序 文
日本では，古くから腸炎ビブリオ食中毒が多く 報告されているが， 主要な血清型は変化している．
1994 年までは血清型 O4：K8 が主要であったが，
1995 年以降は血清型 O3：K6 が半数を占めてい る
5）．この腸炎ビブリオ O3：K6 による食中毒の 急増は，東南アジア諸国および米国でも増加して いることを反映したものであることが判ってい る
1）〜4）．また， これら食中毒患者から分離される菌
は，これまでに分離されている他の血清型の知見 と同様に大部分が耐熱性溶血毒（thermostable di- rect hemolysin，TDH） 産生菌であることが明らか になっている．したがって，日本で現在必要な対 策は TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 を対象と するべきであると考えられる．本研究では，予防 対策に必要とされる食品の汚染率を明らかにする とともにその検出方法について新たな知見を得 た．
材料と方法
1．検体
供試検体は，1999 年までに TDH 産生性腸炎ビ
免疫磁気ビーズ法および酵素基質培地を用いた TDH 産生性 腸炎ビブリオ O3：K6 の自然汚染貝からの検出
1）国立感染症研究所，2）静岡県環境衛生科学研究所，3）東海大学短期大学部，4）埼玉県衛生研究所，
5）（財）東京顕微鏡院，6）東京サラヤ株式会社，7）国立医薬品食品衛生研究所，8）東京大学大学院
工藤由起子
1）杉山 寛治
2）仁科 徳啓
3）斎藤 章暢
4）中川 弘
5）市原 智
6）小沼 博隆
7）長谷川順子
3）熊谷 進
8）（平成 13 年 7 月 11 日受付）
（平成 13 年 9 月 12 日受理）
要 旨
日本において主要な食中毒の原因である腸炎ビブリオの検出を，1999 年までに TDH 産生性腸炎ビブ リオ血清型 O3：K6 が海水またはアサリから分離されたことのある海域のアサリについて行った．方法 は 2％ 食塩加 TSB での 6 時間と食塩ポリミキシンブイヨンでの 18 時間の 2 段階増菌培養を行った．こ の培養液 1ml を用いて腸炎ビブリオ K6 抗原に対する免疫磁気ビーズ法を行い，特に血清型 O3：K6 の 効率的分離を行った．また，従来の TCBS 培地に加え腸炎ビブリオ特異的分離用に開発された酵素基質 培地を用いた．この結果，TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 の自然汚染貝からの分離は 66 ロット中 3 ロット（4.5％）で陽性であった．また，分離した腸炎ビブリオの 4,265 コロニー中 6 コロニーが TDH 産生性 O3：K6（0.14％）であった．
〔感染症誌 75：955〜960，2001〕
別刷請求先：（〒113―8657）東京都文京区弥生 1―1―1 東京大学大学院農学生命研究科
熊谷 進
Key words： Vibrio parahaemolyticus, shellfish, immunomagnetic separation, chromogenic medium
Table 1 The number of sample isolated TDH- producing V. parahaemolyticus O3 : K6
Number of positive lot/
number of total tested lot （%）
Sample Souce Sampling Date
0/3 1/3 0/3 Point A
Point B Point C No. 1（2 Oct.）
1/6 0/5 0/5 1/5 Point A
Point B Point C Imported No. 2（16 Oct.）
0/4 0/5 0/5 0/5 Point A
Point B Point C Imported No. 3（23 Oct.）
0/5 0/5 0/4 0/3 Point A
Point B Point C Imported No. 4（30 Oct.）
3/66（4.5%）
Total
ブリオ O3：K6 が海水またはアサリから分離され た国内の 3 海域（A，B，C 海域）で採取されたア サリ（4 回）および海外からの輸入アサリ（3 回）
を 2000 年 10 月に計 66 ロット入手した．これを 3 から 6 カ所の研究機関に分配し，それぞれ入手直 後または冷蔵保存によって輸送後 1 日目に殻から 無菌的に身を取り出した．各アサリのロットにつ き 25g を 1 検体として 2 検体ずつ供試した．
2．培養方法
検体は 25g をストマッカー袋にとり 225ml の 2
％食塩加 TSB（Tryptone Soya Broth，オキソイ ド，イギリス）または 2％ 食塩加 BPW（Buffered Peptone Water，オキソイド） を加え，袋の外側か ら手で押して混合した．これを 35 または 37℃ で 6 時間培養し，その培養液 1ml を食塩ポリミキシ ンブイヨン（日水製薬）9ml に加え 18 時間培養し た．その後，培養液 1ml を用いて腸炎ビブリオ K 6 抗原に対する免疫磁気ビーズ（デンカ生研）によ り腸炎ビブリオ K6 抗原保有菌の濃縮を行い
