マウスモデルを用いた骨髄増殖性腫瘍発症機構の解析

1．骨髄増殖性腫瘍の遺伝子異常と病態 骨髄増殖性腫瘍 （myeloproliferative neoplasms：MPNs） という呼称は狭義には真性多血症 （polycythemia vera： PV），本態性血小板血症 （essential thrombocythemia： ET），原発性骨髄線維症 （primary myelofi brosis：PMF）

の 3 疾患を指して用いられる。MPNs にみられる代表 的な変異を Table 1 に示す1−3）。顆粒球コロニー刺激因 子 （granulocyte-colony stimulating factor：G-CSF）， ト ロンボポエチン （thrombopoietin：TPO），エリスロポ エチン （erythropoietin：EPO） などの造血因子のシグ ナルを伝えるチロシンキナーゼ Janus kinase 2 （JAK2） を活性化する変異は，MPNs に特異的かつ相互排他 的にみられ，診断基準にも組み込まれている。PV の 95%，ET，PMF の 60-65% の患者では JAK2 の exon14 に 変 異 が 生 じ て い る（JAK2V617F 変 異 ）。ET，PMF で は，JAK2 の 上 流 に 位 置 す る TPO 受 容 体 で あ る 受付日：令和 2 年 10 月 24 日 受理日：令和 2 年 10 月 28 日 宮崎大学医学部 内科学講座消化器血液学分野

マウスモデルを用いた骨髄増殖性腫瘍発症機構の解析

幣 光太郎

Pathophysiology of myeloproliferative neoplasms revealed from mouse models with

driver mutations.

Kotaro Shide, M.D., Ph.D.

Department of Gastroenterology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Miyazaki

Abstract

Since the mouse models with the driver mutations of myeloproliferative neoplasms (MPNs) reproduce various pathological conditions found in MPNs patients such as blood cell increase, splenomegaly, and bone marrow fi brosis, these mouse models are extremely useful as tools to elucidate the mechanism of pathogenesis. Activation of MPL and its downstream signaling pathways is common to the JAK2, MPL, and CALR mutations, which are major driver mutations in MPNs, and is essential for the pathogenesis of MPNs. We analyzed the gene expression profi le of MPL-expressing cells in Jak2V617F transgenic mice and identified the signaling pathway responsible for bone marrow fi brosis. MPL activates the transcription factor upstream transcription factor via the p42/44 MAPK pathway, and the JAK2V617F mutant protein uses this pathway to enhance transcription of TGF-β1, a cytokine essential for bone marrow fibrosis. Inhibition of this pathway effectively suppressed organ fibrosis in Jak2V617F mice in vivo. JAK2 inhibitors have only a slow and limited effect on improving myelofibrosis. The mechanism we have discovered is a promising therapeutic target for antifi brotic therapy, which has recently been developed for patients with myelofi brosis. Such anti-fi brotic therapies may create new therapeutic benefi ts for patients with myelofi brosis that cannot be provided by JAK2 inhibitors.

Key words : myeloploriferative neoplasms; driver mutations; mouse models; myelofibrosis; TGFβ1

