[PDF] Life Science News 2003年 初夏号

2∼4

●

Innovations Forum

CodeLink Bioarray

を利用した毒性研究アプリケーションの紹介

5∼7

●

Innovations Forum

Ettan DIGE

システムおよび

Ettan MALDI-ToF Pro

を使用した

ラット肝

S9

フラクションサンプルのタンパク質発現解析

8

∼

10

●

Innovations Forum

薬剤代謝・動態解析への

SPA

および

IN Cell Analyzer

の応用

11

パーソナル質量分析計

Ettan MALDI-ToF Pro

12

∼

13

高感度で確実なウェスタンブロッティング

14

Tricorn

プレパックカラムシリーズ

15

マイクロアレイ解析のパーフェクトシステム

16

∼

18

Product Information

19

TempliPhi

『 結果が出るまでサポートします！宣言 』

20

おしらせ

Life Science News

www.jp.amershambiosciences.com

2003

年 初夏号

Contents

Expression profiling with CodeLink Bioarrays :

Technologies and applications for toxicology

CodeLink Bioarray

を利用した毒性研究アプリケーションの紹介

はじめに マイクロアレイ技術は、網羅的な遺伝子発現レベルの解析に 効率的な研究手法の一つで、再現性・検出感度・信頼性が重要 になります。通常は数µgのtotal RNAをサンプルとして使用し ますが、研究目的によっては微量RNAサンプルで実験を行う必 要があります。そこで、微量RNAサンプルを使用した場合につ いて、データの信頼性を検証しました。その結果、total RNA 200 ngを使用した時にも、total RNA 5 µgを使用した時と相関 性のあるデータを得ることができました。また、種々の薬物存在 下で培養したヒトおよびラット肝細胞の遺伝子発現変動につい て、CodeLink Bioarrayを用いて測定しました。その結果、動物 実験の結果をもとにヒトに対する薬効および毒性を判定すること は難しく、さらに新規化合物の薬効および毒性判定には、既知 化合物に関する大量のデータの中からマイニングを行う必要があ ると改めて認識されました。しかし、分子機能・生物学的プロ セス・細胞内局在に基づいた遺伝子発現変動に関する相関性の 判定により、化合物間の類似性を推定することはできました。 サンプル調製方法に関する条件検討 マイクロアレイ実験では通常数µgのtotal RNAまたは poly(A)＋RNAが必要であり、その純度が解析結果に大きく影 響します。また、biopsyやlaser capture microdissectionにより

単離したサンプルのように、十分な量を得ることができない貴重 なRNAを用いて実験する場合、データの信頼性が低下すること を承知の上で、RNA増幅を繰り返さざるを得ません。 まず、CodeLink Bioarrayの標準プロトコール（1,2）を使 用した場合の、データの再現性および信頼性を検証するため、 6種類の組織または細胞株から、改変TriZOL法（3,4）により

total RNAを抽出し、18回のcRNA増幅を3日間に分けて行い ました。合成したcRNAを用いてCodeLink Bioarrayによるハ イブリダイゼーションを行い、それぞれの遺伝子発現レベルに ついて、ヒエラルキー・クラスター・アルゴリズムによるサン プル間の類似性に基づきクラスター解析を行いました。その結 果、全てのサンプルについて、由来に応じ正確に分類すること ができました（図1）。骨格筋と心筋が1つのクラスター、2種類 のBurkittリンパ腫細胞株（NamalwaおよびCA46V1）が1つの クラスターになりました。肝臓のクラスター内には3つのサブク ラスターがあり、それらは異なる個体サンプルに由来していまし た。また、同じRNAから調製したサンプルでは高い相関性が認 められました。

次に、total RNAとpoly(A)＋RNAをサンプルとした場合の データの相関性について検証しました（3）。ヒト肝臓および

HepG2細 胞 か ら 抽 出 し たtotal RNAか らoligo dT chromatographyによりpoly(A)＋RNAを精製しました。total RNAまたはpoly(A)＋RNAから合成したcRNAを用いて

CodeLink Bioarrayは低発現から高発現まで広いダイナミックレンジにおいて遺伝子変動を再現性よく検出でき ることから、ヒトゲノム解読完了が宣言された今、約3万2千個と推定される遺伝子の機能および相互作用を 解明するためのツールの一つとして、多くの研究者から高い評価を得ています。機能既知遺伝子は細胞中の 発現レベルが高いものが多く、従来の技術で検出できます。しかし、ゲノム情報を利用してはじめて発見さ れた遺伝子は、発現レベルが低いためにこれまで同定されていなかったと考えられます。これらの機能解明 は、CodeLink Bioarrayをはじめ、複数の技術を統合することで達成できると期待されます。

Innovations Forum: CodeLink Bioarray

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図1. ヒトRNAサンプルにおける遺伝子発現データの階層的クラスター解析 骨格筋、心筋、Burkittリンパ腫細胞（NamalwaおよびCA46V1）、HepG2細胞、 肝臓（3検体）、胎盤（2検体）から抽出・精製したtotal RNAを用いて、 CodeLink Bioarrayのプロトコール（1,2）に従ってcRNAを合成し、161枚の UniSet Human I Bioarrays（77サンプルはduplicate、7サンプルはsingle）で 実験を行い、遺伝子発現データのピアソン相関係数による階層的クラスター 解析を行いました。青色は検出限界以下の遺伝子、赤色は高発現の遺伝子を 示しています。 図2. Total RNAまたはpoly(A)＋RNAを出発材料とした場合の遺伝子発現解析 データの比較 Poly(A)＋RNAは、肝臓およびHepG2細胞より抽出したtotal RNAより精製し ました。Total RNAおよびPoly(A)＋RNAから調製されたcRNAは、UniSet Human I Bioarraysにハイブリダイゼーションし、遺伝子発現比をtotal RNA （Y軸）とpoly(A)＋RNA（X軸）とで比較しました。 骨格筋 心筋 Burkitt リンパ腫細胞 HepG2細胞 肝臓 胎盤 0 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 R=0.95 To tal RNA: Lo g 2