6）， 最終的に 0.1ml の洗浄液にビーズを浮遊させた．
その 10
µl をクロモアガービブリオ培地（クロモア ガー社，フランス） に画線塗抹した （免疫磁気ビー ズ法） ．また，一部検体についてはビーズ濃縮液を TCBS 寒天培地（日水製薬またはオキソイド）に塗 抹し，培養した．さらに，ビーズによる濃縮を行 わずに培養液 10
µl を各々 TCBS 寒天培地および クロモアガービブリオ培地に画線した（直接塗抹 法） ．
これら平板培地を 35 から 37℃ で 18 から 24 時 間培養した．
3．分離コロニーの確認試験
各分離平板培地に生育したコロニーについて は，色調，大きさなどを観察し，腸炎ビブリオと 疑われるコロニー（TCBS 培地上では緑色のコロ ニー，またクロモアガービブリオ培地上ではピン クから紫色のコロニー）を単離した．これら分離 株について腸炎ビブリオの特徴であるブドウ糖分 解性および白糖・乳糖非分解性であることを TSI 寒天培地（日水製薬）への穿刺培養によって確認 した．さらに，食塩非添加 Nutrient broth （ディフ コ，米国）における非生育，7％ 食塩添加 Nutri-
ent broth における生育を確認した．さらに TDH 産生による溶血性を自家調整の我妻培地での培養 によって調べた
7）．この際には TDH 陰性株と陽 性株を対照として生育させ溶血環の有無を観察し 我妻培地の性能を確認した．さらに分離された陽 性株については逆受け身ラテックス凝集反応キッ ト（KAP-RPLA，デンカ生研） による TDH 産生性 の確認および PCR による
tdh遺伝子の検出（腸炎 ビブリオ耐熱性溶血毒遺伝子検出用プライマー セット，宝酒造）を行った．
成 績
1）TDH 産 生 性 腸 炎 ビ ブ リ オ O3：K6 の 分 離 状況
TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 の検出は 6
研究機関において行った．3 海域の検体または輸
入品を 3 または 4 回にわたり購入した計 66 ロッ
ト（130 検体）を使用し，いずれの検体も K6 抗原
に対する免疫磁気ビーズ法を行った後に平板培地
に塗抹し培養した．1 回目（10 月 2 日）は B 海域
の 3 ロット中 1 ロットからクロモアガービブリオ
培地で腸炎ビブリオ O3：K6 が分離された（Ta-
ble 1）．2 回目（10 月 16 日）は A 海域の 6 ロット
中 1 ロットから TCBS 培地で分離された（Table
Table 2 Effect of immunomagnetic separation method for isolation of Vibrio parahaemolyticus O3 : K6
Plating after immunomagnetic separation Direct plating
Samples
Total CHROMagar TCBS
Total CHROMagar TCBS
56/160 36/88
20/72 24/86
16/45 8/41 ＊
Total
（35.0%）
（40.9%）
（27.8%）
（27.9%）
（35.6%）
（19.5%）
＊ Number of V. parahaemolyticus O3 : K6/number of isolate
Table 3 Isolation of Vibrio parahaemolyticus using plating onto TCBS medium and CHROMagar medium
CHROMagar TCBS
Bacteria Sample
6
（3.5%）（3.4%）
173（97.2%）
178 0
（0%）＊ （0%）＊＊
107（87.8%）＊＊＊
122 V. parahaemolyticus O3 : K6
V. parahaemolyticus isolate
Point A
32（16.2%）（14.7%）
198（91.2%）
217 4
（3.1%）（2.9%）
127（90.7%）
140 V. parahaemolyticus O3 : K6
V. parahaemolyticus isolate
Point B
28（8.2%）（7.8%）
341（95.3%）
358 0
（0%）（0%）
175（80.3%）
218 V. parahaemolyticus O3 : K6
V. parahaemolyticus isolate
Point C
7
（3.3%）（3.0%）
210（90.5%）
232 4
（3.5%）（2.9%）
113（80.7%）
140 V. parahaemolyticus O3 : K6
V. parahaemolyticus isolate
Imported
73（7.9%）（7.4%）
922（93.6%）
985 8
（1.5%）（1.3%）
522（84.2%）
620 V. parahaemolyticus O3 : K6
V. parahaemolyticus isolate
Total
＊ Percentage of the number of V. parahaemolyticus O3：K6/the number of V.