myeloproliferative leukemia virus oncogene （MPL） の変異 （MPLW515L/K 変異） が 5−10% の症例で，Calreticulin （CALR） exon9 の遺伝子変異が 20−25% の症例で認め られる。CALR は小胞体においてシャペロンとして機 能しているが，変異体は MPL に結合し，MPL を介し て JAK2 を活性化する。 これらの 3 つの変異は，MPNs 全体の約 90% の患者 に相互排他的にみられることから，MPNs のいわゆる oncogenic driver変異であり，全変異に共通する MPL-JAK2経路（以下 MPL-JAK2-axis）の活性化は MPNs の 病態形成に中心的役割を担っていることが示唆され る。実際，JAK2V617F 発現マウスにおいて MPL 発現 を欠損させると，幹細胞プールの増加，白血球や血小 板の増加，脾腫，骨髄の線維化といった MPNs 様表現 型のほとんどが消失する4, 5） 。 2．骨髄線維症の病態とサイトカイン 骨髄線維症 （myelofi brosis：MF） は，PMF と，PV ま たは ET から進展した 2 次性骨髄線維症 （post-PV MF， post-ET MF） を 含 む 疾 患 概 念 で あ る。post-PV MF， post-ET MFは PMF と酷似した病像を呈し治療方針は 同じである。 MFに特徴的な線維化病変の責任細胞と考えられて いるのが，腫瘍クローンに由来する巨核球である。診 断基準にも取り入れられているように，MF の骨髄で は球状 （bulbous） や，雲状 （cloudlike） と称される核 異型をもつ大小の巨核球が密集している6）。この巨 核球は transforming growth factor β （TGF-β），platelet-derived growth factor （PDGF），vascular endothelial growth factorなどの多様なサイトカインを分泌し，線 維芽細胞の増生，骨芽細胞の分化促進と破骨細胞の抑 制を誘導する。その結果，細網線維やコラーゲン線維 の増加，骨梁の増生，血管新生といった変化が年単位 で進行し，骨髄不全をきたすと共に，髄外造血による 肝脾腫増大が認められる2, 7） 。 巨核球が分泌するサイトカインの中で，TGF-β1 は 特に重要と考えられている。TPO 過剰発現 マウス は，古くから用いられている MF のモデルマウスであ る。このモデルでは，マウス骨髄細胞にレトロウイル スベクターを用いて TPO 遺伝子を導入する。移植さ れた血球から過剰に産生される TPO により造血細胞 の MPL 経路が恒常的に活性化されることにより，巨 核球の過形成，骨髄の線維化，貧血，脾腫，そして 炎症が惹起される。つまり TPO 過剰発現マウスでは MPLW515L/K 変異や CALRexon9 変異と同じ仕組みで MFが誘導される。Chagraoui らは TGF-β1 ノックア ウトマウスの骨髄細胞を用いて TPO 過剰発現マウス を作成すると骨髄の線維化が生じないことを示した8） 。 これは，血球細胞由来の TGF-β1 が骨髄の線維化に必 須であることを示している。 コ ラ ー ゲ ン 産 生 細 胞 の 由 来 に つ い て， 近 年 新 し い知見が報告された9−11）。コラーゲンを産生してい る紡錘形細胞は，腫瘍クローン由来の巨核球の分泌 する TGF-β1 により二次性に増生した筋線維芽細胞 （myofi broblast） であり，間葉系細胞に由来していると されてきた12）。しかし，MF 患者及び Jak2V617F 発現 マウスの骨髄で観察される紡錘形細胞は多くが白血 球のマーカーである CD45 を発現しており，ヒト・マ ウス共に腫瘍クローン由来の単球が transform した線 維細胞 （fi brocyte） であった9, 11）。Jak2V617F マウスモ デルの検討からは，単球から fi brocyte への分化には TGF-β1 が必須であり，TGF-β1 は myofi broblast の増 殖促進と単球から fi brocyte への分化促進の 2 つの作 用により MF を進展させると考えられる11） 。 3．MPL-JAK2 axis と TGFβ1 骨髄線維化のグレードが，生存の予後因子となるか どうかについては複数のレトロスペクティブな報告が

ある13−15）。イタリアで行われた 540 例の解析では，線 維化のグレードは，強い全身症状，脾腫の程度，貧血， 血 小 板 減 少，International Prognostic Scoring System （IPSS） スコアと相関していた。多変量解析でもグレー ド 2 以上の線維化は IPSS スコアとは独立した予後因 子であった15）。したがって，骨髄線維化は疾患の活 動性を反映するバイオマーカーであることは確かであ る。線維化を含む骨髄変化の軽減そのものが，MF 患 者の予後を改善するかについてはよくわかっていない が，様々な抗線維化療法について検討が進んでいる。 我々はヒト MF と同様の病態を呈する MPN を発症 する Jak2V617F トランスジェニック （TG） マウスを用 いて，MPL 発現細胞の遺伝子発現を解析し，転写因 子 upstream transcription factor 1 （USF1），及び USF2 が 制御する遺伝子群の発現が亢進していることに注目し た16）。その遺伝子群の中には先に述べた TGF-β1 も

含まれている。

この USF の機能亢進が MPL-JAK2 axis の下流にあ るかどうかを明らかにするために，USF1 又は USF2 を，MPL，野生型 JAK2，及び TGF-β1 遺伝子の転写 制御領域を組み込んだルシフェラーゼレポーターと 共に 293T 細胞に導入した。すると TPO による MPL の刺激により TGF-β1 プロモーターの活性が上昇し た。また，野生型 JAK2 の代わりに JAK2V617F 変異体 を導入すると TPO による刺激よりも更に大きなプロ モーター活性の上昇が観察された。USF1 のドミナン トネガティブ変異体である A-USF は，この上昇をほ ぼ完全に抑制し，このプロモーター活性増加は，USF を介したメカニズムによることが確かめられた（Fig. 1A）。一方，好中球に発現する G-CSF 受容体 CSF3R の G-CSFを用いた刺激，赤芽球に発現する EPO 受容体 EPORの EPO を用いた刺激では，USF 転写活性のベー スラインは MPL の場合よりもかなり小さく，刺激に よってもほとんど変化しなかった（Fig. 1B）。つまり， USF の機能亢進は MPL-JAK2 axis に特異的な現象であ ることがわかった。

4．新たな抗線維化療法の開発

JAK2阻害薬 ruxolitinib は脾腫と全身症状の改善に よって MF 患者の QOL を大幅に向上し，一定の生存

Figure 1 Stimulation of MPL with TPO enhanced USF transcriptional activity

（A） JAK2V617F mutant enhanced the TGF-β1 promoter activity higher than wild-type （WT） JAK2 without TPO stimulation. Dominant-negative form of USF1, A-USF, suppressed this enhancement.

（B） Stimulation of CSF3R with G-CSF, or of EPOR with EPO, did not change this activity. USF is activated only in the TPO-MPL signaling cascade.