Ratios of HepG2 vs Liv

Innovations Forum: CodeLink Bioarray

●

CodeLink Bioarrayによるハイブリダイゼーションを行ったとこ ろ、いずれの遺伝子においてもtotal RNAとpoly(A)＋RNAとで シグナル強度が近似していることが示されました。またヒト肝臓 とHepG2細胞との遺伝子発現比について、total RNAと

poly(A)＋RNAとで比較したところ高い相関（R＝0.95）が認め られました（図2）。

脳のmRNAには、poly(A)＋RNAとpoly(A)−RNAが混在 し、それらが脳の高次機能を司るために重要であると考えられて います。Oligo dTプライマーによるcDNA合成では、poly(A)−

RNAを測定することができないため、ランダムへキサマーをプ ライマーとして、脳および肝臓由来のtotal RNAからcDNAを合 成することを試みました（4）。その結果、いずれの組織において もほとんどの遺伝子で、ランダムへキサマープライマー法より oligo dTプライマー法のほうが高いシグナル強度を示すことがわ かりました。また、脳と肝臓間の遺伝子発現比についてoligo dT プライマー法とランダムへキサマープライマー法の相関係数は 0.69でした（図3）。脳に存在するpoly(A)＋RNAの遺伝子発現 比（脳／肝臓）は、ランダムへキサマープライマー法よりoligo dTプライマー法のほうがより高くなる傾向が見られたことから、 異なるプライマー法により調製されたサンプル間の比較には注意 が必要であるということが示唆されました。 そこで、ランダムへキサマープライマー法を用いずに、微量サ ン プ ル か らcRNAを 合成す る 方法を 検討し ま し た （4）。 CodeLink Bioarrayの標準プロトコールの反応液量および反応時 間を若干変更することにより、200 ngのtotal RNAから CodeLink Bioarrayによるハイブリダイゼーションに十分な量の cRNAを合成することができました。また標準プロトコールによ り調製したcRNAの実験結果と高い相関性（R＝0.93）が見ら れ、遺伝子発現比にも大きな違いは認められませんでした（図

4）。 こ の プ ロ ト コ ー ル はbiopsyお よ びlaser capture microdissectionのような微量サンプルによる遺伝子発現解析に 有用であるということがわかりました。 種々の化合物による遺伝子発現変動の種差および機能分類 創薬の初期段階においてヒトでの副作用や薬物相互作用を予 測するために、ヒト培養細胞を利用して薬物代謝酵素誘導能を 調べることは重要です。薬物代謝酵素の誘導能を測定する方法 としては主に、酵素活性の測定、Western blotting、Northern

図3. cDNA合成反応におけるoligo dTまたはランダムへキサマープライマー間 の遺伝子発現解析データの比較

脳および肝臓から抽出・精製したtotal RNAを用いて、oligo dTまたはランダ ム へ キ サ マ ー プ ラ イ マ ー 法 に よ り cDNAを 合 成 し た 後 、 IVT（ in vitro transcription）反応によりcRNAを合成し、UniSet Human I Bioarraysにハイ ブリダイゼーションしました。脳と肝臓の遺伝子発現比をoligoｄTプライマー法 （X軸）とランダムへキサマープライマー法（Y軸）とで比較しました。

図4. 200 ngまたは5 µgのtotal RNAを出発材料とした場合の遺伝子発現解析 データの比較

リンパ腫細胞および筋組織より抽出・精製したtotal RNA（200 ngまたは5 µg） から1回のIVT反応により合成されたcRNAをUniSet Human I Bioarraysにハイ ブリダイゼーションしました。リンパ腫細胞と筋組織の遺伝子発現比をtotal RNA 200 ng（X軸）とtotal RNA 5 µg（Y軸）とで比較しました。

0 2 4 6 -2 -4 -6 -2 -4 -6 2 4 6 R=0.69 Ln of Br ain / Liv er r atio using N 6 pr iming

Lnof Brain / Liver ratio using oligo dT priming

-10 -10 -5 0 5 10 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8 R=0.93 200 ng Lymphoma / 200 ng Muscle

Cyp1b1, Cyp2a, Cyp2a2, Cyp2a3a,

Cyp2b15, Cyp2c, Cyp2c37, Cyp2c39,

Cyp2e1, Cyp2f1, Cyp4a10, Cyp7a1,

Cyp7b1, Cyp11a, Cyp11b1, Cyp19, Cyp21a1, Cyp27b1

CYP2C9, CYP2C18, CYP2D6, CYP2E,

CYP2J2, CYP2S1, CYP3A43, CYP4A11,

CYP4B1, CYP4F3, CYP7A1, CYP7B1,

CYP8B1, CYP11A, CYP11B2, CYP17,

CYP19, CYP24, CYP26A1, CYP27A1, CYP27B1, CYP46, CYP51, CYP-M

ACCN# OGS PB25 PB50 RF25 RF50 CF25 CF50 OP25 OP50 NM_000499 CYP1A1 0.96 0.92 0.94 1.07 1.16 0.96 26.60 26.08 NM_000761 CYP1A2 1.22 1.26 1.21 1.24 1.52 1.16 6.01 8.48 NM_000104 CYP1B1 0.98 0.91 1.05 1.19 0.72 0.78 6.26 6.92 NM_000767 CYP2B6 1.01 1.22 4.23 4.27 1.02 1.23 1.26 2.01 NM_030878 CYP2C8 1.45 1.20 2.23 1.99 1.45 1.22 1.17 0.97 NM_000777 CYP3A5 1.02 1.28 7.07 7.34 1.23 1.13 3.63 5.34 NM_000765 CYP3A7 2.08 2.09 123.32 107.75 1.60 1.18 21.26 33.28 NM_000500 CYP21A2 1.17 1.05 2.68 2.87 1.16 0.92 1.27 1.42 ACCN# OGS PB25 PB50 RF25 RF50 CF25 CF50 OP25 OP50 NM_138512.1 Cyp2c22 0.94 0.88 2.96 2.56 1.26 1.63 0.93 1.04 NM_013105.1 Cyp3a3 1.00 1.01 2.90 2.96 1.57 2.34 1.11 1.21 M29853 Cyp4b1 1.03 1.08 2.61 2.60 0.60 1.13 0.63 0.73 NM_031241.1 Cyp8b1 1.46 1.00 2.64 1.64 1.73 2.77 1.66 1.42 NM_012753.1 Cyp17 1.35 0.75 4.38 3.54 0.96 1.49 0.63 0.78 表1. ヒトおよびラット培養肝細胞を用いた種々薬物によるCytochrome P450遺伝子発現変動 いずれかの薬物により発現が2倍以上増加したCytochrome P450遺伝子のみ掲載しています。表の右側には、測定した全てのP450分子種の名称を列挙しました。 上段がヒト培養肝細胞を用いた遺伝子発現変動、下段がラット培養肝細胞を用いた遺伝子発現変動のデータを示しています。赤字はヒトとラットとで共通の遺伝 子発現変動を示したP450分子種、青字はヒトとラットとで異なる遺伝子発現変動を示したP450分子種です。

