2002年 度
神奈川大学共 同研 究奨励助成研 究成果報告
研 究課題 名
光 合成 とゲ ノム進化 か ら探 る植物 の環境適応機構
井上和仁
研究代表者
神 奈川大学 ・理学部 ・生物科 学科 ・助教授
研 究分担者
鈴木季直 神奈川 大学 ・理学部 ・生物科 学科 ・教授 鈴木祥弘 神奈川大 学 ・理学部 ・生物科学科 ・専任講 師
大塚一郎 神奈川大 学 ・工 学部 ・一般教育 生物 ・教授 朝倉 史明 神奈川大学 ・工学部 ・一般教 育生物 ・専任講 師
中原 昌明
研究支援者
神奈川大 学 ・総合理学研究所 ・客員研 究員
は じめ に
地球 上 の生態系 は太 陽光 をエネルギ0源 に した植物 の光合成 によ る一次生産 に支 え られて いる。循環型 エネルギ0資 源 の開発 ・地球環境保 全な ど人類が抱 えてい る課題 の解決 のた めに,植 物 の持つ機能 を解析 し,そ れ を生物工学的 に 利用 す る ことは緊急 の研究課題 で ある。神奈川大学 には,植 物科 学の分野で特 色あ る研 究 を展 開 している教員 が,横 浜キ ャンパス の工学 部一般 教育 と湘南 ひ らつかキ ャンパス の理学部 に所 属 してお り,こ れ まで も,両 学 部の関係教員 は 教育研 究面で交流 を積み重ね て きた。本研究課題は,そ うした両学部 にまたが って所属 して いる教員 の これ まで の教育研究交流 とそれぞれ の研究成果 を基 に, 植物特有 の機能で ある光合成 と植物ゲ ノム の進化過程 を解析 し,様 々な地球環 境 に適応 して 生育 している植 物 の環境適応機構 を明 らか にす る ことを目的 とし た。研究期 間は1年 であったため,得 られた成果 には限 りがあ ったが,今 後 の 神奈川大学 におけ る光合成機 能 を利用 した研究 の展 開の可能性 を示す事 がで き た。 また,本 研究 と相 前後 して,文 部科学省 の教育研究装置 整備 費補助 によ り 湘南ひ らつかキャ ンパスに植 物育成実験棟が建設 され,ま た,同 省 のハイテ ク ・
リサーチ ・セ ンター 整備事 業 による分子 ・生物 フォ トニクスセ ンター も竣工す ること となった。 これ らの施 設 の本格稼動 によ り,本 学 におけ る生物科 学,植 物科学研究 の一層 の発展 を目指す上で も,本 研究 はいわ ば"呼 び水的な"も の
にな った のではないか と考 えて いる。本研究 に多大 な御支援 をいただ いた本学 関係者 に厚 く感謝 の意 を表 した い。
1.遺 伝 子 解 析 に よ る光 合 成 進 化
0光 合成遺 伝子 の系統解析 か ら浮か び上が る黎 明期の光 合成・一
地 球 上 の ほ とん ど の生 物 は、 植 物 が 作 る有 機 物 に よ っ て そ の 生 活 を支 え られ て い る 。太 陽 エ ネ ル ギ ー を基 盤 に した 光 合 成 によ る食 物 連 鎖 は地 球 誕 生 後 い つ 頃か ら始 ま り、そ して 、最初 の 光 合 成 生 物 は どの よ うな も の だ っ た の だ ろ うか 。 これ まで 、最 初 の光 合 成 生 物 につ いて は い ろ い ろな 説 が 唱 え られ て い た 。まず 、 葉 緑体 の起 源 と考 え られ て い る ラ ン色 細 菌(藍 藻)が 持 つ ク ロ ロ フ ィ ルaが 、 バ クテ リオ ク ロ ロフ ィルaよ りも簡 単 な 経 路 で合 成 され る ことか ら、 ラ ン色 細 菌 が光 合 成 細 菌 に先 ん じて登 場 した とい う説 が1965年 にS.Granickに よ って 提 唱 され て いた 。 また 、16Sリ ボ ソー ムRNAに よ る分 子 系統 樹 で は 緑 色 非 硫 黄 細 菌 が 真 正 細 菌 のな か で もか な り初 期 に分 岐 し、 緑 色 硫 黄 細 菌 、 ヘ リオバ ク テ リア 、 ラ ン色 細 菌 、 紅 色 細 菌 はず っ と後 に な って 分 岐 して くる 。 一 方 、 熱 シ ョ ック タ ンパ ク 質 に よ る系 統 樹 で は、 ヘ リオバ ク テ リアが 最 も初 期 に 登 場 した とい う こ と にな り、 用 い る分子 指 標 に よ って ま った く異 な る系 統 関 係 が 示 され る。