parahaemolyticus
＊＊ Percentage of the number of V. parahaemolyticus O3：K6/the number of isolate
＊＊＊Percentage of the number of V. parahaemolyticus/the number of isolate
1） ．また輸入品の 5 ロット中 1 ロットから両平板 培地で分離された（Table 1）．3 および 4 回目（10 月 23 日および 10 月 30 日） はいずれの海域の検体 または輸入検体からも TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 は検出されなかった （Table 1） ．総合する と 66 ロット中 3 ロット（4.5％）から検出された
（Table 1） ．また，本研究において腸炎ビブリオで あることが疑われるコロニーが 合 計 4,265 コ ロ ニー分離された．そのうち我妻培地と PCR 等に よって TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 と判明 したものは 6 コロニー（0.14％）であった．TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 の存在は極めて低率 であった（data not shown） ．
2）腸炎ビブリオ O3：K6 株の直接分離培養法 および磁気ビーズ法による分離状況
本研究に従事した研究機関のうち 1 研究機関で は，1） の研究において直接塗抹法および免疫磁気 ビーズ法の血清型 O3：K6 の分離率を比較した．
3 海域（A，B，C 海域）の検体または輸入品を 3 または 4 回にわたり購入した計 15 ロット（30 検 体）を使用した．その結果，A および B 海域では 免疫磁気ビーズを使用したほうがクロモアガービ ブリオ培地において 41.7％ または 58.3％ と分離 率が高かった．しかし，C 海域や輸入品のように，
クロモアガービブリオ培地への直接塗抹により
50％ 以上の検出率が得られる場合には免疫磁気
ビーズを使用した方が陽性率が低かった． しかし，
TCBS 培地を用いた場合には免疫磁気ビーズ法の 方が分離率が高かった．総合した結果を Table 2 に示した．
3）クロモアガービブリオおよび TCBS 培地上 での腸炎ビブリオと疑われるコロニーの分離状況 新たに開発された腸炎ビブリオ選択分離培地で あるクロモアガービブリオ培地と既存の TCBS 培地との比較を 1 研究機関において 1） の研究に おいて詳しく行った．3 海域の検体または輸入品 を 3 回にわたり購入した計 12 ロット（24 検体）を 使用し，いずれの検体も K6 抗原に対する免疫磁 気ビーズ法を行った後に塗抹培養した．その結果 を海域ごとに Table 3 に示した．平板培地上に生 育した腸炎ビブリオと疑われるコロニー数はいず れの検体においてもクロモアガービブリオ培地の ほうが多かった．コロニーの性状試験を行った結 果，腸炎ビブリオと考えられた株数もクロモア ガービブリオ培地のほうが多く，釣菌した総菌株 に占める割合も高かった．さらにそれらの株を O 3 および K6 血清と反応させ血清型 O3：K6 株で あることを確認したところ，クロモアガービブリ オ培地を用いた場合のほうが血清型 O3：K6 株を 多数分離できた．釣菌した総菌株または腸炎ビブ リオ株に占める血清型 O3：K6 株の割合もクロモ アガービブリオ培地を用いたほうが高かった．
さらに 1） の研究において検体を食塩ポリミキ シ ン ブ イ ヨ ン で 2 段 階 増 菌 し た 培 養 液 か ら の PCR に よ る
tdh遺 伝 子 の 検 出 を 1 研 究 機 関 で 行った．供試した 15 ロットのうち 8 ロット（14 検体）で PCR によって
tdh遺伝子が検出された．
これらの検体について TDH 産生性腸炎ビブリオ 株は 1 検体からのみ TCBS 培地およびクロモア ガービブリオ培地の両培地で分離されたものの他 の 13 検 体 か ら は 分 離 さ れ な か っ た（data not shown） ．
考 察
腸炎ビブリオ食中毒の予防対策を構築するため には，水揚げ段階から流通を経て喫食されるまで の過程における魚介類の TDH 産生性 O3：K6 株 による汚染実態が明らかにされることが望まれて
いる．それによって，食中毒起因菌である TDH 産生性 O3：K6 株の汚染の拡大および増殖等が起 こる過程を推定し，どの段階に対してどういうコ ントロールを行えば効果的な対策が期待できるか を明確にすることができるものと考えられる．し か し，従 来 か ら 腸 炎 ビ ブ リ オ の 病 原 株 で あ る TDH 産生株は，患者から高頻度に分離されるに もかかわらず，食品や環境からは TDH 非産生株 が高頻度に分離され，産生株は極めて低頻度でし か分離されていない
8）〜10）．これらのことは，培養 方法の検討の必要性を示すものである．刑部ら
11）によって，非選択培地で前増菌した後に選択培地 で増菌する方法が有用であることが示めされ，そ の後の我々の検討によっても従来の 1 段階の増菌 培養法よりも 2 段階または 3 段階の増菌培養法の 方が TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 株が検出 しやすいことが確かめられた．また，本研究の一 環として新たに開発された酵素基質を利用した寒 天培地が腸炎ビブリオの集落を判別しやすいこと が認められた．これらのことから，本研究におい ては 2 段階増菌方法および酵素基質培地を用い て，これまでの調査研究において TDH 産生性腸 炎ビブリオ O3：K6 が分離されたことのある海域 由来の貝から同菌の分離を試み，検出率を明らか にした．
TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 の分離率は 汚 染 海 域 で あ っ て も ロ ッ ト 単 位 で は 4.5％（66 ロット中 3 ロット） であった．また，分離コロニー 中の TDH 産生性腸炎ビブリオ O3：K6 の割合は 0.14％（4,265 コロニー中 6 コロニー）であり生産 直後の食品からは分離が難しいことが明らかに なった．本研究は海水温が低下し海水中の腸炎ビ ブリオ菌数が減少する 10 月に検体を入手してい るものの，汚染率を明らかにすることができた．
今後，さらに夏場の異なる月に多地域においても データを得る必要があると考えられる．また，汚 染菌量が把握できれば，汚染があっても産地から 喫食までの輸送や管理等の方法によって食中毒の 発生を抑制できる条件が見出されるものと思われ た．
免疫磁気ビーズは病原微生物や病原性原虫等の
濃縮に用いられているが，本研究では特に近年多 く発生している血清型 O3：K6 に着目し，その K 6 抗原に対する抗体を使用した免疫磁気ビーズを 用いた．本研究においても，分離率が向上する傾 向が認められたが使用に当たっては抗原抗体反応 が他病原体で用いられている抗原抗体反応よりも 若干弱い傾向を示し，直接法も併用したほうがよ り確実に菌を分離できると考えられた．
また，近年多くの病原細菌の分離のために開発 されている
12）13）酵素基質培地は腸炎ビブリオにつ いてはこれまでに知られていなかったが，本研究 では新規に開発されたクロモアガービブリオ培地 についてその有用性を評価した．Table 2 に示す ようにクロモアガービブリオ培地は TCBS 培地 よりも腸炎ビブリオと思われるコロニー数が多 く，また血清型 O3：K6 の分離率も高かった．こ れは確実に腸炎ビブリオが分離されているために 分離率が TCBS 培地よりも高い結果が得られて いるものと思われる．これらのことから TDH 産 生性腸炎ビブリオ O3：K6 自然汚染貝からの本菌 の分離において，クロモアガービブリオ培地は TCBS 培地と同等以上であると考えられた．また，
クロモアガービブリオ培地上に生育したコロニー は時間の経過によって，その色調が変化すること なく，また，他の菌種と重なっても腸炎ビブリオ と疑われるコロニーを釣菌することが可能であっ た．このことは本培地の有用性のひとつであると 思われた．
さらに，2 段階増菌のうち 1 段階目を非選択培 地によって行ったが，低温等に曝された腸炎ビブ リオの検出方法の改善
14）15）が報告されており， 本研 究においても始めに非選択培地で増菌するため環 境中で比較的低温等に曝された腸炎ビブリオが検 出されやすいと思われる．しかし，培地の種類，
温度や時間など各段階での培養条件をさらに工夫 する必要があるのかもしれない．現に本研究結果 において 検 体 の 増 菌 培 養 液 か ら PCR に よ っ て
tdh遺伝子が検出されたにもかかわらず TDH 産 生株が平板培地から分離されなかった．このこと からも増菌方法および分離方法を改善するための 検討が今後さらに必要であると考えられる．
本研究は厚生省科学研究費補助金の事業の一環として 行われた．
文 献
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Detection of TDH-producing
Vibrio parahaemolyticusO3：K6 from Naturally Contaminated Shellfish Using an Immunomagnetic Separation
Method and Chromogenic Agar Medium
Yukiko HARA-KUDO
1）, Kanji SUGIYAMA
2）, Tokuhiro NISHINA
3）, Akinobu SAITOH
4）, Hiroshi NAKAGAWA
5）, Tomo ICHIHARA
6）, Hirotaka KONUMA
7）,
Junko HASEGAWA
3）& Susumu KUMAGAI
8）1）National Institute of Infectious Diseases,2）Shizuoka Institute of Environment and Hygiene
3）Tokai University Junior College,4）Saitama Institute of Public Health
5）Tokyo Kenbikyoin Foundation,6）Tokyo Saraya Co Ltd
7）National Institute of Health Sciences,8）The university of Tokyo
We attempted to isolate TDH-producing
Vibrio parahaemolyticusO3 : K6 from shellfish. Asari samples were incubated with TSB supplemented with 2％（w v）NaCl for 6 h, and then the 6-h cul- tures were incubated with salt polymyxin broth for 18 h. After the two-step enrichment, a 1ml por- tion of the culture was treated with magnetic beads coated with K6 antibody for immunoconcentra- tion of
V. parahaemolyticusO3 : K6. The immunoconcentrated and untreated cultures were plated onto a chromogenic agar and TCBS agar media for isolation of
V. parahaemolyticus. TDH-producingV.parahaemolyticus