Innovations Forum: CodeLink Bioarray

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blotting（または他の方法によるmRNAの定量）が利用されて います。種々の薬物存在下で培養したヒトおよびラット肝細胞 の酵素活性および遺伝子発現変動を測定し、動物種差および化 合物間の類似性評価を行うにあたって、マイクロアレイ技術の 有用性について検証しました。 ヒトおよびラット培養肝細胞に4種類の薬物（フェノバルビター ル：PB、リファンピシン：RF、クロフィブレート：CF、オメプ ラゾール：OP）を25 µMまたは50 µM添加した後、CodeLink Bioarrayを利用して網羅的遺伝子発現変動を測定した結果、多 くの遺伝子において発現変動が観察されました（表1）。4種類の 薬物によるCytochrome P450遺伝子発現への影響はヒト培養肝 細胞ではラット培養肝細胞より顕著に見られました。また、ヒ トとラットの遺伝子発現変動では全く異なるパターンを示してい ました。このことからラットを用いた薬物代謝酵素誘導試験結 果に基づいてヒトにおける薬物代謝の影響を推測することは難し いということが示唆されました。

次に、CodeLink UniSet Human I Bioarrayに搭載されている

32種類のヒトCytochrome P450遺伝子（CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2D6, CYP2E, CYP2J2, CYP2S1, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, CYP4A11, CYP4B1, CYP4F3, CYP7A1, CYP7B1, CYP8B1, CYP11A, CYP11B2, CYP17, CYP19, CYP21A2, CYP24, CYP26A1, CYP27A1, CYP27B1, CYP46, CYP51, CYP-M） について、3種類の新規化合物による発現への影響と、前述の4 種類の化合物（PB、RF、CF、OP）による発現への影響との相 関性を調べました（図5）。その結果、化合物1は50 µM CF、つ いで25 µM CFとの相関性が高く、化合物2は25 µM CF、ついで 図5. 3 種 類 の 新 規 化 合 物 と 4 種 類 の 既 知 化 合 物 に よ る 3 2 種 類 の ヒ ト Cytochrome P450遺伝子発現変動の相関性 Compound1,2,3のそれぞれによる各種Cytochrome P450遺伝子発現変動を基 準に、他の化合物（1∼11：Ｘ軸）によるP450遺伝子発現変動との相関係数 をＹ軸に示しました。 製品名 包装 コード番号 価格（円）

CodeLink Bioarray Perfect System Basic 1式 問合せ 9,810,000

（内訳）

GenePix Personal 4100A Microarray Scanner, Red only 1 6,060,000

CodeLink INNOVA Shaker 1 1,530,000

Shaker kit, 12 slides 1 170,000

Expression Parallel processing kit, 12 slides 1 550,000

CodeLink System Software 1 1,000,000

PC set for CodeLink System Software 1 500,000

GenePixTM_{Microarray Scanner}

開発製造元：Axon Instrument社／国内総販売代理店：（株）インターメディカル

ご注文情報

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Compound1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Compound2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Compound3 25 µM PBとの相関性が高く、化合物3は25 µM CF、ついで50 µM PBとの相関性が高いことがわかりました。また、化合物2と3は Cytochrome P450遺伝子発現に対して近似した影響を示しました。 新規化合物によるCytochrome P450以外の遺伝子に対する影 響を、分子機能・生物学的プロセス・細胞内局在に基づいた遺 伝子発現変動の相関性により判定しました。ほとんどの分類基 準において化合物2と3は高い相関性を示しましたが、Gene OntologyのCellular componentにおいてMicrosomeに分類され る遺伝子に対しては、化合物1と2が高い相関性を示しました （データ未掲載）。以上のことから、Gene Ontology情報や過去 の知見に基づいて、マイクロアレイ実験で得られたデータをさま ざまな視点から検証することにより、多数の有益な情報を入手 できる可能性が示唆されました。 まとめ マイクロアレイ研究において、サンプルの純度およびハイブ リダイゼーション用ターゲットの調製方法は、データの信頼性 および再現性等に大きく影響する重要な因子です。Total RNA

またはpoly(A)＋RNAのいずれを使用するか、oligo dTプライ マー法またはランダムプライマー法のいずれを利用するか、IVT 反応による増幅を何回繰り返すか等については、研究目的に応 じて適切な方法を選択し、データ解析は統一された手法で得ら れた結果のみについて実施することが必要です。複数の手法 （条件）で得られたデータを混合して解析すると目的以外の遺伝 子がヒットしてしまう可能性があります。 種々の薬物存在下で培養したヒトおよびラット肝細胞における 遺伝子発現変動についての解析結果は、網羅的遺伝子発現解析 において動物の種差を補正することは不可能であるということを 実証しました。また、新規化合物による遺伝子発現変動のデー タから、その機能および毒性を予測するためには、化合物の濃度 および処理時間についての詳細な検討（5）、既存化合物による 網羅的遺伝子発現データベースの構築、さらに、さまざまな視点 からのデータ検証が必要であるということが示唆されました。 ヒトゲノム配列解読完了が宣言された今、生命現象の分子レ ベルでの解明、さまざまな疾患に対する新規治療法の開発、併 用薬の酵素誘導に起因する二次疾患の阻止、テーラーメイド医 療、疾患の診断・予防、薬効・副作用の予測、農業および環境 問題等においてCodeLink Bioarrayを利用したデータが広く有効 活用されることが期待されます。 参考文献