わ れ わ れ は 、光 合 成 の初 期 進 化 を考 え る上 で 、光 合 成 に欠 く こ との で きな い 色 素 で あ る ク ロ ロ フ ィル ・バ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィル の合 成 に関 係 す る酵 素 を分 子 指 標 に用 いて 系 統 関係 を論 ず る の が最 も適 当 と考 え た 。紅 色細 菌 で はバ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィルaの 合 成 過 程 に 関係 す る 数 多 くの酵 素遺 伝 子 が 特 定 され て い た 。 そ こで 、紅 色細 菌 で これ らの遺 伝 子 を破 壊 した株 に別 の光 合 成 原 核 生 物 の 遺 伝子 ライ ブ ラ リー を導入 後 、 バ クテ リオ ク ロ ロフ ィルaの 合 成 能 が 回 復 した 株 に含 まれ る プ ラス ミ ドを解 析 し、 多 数 の 新 規 の遺 伝 子 を単 離 した 。 この 方 法 は機 能 的相 補 と よ ばれ 、一一種 の遺 伝 子 ライ ブ ラ リー のス ク リー ニ ン グ法 で あ る。
ま た 、PCRに よ っ て紅 色 細 菌 な どで 明 らか に な っ て い る遺 伝 子 と相 同 の 遺 伝 子 も得 た 。 この よ うに して新 規 に得 た遺 伝 子 とデ0タ ー ベ ー ス 上 に登 録 され て い る遺 伝 子 を集 め 、 光 合 成 原 核 生 物 と葉 緑体 の系 統 関係 を詳 し く調 べ た 。 図1
Pご〃配5thunbergii76 C加 ㎏0わ'10わa Ephedraaltissima ハ知 κ 乃0π だα ρ0{y〃torpha 福 ε∫05ltig〃zaviride
α1〃nソdo〃ZOfZQS「 〃aoewi∬ だ Chlorellavulgaris
POη 励yア α 」purpur℃o Plectonemaboryanum Synechocystissp.PCC6803
J/11
盈1∫oわ αc'11配5吻oわ'1'5 C'hloroflexusaurantiacus 100
α1070Z痂4〃 πqワidu〃2 R翫040わaster℃apsulatus 100
R乃040わ αα81ドsphaeroides IZubrivivaxgelatinosus BZα5∫OCぬ10」 ドご5viridis
・4c'ゆhiliu〃2ア め7麗 〃a
耽 此oηobαc∫8ア 諏 〃π 乃ε〃300麗 ω ∫γρρ乃ごcμ〃2/NifK Brady1hiZObiu〃2/caponicu〃Z/NifK
100
図1光 非依 存 型 プ ロ トク ロ ロフ ィ リ ド還 元 酵 素 の サ ブユ ニ ッ トBchB/Ch1Bの ア ミ ノ酸 配 列 に基 づ い て最 大 節 約 法 に よ って 作 製 した 分 子 系 統 樹 系統樹上の数値はブー トス トラップ値を示す。実線の長さは相対的遺伝的距離を示す。
統 樹 で あ る 。この 系統 樹 で は 、まず 、紅 色 細 菌 の グル ー プが 最 も初 期 に分 岐 し、
