌ラットの子宮に対するオクテルフェノールの直接作用 オクテルフエノ｢ルの子宮への直接作用を検討する目的で,卵巣摘出によ･り内因性ホル モンの影響を排除した動物にオクチルフェノールを2日あるいは14日間連続皮下投与した｡ また,実際の曝露レベルを投与した動物の血中オクチルフェノール濃度を測定することに より解析した｡その結果,′オクテルフェノールは,膣スメアのestrousCOnVerSion,子宮 重量増加,細胞増殖活性先進,子宮内膜上皮文中増加および内膜上皮におけるERα劇仏の 発現性の増強などの作用を有する事実が判明した｡これらの作J削ま,オクテルフェノール投与を繰り返すことに■より増強し,14日間投与においては,25mg/kg以上の用量で子宮増
殖作用が認められた｡このときのオクチルフェノールの血中濃度は約80喝ル1であった｡ 以上の結果から,オクテルフェノールは,子宮に対して直接的にエストロジ土ン様作用 を示し,かつその作用は投与用量および投与期間依存性に増加することが明らかとなった｡-268-4.新生子期のオクチルフェノール投与が生殖器に及ぼす影響 生後1日から15白までの間にオクチルフェノール100喝/短を8回隔日投与することに より膣開口が早期化し,かつ,すべての動物が性成熟期以降速やかに連続発情に移行した｡ また,幼若期の卵胞刺激ホルモン(FSIi)や黄体形成ホルモン(LH)の分泌は,低下■し子宮腺の 発育も抑制された｡連続発情を示した動物では,排卵が認められず卵巣には,各種サイズ の卵胞のみが存在した｡子宮内膜では,被覆上皮の過形成および腺上皮の数の減少が認め られた｡血中土ストラジオール濃度は,比較的低値であり,血中プロジエステロン濃度は 基底レベルを示した｡ 以上の結果から,オクチルフェノールの新生子期投与により,成熟後に生殖器系の分化･ 発育が不可逆的に障害されることが判明した｡ 5.オクテルフェノール投与により誘起した連続発情ラットでの子宮の増殖性変化
新生子期のオクテルフェノール投与による連続発情(無排卵)誘起が視床下部性か否か
を調べる目的で,LH放出ホルモン(LⅢⅢ)を投与した結果,排卵が誘導され連続発情はいったん消失して発情周期様め膣スメヤー像の変化が出現した｡子宮の過形成変化は,消失し
たが子宮腺の数は低値のまま維持された｡次に,内因性の性ステロイドホルモンの関与を 調べる目的で,連続発情に陥ったラットの卵巣を持出した結果,･子宮や膣は速やかに萎縮 し子宮の過形成変化も消失したが,子宮腺の数は依然として低値のまま維持された｡これ らの結果から,新生子期のオクテルフェノール処置による内分泌撹乱が連続発情や子宮の 増殖性変化の原因であることが判明した｡しかし,卵巣摘出後にエストラジオールを皮下 投与して経時的に子宮を観察した結果,内膜被覆上皮の増殖性変化が再現した｡また,エ ストラジオール投与から1日後にはすでに被覆上皮には細胞死が明らかに認められたが, 子宮腺の数には変化が認められなかった｡最後に,エストロジェンの子宮に対する作用を 抑制するプロジエステロンを連続発情ラットに投与した結果,内膜上皮の過形成変化は消 失し上皮の形態も発情休止期様を示した｡ 以上の結果から,新生子期のオクテルフェノール処置によって生じた内膜被覆上皮のエ ストラジオールに対する反応性の先進と,プロジエステロンの分泌低下による相対的なエ ストロジュン高値の内分泌環境が内膜上皮の過形成に関与するものと推察された｡しかし, 子宮腺については,新生子期のオクテルフェノール投与によって,その後のホルモン非依 存性の影響を受けたものと推察された｡ 6.オクチルフェノールの発癌修飾作用 オクチルフェノールの発癌修飾作用を検討した｡初めに,成熟した正常および卵巣摘出 雌ラットに発癌剤であるN-ethyl-N,-nitro-正一nitrosoguanidine'(ENNG)を子宮腔内に 単回投与し,引き続き100喝/kgのオクテルフェtノールを12カ月間皮下投与した｡次に,生後の子宮の発育時期であるト15日齢までの間100√喝几gのオクチルフェノールを隔日皮
下投与し,3カ月齢時にE耶旧を投与した｡その結果,成熟期のオクテルフェノール投与で は子宮内膜癌の発生頻度が増加した｡一方,･新生子期のオクチルフエノ･-ル投与では,腫 瘍の発生頻度の増加は認められなかったが,組織学的異型度と転移や周辺臓器への浸潤度など,腫瘍の悪性度が増強した｡ 以上の結果から,オクテルフェノール処置により誘起した子宮内膜癌は,オクテルフェ ノールの投与時期により腫瘍の発生頻度や増殖形態が異なる事実が判明した｡すなわち,
成熟期投与では子宮の直接的細胞増殖作用を示すが,新生子期投与では直接作用としての
内膜上皮細胞分化の不可逆的な障害と,間接作用としての無排卵,連続発情という内分泌撹乱作用により,オクテルフェノールの発癌プロモーション作用が発現するものと雅察さ
れた｡このようた投与時期による生体何の反応性の相違により発癌修飾作用も異なる事実
が明らかになった｡以上について,審査委貞全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論
文として十分価値のある内容であるものと認めた｡ 学位論文の基礎となる学術論文 1.Katsuda,S.,Ybshida,M.,Watanabe,T.,Kurbda,H.,Ando-Lu,J.,Takahashi,M., Hayashi,H.andMaekawa,A.(1999)Estrogen.receptormRNAinuteriofnormal estrouscyclingandovariectomizedratsbyinsituhybridizatidn.proceedingsofthe SocietyforExperimentalBiologyandMedicine221,2d7-214. 2.Katsuda,S.,Ybshida,M.,Isagawa,S.,Asagawa,Y,Kuroda,H･,Watanabe,T.,Ando,J.,Takahashi,h4.andMaekawa,A.(2000)bose-andtreatm云ntduratioム,relatedefrtcts
Ofp-te7･t-OCtylphenolonfemalerats.ReproductiYeToxicology14,119-126･ 3.Katsuda,S.,､Ybshida,M.,Watanabe,G.,Taya,K.and Maekawa,A.(2000) Irreversiblee蝕ctsofneonatalexposuretop-teT･t-OCtylphenolonthereproductive tractinfemalerats.甘0ⅩicologyandAppliedPharmacology165,217-226. 既発表学術論文 1.Morikaふa,Y,Katsuda,S･,Okada,T･andHashimoto,Y(1987)Histometri?Studieson mucus secretion ofthe sublingualgland oftheperinatalrat.JapaneseJournalofVtterinaryScience49,825-831.
2.Okazaki,Y,Rao,S.,Asao,S.,Tateishi,T.,Katsuda,S.and Fumki,Y(199S)Efftctsof
Ti,AlandVconcentrationsoncellviability.MaterialsTransactions,JIM39,1053-1062.
3.Okazaki,Y,Katsuda,S.,Furuki,YandTateishi,T･(1998)E蝕ctsofaluminum?Xide
負1m on丘broblast L929and V79cellviabilities.Materials Transactions,JIM39, 1063-1069.
4.Ybshida,M.,Kudoh,K.,Katsuda,S.,Takahashi,M.,Ando,J.'andMaekawa,A.(1998)
Inhibitory efftcts of uterine endometrialcarcinogenesisin Donryu rats by
tamoxifbn.CancerLetter134,43-51.