1. Life Science News Japanese Edition 2, 2-4 (2003) 2. Life Science News Japanese Edition 4, 2-3 (2002) 3. Dorris, D.R., et al. Genome Research 12, 976-984 (2002) 4. Sendera, T.J., et al. Neurochemical Research 27, 1005-1026

(2002)

5. Young, M.B., et al. The Pharmacogenomics Journal 3, 41-52 (2003)

1: PB（25 µM） 2: PB（50 µM） 3: RF（25 µM） 4: RF（50 µM） 5: CF（25 µM） 6: CF（50 µM） 7: OP（25 µM） 8: OP（50 µM） 9: Compound1 10: Compound2 11: Compound3

はじめに 医薬品や生体異物（xenobiotics）等の毒性予測が、転写レベ ルの発現プロファイルに基づいて行われるようになってきていま す。そうした流れのなか、毒性評価のためにプロテオーム解析 技術を用いた網羅的なタンパク質発現プロファイリングや、代 用マーカー（surrogate marker）探索が試みられています（1）。 本稿では、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動シス テムEttan DIGEおよびEttan MALDI-ToF Pro質量分析計を 用いたラット肝S9フラクションの2D-MS解析例をご紹介しま す。モデル化合物としてはガン原性芳香族炭化水素の一つであ る3-methylcholanthrene（3-MC）を選択しました。この化合 物は薬物代謝酵素Cytochrome P450 CYP1A1および1A2を誘 導することが知られています。

サンプル調製

処理サンプルとして3-MC投与したオスのSprague-Dawley

ラット（Human Biologics International、RS 804）およびコ ントロールとして未処理ラットの肝S9フラクション（Human Biologics International、RS 804）を使用しました。各々のサ ンプルに4倍量のLysis buffer（7 M urea、2 M thiourea、

4% CHAPS、5 mM magnesium acetate、0.1 mg / ml Pefabloc SCおよびProtector reagent（Roche Diagnostics）、

30 mM Tris-HCl, pH 8.5）を添加し、60分間氷上に静置して タンパク質を可溶化しました。その後約10,000×gで遠心した 上清を蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（2D DIGE）用のサンプルとしました。 コントロール、3-MC処理群、さらに各サンプルを等量ずつ混 合したものを内部標準サンプルとしてそれぞれ150 µg用意しまし た。各サンプルは表1に示すように1,200 pmolのCyDye DIGE Fluors（Cy2、Cy3またはCy5 ）で標識しました。DTTおよび

IPG buffer pH 4-7を添加後、全てのサンプルを混合し（総タン パク量450 µg）、n＝3で2D DIGE解析を行いました（表1）。

2D DIGE解析

サンプルは膨潤液と混合し450 µlに調整後、Immobiline DryStrip pH 4-7, 24 cmの膨潤時に添加しました（20℃、12

時間）。一次元目泳動にはEttan IPGphor Isoelectric Focusing Unitを用い、500 V（60分）→1,000 V（60分）→8,000 V

（∼12時間）のプログラムで、60,000 Vhrsに達した時点で泳 動を終了して、Immobiline DryStripを平衡化溶液中で還元ア ルキル化しました。二次元目はEttan DALTtwelve Large

Electrophoresis Systemにて1 mm厚の12.5 % ポリアクリルア ミドゲルで展開しました。泳動は、ゲル1枚あたり2 Wの一定 電力で一晩行いました。Typhoon 9400によるスキャンで3サ ンプルそれぞれのゲルイメージを取得し、DeCyderソフトウェ アを用いて3-MC処理によるタンパク質発現のディファレンス 解析を行いました。DeCyderソフトウェアのDifference In-gel Analysis（DIA）およびBatch Processorモジュールによりスポ ット検出、定量解析を行い、最終的にBiological Variation Analysis（BVA）モジュールを用いて内部標準サンプルを介し たゲル間のスポットマッチングおよび定量値の標準化、 Student's T-testによる有意差検定を行いました。 解析した全てのゲル間でマッチングされ、危険率（p値） がp＜0.01のスポットについてDeCyderソフトウェアを用い た定量解析を行いました。その結果、1.5倍以上の増加を示 したスポットは15個、2倍以上では4個、そして最も増加した スポットは2.28倍を示しました。一方、減少を示したスポッ トは1／1.5倍以下で9個、1／2倍以下で3個、最も減少した スポットは1／2.17倍を示しました（図1）。 PMF解析によるタンパク質同定 DeCyderソフトウェアによる解析の結果から、3枚のゲル間 全てでマッチングされ1.5倍以上の増加または1／1.5倍以下の 減少、p＜0.01を示したスポットのうち18スポットを 選択して 質量分析サンプルとしました。スポットの切り出し用には解析 に用いたゲルのうち1枚を利用し、SYPRO Ruby（Molecular Probes）染色した後、Ettan Spot Pickerを用いて目的スポット の自動切り出しを行いました。トリプシン消化、抽出、脱塩お よび濃縮はマニュアル操作にて行いました。

Ettan MALDI-ToF Proを 用 い た Peptide Mass Fingerprinting（PMF）解析後、内蔵の デ ー タ ベ ー ス

ProFound＊1_{を使用して同定を行いました（図2、表2）。}

同定されたタンパク質のうち、Formyltetrahydrofolate dehydrogenaseはギ酸代謝に（2）、Fructose-1,6-bisphosphatase

は糖新生に関与している酵素として、Calreticulinは小胞体内腔に

Difference analysis of rat liver S9 fraction

using Ettan DIGE and Ettan MALDI-ToF Pro

Ettan DIGE

システムおよび

Ettan MALDI-ToF Pro

を使用した

ラット肝

S9

フラクションサンプルのタンパク質発現解析

プロテオーム解析の分野で注目されている2D-MS解析法を用いて、ガン原性芳香族炭化水素の一つとして知ら れる3-methylcholanthreneで処理したラットと未処理ラットのタンパク質発現の変動を解析しました。Ettan DIGEにて発現に差異の見られたスポットを検出・選択し、MALDI-ToF Pro質量分析計にてタンパク質の同定を 行いました。従来、2Dイメージ解析、質量分析は操作が煩雑で使いこなすためには専門的な知識・技術が必須 でした。しかしながら、Ettan DIGEおよびEttan MALDI-ToF Proは多くの機能の自動化によりシンプルな操作性 と再現性の向上を実現しており、一人の研究者がサンプル調製、標識、二次元電気泳動から質量分析まで通し て実施することも十分可能であることが示されました。