次 に、 緑 色 非硫 黄 細 菌 と緑 色硫 黄 細 菌 の共 通 祖 先 が分 岐 し、 続 い て 、 ヘ リオバ クテ リア と ラ ン色細 菌 ・葉 緑体 が 分 岐 して くる 。 これ と 同様 の系 統 関 係 は 、一 部 に は例 外 が認 め られ る もの の 、色 素 合 成 に 関係 す る大 多 数 の酵 素 に見 られ た 。 色 素 合 成 系 か ら光 合 成 の初 期 進 化 を考 え る と、 まず 、 バ クテ リオ ク ロ ロ フ ィル aを 持 つ 生物(紅 色 細 菌 の祖 先)が 最 初 に光 合 成 の能 力 を獲 得 し、 これ に ア ン テ ナ 色 素 と してバ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィルcが 付 け加 わ った 生 物(緑 色 非硫 黄 細 菌 と緑 色 硫 黄 細 菌 の共 通 祖 先)が 登 場 し、 ク ロ ロ フ ィ ルaと 化 学 構 造 の 良 く似 た バ クテ リオ ク ロロ フ ィルgを 持 つ ヘ リオ バ クテ リア 、 そ して 、 最 終 的 に ク ロ
ロ フ ィルQを 持 つ ラ ン色細 菌 が 出 現 した と い う シナ リオ が浮 か ん で くる 。 図1の 系 統 樹 を作 製 す る上 で,ア ウ トグ ル ー プ の遺 伝 子 と して 窒 素 固定 系 の ニ トロゲ ナ ー ゼ(πの のサ ブユ ニ ッ ト遺 伝 子 を用 い た 。 ク ロ ロフ ィ ルaや バ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィルaの 合 成 系 は,中 間体 で あ る ク ロ ロ フ ィ リ ドaの 途 中 まで は 共 通 して い る。 ク ロ ロ フ ィ リ ドQは そ の 前 駆体 で あ る プ ロ トク ロ ロ フ ィ リ ドa のD環 のC‑17位 とC‑18位 の 間 の二 重 結 合 が,プ ロ トク ロ ロ フ ィ リ ド還 元 酵 素 によ って 還 元 され て 生 じる。 プ ロ トク ロ ロフ ィ リ ド還 元 酵 素 に は 光 を必 要 と
しな い も の(DPOR)と 、光 を必 要 とす る も の(LPOR)の2種 類 が あ る。 光 非 依 存 型 の酵 素DPORは 紅 色 細 菌 と シ ア ノバ ク テ リア に存 在 す る 。 一 方 、 光 依 存 型 の酵 素 は シア ノバ クテ リア と葉 緑 体 にお いて そ の 存 在 が 報 告 され て い る が 、 紅 色 細 菌 か らは見 つ か って い な い。 これ ま で の と こ ろDPORは ど の光 合 成 生 物 か らも 、活 性 を保 持 した 状態 で 単 離 、 精 製 され た例 は 数 例 しか な い 。 そ の た め 、 そ の 機 能 には 不 明 の点 が 多 い が 、 本 酵 素 を構 成 す る3つ の サ ブ ユ ニ ッ ト BchL、BchN、BchBの ア ミ ノ酸 配 列 が ニ トロゲ ナ ー ゼ の3つ の サ ブユ ニ ッ ト NifH、NifD、NifKと 高 い相 同 性 を示 す こ とか ら、 これ らの 両酵 素 間 に構 造 と 機 能 上 の 関 連 性 が あ る ので は な いか との指 摘 が あ る(図2)。 ニ トロ ゲ ナ ー ゼ はN2やC2H2を 基 質 と して 、 これ らのN原 子 問やC原 子 間 の不 飽 和 結 合 を還 元 す る 。 一方 、DPORは プ ロ トク ロ ロフ ィ リ ドのC‑17位 、C‑18位 間 の 不 飽 和 結 合 を還 元 す る の で 、酵 素作 用 の面 か らも類 似 性 が 認 め られ る。 ニ トロゲ ナ ー
⑤ 嚇i㈱
U.a
羽6闇9・ADPか 筆6Pi
麗…≡麗か8H昏2NH3嗣2 縄C…ミC輔 一}号2C=C麗2
C麗◎ →C㌦+陥3
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光非依 還元酵素
図2ニ トロゲナーゼ と光非依存型 プロ トク ロロフィリ ド還元酵 素複合体 の構造 モデル