延長をもたらす17, 18）。ruxolitinib 長期投与の患者では， HU治療群を対照群においてみた場合，骨髄線維化が 改善している患者や不変の患者の割合が有意に多い一 方で，改善しない患者も存在する19） 。これは，線維 化改善効果の発現に時間がかかり，効果が限定的であ ることを示している。 PDGFや TGF-βなどの線維化促進サイトカインを 標的とした抗線維化剤 pirfenidone の第Ⅱ相試験や， TGF-βの中和抗体 fresolimumab の第Ⅰ相試験では，線 維化の改善は見られていない20, 21）。TGF-βR1 キナー ゼ阻害剤 galunisertib について，MF を対象とした臨床 試験が計画されている。Pentraxin-2 （PTX-2） は，肝臓 で産生される急性期応答蛋白の 1 種であり，組織損傷 部位において単球から fi brocyte への分化を抑制する ことにより組織の抗線維化に働く22）。PTX-2 は，健常 対照と比較して MF の患者では低く，さらに線維化グ レードの増加に伴って低下する。MF 患者 26 名を対 象に行われたヒト PTX-2 のリコンビナント蛋白製剤 PRM-151の第Ⅱ相試験の中間報告では，評価可能症 例の 35% で 1 グレード以上の線維化改善が認められ， 全身症状の改善や脾腫，血球減少の改善が認められ た23） 。この試験では PRM-151 単剤投与，ruxolitinib と の併用投与の症例が含まれているが，単剤投与の症例 においても治療効果が認められた。 Ruxolitinibは JAK2V617F 変 異 体 に 選 択 性 が な く， 変異型 JAK2 と野生型 JAK2 の両方を阻害する薬剤で ある。JAK2V617F 変異体から生じる異常活性化を完 全に抑制しようとすると，野生型 JAK2 が担う正常造 血に必須な MPL，CSF3R，EPOR のシグナル伝達も同 時に抑制してしまう。実際，第Ⅰ相試験における用量 制限毒性は血小板減少であり，ruxolitinib 投与例にお いては血球減少をモニタリングしながらの用量調整が 必要である24）。我々は ruxolitinib により線維化の改善 が乏しい理由は，前章で述べた MPL-JAK2 axis 下流の 線維化シグナルが残存していることがその理由と考え た。線維化シグナルの責任経路が同定できれば，効果 的な抗線維化療法の開発が可能となる可能性がある。 MPLからのシグナルは PI3K-Akt 経路，p38MAPK 経路， p42/44 MAPK経路， および JAK-STAT 経路により下流 に伝達される。そこで，各経路の阻害実験を行ったと ころ，MPL-JAK2 axis による USF の機能亢進は，JAK2 阻害剤および MEK 阻害剤による p42/44MAPK 経路の 阻害によって抑制されたが，その他の経路の阻害では 抑制されなかった。p42/44MAPK 経路の抑制が，骨髄 の線維化を改善するかどうか，Jak2V617F TG マウス に MEK 阻害剤 PD325901 を 12 週間にわたり投与し， in vivo で骨髄線維化の改善効果を調べた16, 25） 。投与マ ウスでは，血漿中，骨髄局所の TGF- β 1 濃度が有意 に抑制されており （Fig. 2A），組織像では脾臓，骨髄 における線維化の大きな改善が認められた （Fig. 2B）。 一方で白血球増多や脾腫の改善効果は限定的であっ た16）。現在 JAK 阻害薬との併用効果についても検討 を進めている。

Figure 2 In vivo eff ect of MEK inhibitor in Jak2V617F transgenic （TG） mice.

（A） A signifi cant reduction was seen in the plasma TGF-β1 concentration in the MEK inhibitor treated TG mice compared with the vehicle-treated TG mice. The TGF-β1 concentration in the extracellular fl uid of bone marrow was also signifi cantly reduced.

（B） Regarding the eff ect on bone marrow and spleen fi brosis, it was signifi cantly resolved in MEK inhibitor treated TG mice compared with vehicle treated TG mice.

5．おわりに ド ラ イ バ ー 変 異 に 加 え て NRAS の 変 異 を 有 す る MPNsにおいては，MF に進展するリスクが極めて高 い26） 。NRAS は p42/44MAPK 経路の構成分子であり， 我々の見出だした線維化シグナルの知見と合致する知 見である。線維化はドライバー変異による MPL-JAK2 axisの活性化の結果であるが，ドライバー変異に併存 する変異が MPL-JAK2 axis を促進的に修飾することが MFの発症や進展に寄与している可能性がある。線維 化により変化した骨髄微小環境が，異常造血幹細胞や， 残存する正常造血幹細胞の維持に与える影響はまだ解 明されていないが，線維化の軽減には腫瘍クローンを 支持する骨髄環境を破壊し，正常クローンを保護する 効果が期待されている。MF に対する抗線維化療法に は，JAK2 阻害薬が解決できなかった課題を解決する 大きな可能性が秘められているかもしれない。 謝 辞 本研究にあたり，日産化学工業 医薬品事業部門 の中村隆典博士，大阪大学大学院薬学研究科蛋白情 報解析学分野の土井健史教授，米国 Center for Cancer Research, National Cancer Institute の Charles R. Vinson 博士から貴重な cDNA コンストラクトを提供いただき ました。深く御礼申し上げます。

利益相反 申告すべき利益相反はありません。

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