Innovations Forum : Ettan DIGE & Ettan MALDI-ToF Pro

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ゲル Cy2標識 Cy3標識 Cy5標識

番号 サンプル サンプル サンプル

1, 2, 3 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （150 µg） （150 µg） （150 µg） 表1. CyDye DIGE Fluors標識サンプルの組合せ

＊1 ProFoundにつきましては、一部インターネット上に公開されているものも使用して検 索を行いました（http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe）。

局在する代表的な分子シャペロンとして知られています。

Cytochrome b5はCYP1A1、CYP1A2を 含 む い く つ か の

Cytochrome P450が関与する反応を促進することでも広く知られ ており、重要なタンパク質の一つです。またIodothyronine 5' monodeiodinaseは肝臓等において甲状腺ホルモン、L-thyroxine （T4）を脱ヨウ素することにより、さらに活性が高い3, 5, 3'-L-thyronine（T3）へ変換する作用を有することが知られています。 この酵素の発現量の増加は3-MCの毒性に対するホメオスタシス としての動き、あるいは逆に3-MCの毒性発現の一部に甲状腺ホ ルモン（3）が関与していると示唆している可能性もあります。

Selenium-binding proteinはBansalらによって見出された可溶性 タンパク質であり、Acetaminophen代謝物の解毒作用が示唆され ているAcetaminophen-binding proteinと高いホモロジーを有する ため、何らかの解毒作用への関与が考えられます（4、5、6）が、 機能の詳細は明らかにされていません。最近の報告によると3, 3', 4, 4', 5-pentachlorobiphenyl（PCB126）や3-MC等のAhレセプ ターリガンドによって発現レベルが増加すること、PCB126によっ て転写レベルで誘導されること、Intra-Goldi protein transportに 関与している可能性が示唆されています（7、8）。 Ettan DIGEシステムの解析精度の検証 哺乳類サンプルのタンパク質発現のディファレンス解析を行 う際には個体差を十分考慮する必要があります。つまり、コン トロール群の個体と処理群の個体間で比較した場合、みかけの発 現量の差の中には以下の要因が含まれている可能性があります。 q 特定の処理により誘導される特異的かつ再現可能な現象 w 個体による基底発現レベルそのものの差異 e 個体による感受性の差異 r 実験誤差等 したがって、代用マーカーのような特定の処理によって特異 的な発現量変化を示すタンパク質を探索し、それを基に毒性評 価を行うためには個体差（w,e）、実験誤差（r）によって生 じる変化を除外して考える必要があります。 一方、2D DIGE法（9、10、11）は一般の二次元電気泳動 解析と比較して圧倒的な解析精度（図3）をもつため、タンパ ク質発現の個体差を検出するような実験系を組むことも十分可 能です（表3A、図4）。また、処理特異的な発現量の変化のみ に注目する場合は表3Bのように各個体をn＝1で試験を実施し、 DeCyder BVAによる有意差検定により個体差を他の実験誤差 とともに高精度に除外することが可能と考えられます。目的に 応じてこの実験系を用いることによりゲル枚数を減少させるこ とが可能になります。

Innovations Forum : Ettan DIGE & Ettan MALDI-ToF Pro

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表2. Ettan MALDI-ToF ProによるPMF解析で同定されたタンパク質

図2. Ettan MALDI-ToF ProによるPMF解析で同定されたタンパク質

Protein volume ratio Formyltetrahydrofolate dehydrogenase 5.6 99,970 2.33 24 17/35 1.94 1.5×10-3 Iodothyronine 5’ monodeiodinase 4.9 54,390 2.26 22 9/16 1.63 6.7×10-3 Calreticulin 4.3 48,150 1.00 10 5/7 -2.17 0.1×10-4 Selenium-binding protein 2 6.1 53,080 2.40 31 15/23 2.28 1.8×10-3 Selenium-binding protein 2 6.1 53,080 2.39 28 14/24 2.07 6.2×10-4 Selenium-binding protein 2 6.1 53,080 2.35 24 13/42 1.84 3.5×10-4 Fructose-1,6-bisphosphatase 5.5 40,050 2.26 34 10/22 -1.63 6.7×10-4 Cytochrome B5 5.3 10,660 1.50 59 4/4 2.14 9.4×10-5

Protein name pI MW Est'd Z Coverage (%)

number of matched peptides

/measured peptides p value

図1. 3-methycholanthrene（3-MC）処理したラット肝臓のS9フラクションに おけるタンパク質発現の解析結果 3-MC処理およびコントロールサンプルを24 cmのImmobiline DryStrip pH 4-7を 用いて等電点電気泳動を行い、12.5%のSDS-PAGEで分離しました。DeCyder ソフトウェアで解析し、全てのゲルでマッチングされ（p＜0.01）、1.5倍以上の 増加（青）または1／1.5倍以下に減少（赤）したスポットを示します。それぞ れの円は増減量の相対値（実際の数値を二乗して強調）を表します。

Innovations Forum : Ettan DIGE & Ettan MALDI-ToF Pro

●

製品名 包装 コード番号 価格（円）

Ettan DIGEシステム基本パッケージ＊2 _{1式 問合せ 30,000,000}

Ettan MALDI-ToF Pro 1式 問合せ 35,500,000

Ettan IPGphor Isoelectric Focusing Unit＊3 _{1ユニット 80-6414-02 1,350,000} Immobiline DryStrip pH 4-7, 24 cm 12本 17-6002-46 18,000