基 が み られ 、 本 研 究 で 明 らか に され たC.aurantiacusのbchLか ら予 想 され る ア ミ ノ酸 配 列 に も これ らの シス テ イ ンが保 存 され て い る 。 ま た ニ トロゲ ナ ー ゼ は 基 質 と してMg‑Arpを 用 い、NifHにArpを 結 合 す る ア ミ ノ酸 の 配 列 モ チ ー フ (GXXXXGKS)が 存 在 す る 。R.capsulatusのBchL、C.aurantiacusのBchLに
も同様 の モ チ ー フが 見 られ る。 本 研 究 でR.capsulatusのbchLをR.capsulatusの 強 力 な プ ロモ ー ター で あ るpucプ ロモ ー タ ー の下 流 に つ な ぎ、 さ ら にbchLと グル タ チ オ ンS一 トラ ンス フ ェ ラー ゼ と の融 合 蛋 白質 をR.capsulatus内 で発 現 後,精 製 したBchL標 品 のESRシ グ ナ ル を測 定 した と ころ4Fe‑4S型 の鉄 硫 黄 セ ン タ ー 特 有 の シ グナ ル が検 出 され た 。今 後 、 この酵 素 が ど の よ うな 補 欠 分 子 団 を用 い て い る のか そ の解 析 が 待 た れ る。 酸 素発 生 型 光合 成 を行 な う シ ア ノバ クテ リア や 被 子 植 物 以 外 の葉 緑体 にはDPORと 光 を必 要 とす るLPORの 両 方 の酵 素 系 を持 つ 。被 子 植 物 に至 っ て はDPORを 欠 きLPORだ け を 持 って い る 。 酸 素 発 生 型光 合 成 生 物 の進 化 の 過 程 でLPORが 獲 得 さ れ る と、DPORは 次 第 に LPORの 補 助 的 な機 能 しか果 た さな くな り、 被 子 植 物 で はDPORそ の も のが 失 わ れ た と も考 え られ る。
さ らに興 味 深 い こ とに 、バ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィルa合 成 系 で ク ロ ロ フ ィ リ ド aを 還 元 し、 バ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィ リ ドaを 作 る ク ロ ロ フ ィ リ ドa還 元 酵 素
の3つ の サ ブユ ニ ッ トBchX、BchY、BchZは 、DPORのBchB、BchN、BchL
とニ トロゲ ナ ーゼ のNifK、Nim、NifHと そ れ ぞ れ 相 同性 が高 い 。 以 上 の 事 実 か ら次 の よ うな仮 説 が提 唱 で き る 。真 正細 菌 が 分 岐 後 、 ニ トロゲ ナ ー ゼ の遺 伝 子 の重 複 が 起 こ り、 重 複 した 一 方 の遺 伝 子 が 変 異 を受 け、 基 質 特 異 性 が 変 わ っ てDPORが 生 じた 。 この初 期 の 過 程 で 、DPORの 基 質 特 異 性 は 現 存 の 光 合 成 生 物 が持 って い るDPORに 比 べ て 低 く、プ ロ トク ロ ロ フ ィ リ ドのB環 のC‑7、
C‑8位 の 不 飽 和 結 合 とD環 のC‑17、C・18位 不 飽 和 結 合 を 区別 で きず に還 元 し た の で 、 光 合 成 の成 立 当初 か ら既 に バ ク テ リオ ク ロ ロ フ ィルQが 合 成 され て いた と い う仮 説 で あ る。現 在 、 ニ トロゲ ナ ー ゼ に 関 して は研 究 が な り進 み そ の 立体 構 造 も明 らか に な っ て い る がDPORは よ うや く部 分 的 な 活 性 を持 つ 酵 素 の精 製 が さ れ た 段 階 で あ る。 ま た 、 ク ロ ロ フ ィ リ ドa還 元 酵 素 に 関 して は 、
め 、 ニ トロゲ ナー ゼ との 比較 生化 学 的 な研 究 に よ り、 この仮 説 が検 証 され る だ ろ う。
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