24 cm Strip Holder 6本 80-6469-88 280,000

Ettan DALTtwelve Large Electrophoresis System＊4 _{1ユニット 80-6466-46 1,500,000}

Ettan Spot Pickerシステム＊2 _{1式 問合せ 15,000,000}

＊2 詳細は弊社バイオダイレクトラインまでお問合せください。 ＊3 2003年6月30日までキャンペーンを行っております。詳細は本誌18ページをご参照ください。 ＊4 泳動には別途アクセサリーが必要です。詳細は弊社バイオダイレクトラインまでお問合せください。

ご注文情報

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55 1.6 1.65 1.7 1.75 1.8 1.85 1.9 1.95 2 X-fold Percentage W ithin

2D DIGE ＋ DeCyder DIA

2D DIGE ＋ 一般の2Dイメージ解析用ソフトウェア（一例） 銀染色 ＋ 一般の2Dイメージ解析用ソフトウェア 図3. 銀染色法、2D DIGE法でのDeCyder DIAならびに一般（DeCyder以外） のイメージ解析ソフトウェアの解析精度の比較 同一サンプルを2D DIGEまたは2枚のゲルで泳動後銀染色したものをDeCyder DIAまたは一般の2Dイメージ解析用のソフトウェアで定量解析し、ボリュー ム変化（誤差）が少ないスポットから積算しプロットしたもの示します（理 想的には全てのスポットが1となります）。2D DIGE法を行ってもイメージ解 析に一般の2Dイメージ解析用ソフトウェアを用いた場合、同一ゲル由来のイ メージを別個に解析し、スポット認識も独立して行われるので十分な精度が 得られない可能性が考えられます。 図4. Clofibrate投与したラット肝臓ライセート中のあるタンパク質スポットの 発現量の変化 発現量の変化を解析するためコントロール、処理群それぞれ2体のラットを用 意しました。各サンプルはn＝3で2D DIGE解析を行い、DeCyder BVAにより 解析を行いました。解析したスポットは、Clofibrate処理により1／1.4倍の減 少（p＝1.4×10-3_{）を示しましたが、コントロール（1.26倍、p＝2.8×10}-4_） および処理群（1.29倍、p＝4.9×10-4_{）の発現量に個体差が検出されました。} 内 部 標 準 処 理 群 ︵ 個 体 Ｃ ︶ 処 理 群 ︵ 個 体 Ｄ ︶ コ ン ト ロ ー ル ︵ 個 体 Ａ ︶ コ ン ト ロ ー ル ︵ 個 体 Ｂ ︶ まとめ 今回の解析において解毒作用や薬物代謝に関与していると考 えられるいくつかのタンパク質の発現量の変化を定量的に検出 することができました。 トキシコプロテオミクスの分野においても2D DIGE法は目的 に応じた実験系と組み合せることにより非常に強力な実験ツー ルとなりうることがわかりました。 従来、2Dイメージ解析、MS解析は煩雑で使いこなすために は専門的な知識、技術が必須であると考えられてきました。本 報でご紹介したEttan DIGEおよびEttan MALDI-ToF Proで は、多くの機能の自動化と卓越したソフトウェアアルゴリズム によりシンプルな操作性、再現性の向上を実現しています。こ れらの使用により一人の実験者がサンプル調製、標識、二次元 電気泳動からMS解析まで通して実施することも十分可能になる と考えられます。 参考文献

1. Lasantha, R. et al., Drug discovery Today 77, 411-418 (2002) 2. Martinasevic, M. K. et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 114411,

373-381 (1996)

3. Bates, J. M., Endocrinology 114411, 2490-2500 (2000) 4. Bansal, M. P. et al., Carcinogenesis 1100, 541-546 (1989) 5. Ishii, Y. et al., Toxicol. Lett. 8877, 1-9 (1996)

6. Qiu, Y. et al., J. Biol. chem. 227733, 17940-17953 (1998) 7. Porat, A. et al.,

J. Biol. Chem.

227755, 14457-14465 (2000) 8. Ishida, T., J. Health. Science. 4488(1), 62-68 (2002) 9. Unlu, M. et al., Electrophoresis 1188, 2071-2077 (1997) 10. Tonge, R. P. et al., Proteomics 11, 377-396 (2001) 11. Macdonald, N. et al., Arch. Toxicol. 7755, 415-424 (2001)

ゲル Cy2標識 Cy3標識 Cy5標識

番号 サンプル サンプル サンプル 1, 2, 3 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体A） （個体D） 4, 5, 6 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体B） （個体E） 7, 8, 9 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体C） （個体F）

ゲル Cy2標識 Cy3標識 Cy5標識

番号 サンプル サンプル サンプル 1 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体A） （個体D） 2 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体B） （個体E） 3 内部標準 コントロール 3-MC処理群 （個体C） （個体F） 表3A. 個体差も含め高精度にディファレンス解析する場合（ゲル9枚） 表3B. 処理に対して特異的な変化に注目し、個体差は実験誤差として除外する 場合（ゲル3枚）

Scintillation proximity assays for drug metabolism and

pharmacokinetic applications

薬剤代謝・動態解析への

SPA

および

IN Cell Analyzer

の応用

M. Price-Jones

Amersham Biosciences, Cardiff, UK

はじめに 血漿内の主要タンパク質への薬剤の結合は、分布と排泄、す なわちバイオアベイラビリティ（生体内での薬物利用効率）に重 要な役割を果たしています（1）。この結合試験では従来、平衡 透析や限外濾過法が用いられてきました。これらの方法は、時 間がかかり自動化が困難であるため、HTSでのヒット率が増大 し結合試験の需要が増えている現状に対応できませんでした。 さらに、細胞毒性試験で毒性の確認を行う場合、細胞を固定 化し顕微鏡観察に基づいてマニュアルで数値データを得る従来 法は、効率も悪いうえ生体分子の細胞内での動態を正確に把握 することは不可能でした。 本報では、SPA技術の応用により、薬剤代謝試験の主要ター ゲットである血漿中の結合タンパク質Cytochromeとの相互作用 について、試験のハイスループット化を図り、また、IN Cell Analyzer 3000により多数の生細胞を同時解析し、自動データ処 理を行った結果をまとめました。

Human Serum Albumin (HSA) [3_{H] SPA Binding Assayほか} 血漿タンパク質（ヒト血清アルブミン、α1-acid glycoprotein、 高密度または低密度リポタンパク質）をイットリウムシリケート SPAビーズの表面に結合させます。使用するのは、コムギ胚凝集 素（WGA）またはポリリジン処理ビーズと未処理ビーズで、そ の種類は使用する血漿タンパク質により異なります。血漿タンパ ク質上の既知の結合部位に対する各種リガンドを3_{H標識し、競} 合結合試験に使用します。標識リガンドが未知化合物により置 換されると、血漿タンパク質にその化合物が結合したことがわか ります（図1）。この反応結果から定性的なデータとEC50値（半 数影響濃度）を得ることができます（2∼4）。 血清アルブミンは、ヒト血漿に含まれる主要な結合タンパク質 です。結合部位は複数ありますが、薬剤が結合する部位は主に

warfarin（IIA）およびdiazepam（IIIA）結合部位の2ヶ所です （1）。warfarinとdiazepamは多くの結合試験に使用されており、

個別に使用することも同一試験で併用することも可能です（図2）。 新規の薬剤ターゲットの増加に伴って大量の新規化合物のスクリーニングが必要となり、ハイスループット

スクリーニング（HTS）技術の飛躍的な向上へとつながりました。初期のスクリーニングプロセスでより多く の化合物が処理できるようになった結果、薬剤代謝・動態解析（DMPK）をハイスループット化する必要性が 高まっています。Scintillation Proximity Assay（SPA）はホモジニアスなアッセイ系で、自動化が容易であるた め、初期のスクリーニングに広く用いられてきました。SPAは血漿タンパク質との結合やCytochrome P450と の相互作用を測定する試験にも使用されています。また、従来の細胞毒性試験では、細胞を固定化して顕微 鏡により確認するために処理能・結果の精度ともに限界がありましたが、IN Cell Analyzer 3000を用いること で、処理能を向上させるだけでなく、生細胞内で実際に起きている反応のリアルタイム解析も可能になりま した。

Innovations Forum:SPA／IN Cell Analyzerの応用

●

図1. Human Serum Albumin (HSA) [3_{H] SPA Binding Assayの原理 図2. HSA [}3_{H] SPA Binding Assayにおけるシグナルとバックグラウンドの比較}

結果は平均値±標準偏差（n＝3）

[3_{H] diazepam [}3_{H] warfarin} combined ligands 0 2000 4000 6000 SP A cpm total NSB

Innovations Forum:SPA／IN Cell Analyzerの応用

●

α1-acid glycoproteinは基本的な薬剤が血漿中での主要な結合 ターゲットであり（5）、リガンドとして[3_{H] propanololを用い} た結合試験が可能です。 高／低密度リポタンパク質は疎水性薬剤の結合において重要 性を増してきており（6）、[3_{H] imipramineを用いて試験を行い} ます。

Cytochrome P450 (CYP3A4) [3_{H] SPA Competition}

Binding Assay 血漿タンパク質との結合に加えて、新薬候補化合物について 検討すべき事項は、Cytochrome P450（P450）酵素とそれら がどのように相互作用するかという点です。これにはSPA技術を 用いた2つの試験方法、すなわちⅠ. 血漿タンパク質の結合試験 と同様の原理を用いた競合結合試験、あるいはⅡ. SPAビーズを 用いて反応生成物を回収する通常の酵素試験（次項参照）が適 用できます。 競合結合試験（Ⅰ.）の反応原理を図3に示します。Sf9細胞に トランスフェクションした3A4分子はミクロソーム内に発現しま す。使用するリガンドは[3_{H] ethynylestradiolです。コントロー} ルには、トランスフェクションしていない細胞由来のミクロソー ムを用います。NADPH存在下でミクロソームおよび[3_H] ethynylestradiolと評価化合物を反応させます。その後、未処理 のイットリウムシリケートビーズを加えてミクロソームを回収し ます。評価化合物が[3_{H] ethynylestradiol に代わってCYP3A4} 部位に結合した場合、シグナルが弱まり、結合が確認できます （7）。この反応はシンプルなため、創薬プロセスの初期段階で CYP3A4結合物質の選別を可能にします。 競合結合反応を用いて、P450基質／阻害剤として知られて いるいくつかの化合物をスクリーニングした結果を、表1に示 します。

Cytochrome P450 (CYP2D6) [14_{C] SPA Activity Assay} 前項Ⅱ.に相当するSPA技術を応用したP450酵素との相互作用 試験では、[14_{C] formaldehydeと反応する既知の}14_{C標識基質に} よる酵素反応を利用します。反応後は、HPLCによる精製物質 やイオン交換カラムに結合している物質を測定する代わりに、 SPAビーズに結合している物質を測定します（8）。CYP2D6用 試験の原理を図4に示しました。

Cytochrome P450 (CYP2D6) [14_{C] SPA Activity Assayは、}

組換えCYP2D6ミクロソーム、ヒト肝臓由来のミクロソームの いずれを用いた場合でも、CYP2D6阻害剤として有効なもの （IC50＜2 µM）とそうでないもの（IC50≧20 µM）を区別でき ることが報告されています（8）。 ※IC50とは、相互作用の50%を阻害するのに必要となる濃度を示します。 IN Cell Analyzerによる高感度測定 IN Cell Analyzer 3000と市販のアポトーシスマーカーにより、 生細胞および固定細胞について、複数の副次的な毒性反応の同 時解析・数値化が可能です（9）。図5はStaurosporine（protein kinase Cの強力な阻害剤）を添加してから4時間後の画像です。 図5AにHoechst 33342（青）およびMitotracker（赤）、P450 リダクターゼ組織染色（緑）の検出結果を重ね合わせた状態を 示します。添加前の核・細胞質のデータはあらかじめ数値化さ れ、比較解析に用いられます。添加量の増加に伴ってシグナル が上昇したのは、Hoechst 33342による細胞の核染色とP450 リ ダクターゼ組織染色の場合で、逆にMitotrackerによる細胞質の 斑点状の染色には減少がみられました（データ未掲載）。また、 従来法のAlamar Blue試験では、添加量の増加に伴う有意な変 動はみられませんでした（図6）。IN Cell Analyzerでは、細胞数 だけでなく核やミトコンドリアについて高感度のアポトーシス測 定が可能です。測定感度は従来のAlmar Blueによる染色よりも 高いことが示されました。 Compound Control Salmeterol Midazolam Ketoconazole Chlorzoxazone Budesonide Quinidine Tolbutamide GW-X Ranitidine Phenacetin Bufuralol Erythromycin P450 (cpm) 10606 7183 7540 4912 10123 7356 6556 8998 4952 9098 9048 8859 4712 Control (cpm) 4701 4097 6357 4184 4229 4055 3984 4092 4248 4310 4303 4698 4978 Corrected value(cpm) 5905 3086 3354 0 5894 3301 2572 4906 704 4789 4745 4161 0 Type 3A4 substrate 3A4 substrate 3A4 inhibitor 2E1 substrate 3A4 substrate 3A4 substrate 2C9 substrate UNKNOWN 2D6 inhibitor 1A2 substrate 2D6 substrate 3A4 inhibitor % Control 100 52 57 0 100 56 44 83 12 81 80 71 0

表1. Cytochrome P450 (CYP3A4) [3_{H] SPA Competition Binding Assayの}

スクリーニング結果

図3. Cytochrome P450 (CYP3A4) [3_{H] SPA Competition Binding Assayの原理}

図4. Cytochrome P450 (CYP2D6) [14_{C] SPA Activity Assayの原理}

[o-methyl-14_{C]dextromethorphanを基質として使用した場合。反応生成物であ} る[14_{C] formaldehydeは、ポリビニルトルエンまたはイットリウムシリケート} ポリエチレンイミンSPAビーズに結合します。 O 14C N OH N CYP2D6 NADPH + [ 14_C]-HCHO dextrorphan formaldehyde [o-methyl-14_C] dextromethorphan

Innovations Forum:SPA／IN Cell Analyzerの応用

●

製品名 包装 コード番号 価格（円）

Human Serum Albumin (HSA) [3_{H] SPA Binding Assay 5×96 wells TRK1093 近日発売予定} High Density Lipoprotein (HDL) [ 3_{H] SPA Binding Assay 5×96 wells TRK1092 近日発売予定} Low Density Lipoprotein (LDL) [ 3_{H] SPA Binding Assay 5×96 wells TRK1094 近日発売予定} Alpha 1-Acid Glycoprotein (AGP) [ 3_{H] SPA Binding Assay 5×96 wells TRK1090 近日発売予定} Cytochrome P450 (CYP3A4) [ 3_{H] SPA Competition Binding Assay 5×96 wells TRK1091 近日発売予定} Cytochrome P450 (CYP2D6) [14_{C] SPA Activity Assay 5×96 wells CFA772 近日発売予定}

IN Cell Analyzer 3000 1 問合せ 問合せ

Scintillation Proximity Assay Technology is covered by US patent number 4568649, European patent number 0154734 and by Japanese patent application number 84/52452.

ご注文情報

まとめ 本報でご紹介した６種のキットは、SPAを利用し、ヒト血清 アルブミン、α1-acid glycoprotein、高／低密度リポタンパク質 などの主要な血漿タンパク質への結合を測定するツールです。こ れらのキットによる試験は、DMPK分野で従来用いられてきた 平衡透析や限外濾過法などに代わる現実的なハイスループット 測定法で、質的および量的情報が得られます。SPAの汎用性は、 Cytochrome P450 （CYP3A4） 競 合 結 合 試 験 お よ び Cytochrome P450（CYP2D6）活性測定試験のハイスループッ ト化を可能にしました。 さらに、こうした解析にIN Cell Analyzerを使用することで、 薬剤投与に対する複数の反応を同時にしかも従来法よりも高感 度に検出・解析することが可能になります。 参考文献

1. Kragh-Hansen, U. et al. Pharmacol. Rev. 33, 17-53 (1981). 2. Berry, J. et al. Abstracts of the 5th Annual Conference and

Exhibition of the Society for Biomolecular Screening 1999,

Society for Biomolecular Screening, Edinburgh, p.104 (1999). 3. Berry, J. et al. Abstracts of the 6th Annual Conference and

Exhibition of the Society for Biomolecular Screening 2000,

Society for Biomolecular Screening, Vancouver, p.172 (2000). 4. Berry, J. et al. Abstracts of the 7th Annual Conference and

Exhibition of the Society for Biomolecular Screening 2001,

Society for Biomolecular Screening, Baltimore, abstr.10039, p. 207 (2001).

5. Kremer, J.M.H. et al. Pharmacol. Rev. 40, 1-47 (1988). 6. Wasan, K.M. and Cassidy, S.M., J. Pharm. Sci. 87, 411-423

(1988).

7. Hopkins, A. et al. Abstracts of the 4th Annual Conference and

Exhibition of the Society for Biomolecular Screening 1998,

Society for Biomolecular Screening, Baltimore, abstr SDAT-4, (1998).

8. Delaporte,E. et al. J. Biomol. Screening 6, 225-231 (2001). 9. Jan Turner, Samantha Murphy, Elaine Adie, Angela Williams,

Molly Price-Jones. Poster of the 8 th annual Conference of the

Society of Biomolecular Screening, 22-26 September 2002. The Hague, Netherlands.

※ 本報では、2002年9月にオランダにて行われたThe 8 th annual Conference of the Society of Biomolecular Screeningで発表された ポスターの内容を一部抜粋し使用しております。

図5. IN Cell Analyzer 3000により、初代ラット肝細胞をStaurosporineに4時間 反応後に得られた画像

(A) はHoechst 33342（青）およびMitotracker（赤）、P450 リダクターゼ組織染 色（緑）の検出結果を重ね合わせた画像。 (B)∼(D)では、それぞれ Hoechst 33342染色（青）、Mitotracker染色（赤）、P450 リダクターゼ組織染色（緑）を 別々に示しています。リアルタイムでもオフラインでも画像解析を行うこと が可能です。

A

B

C

D

図6. 複数のホモジニアスアッセイ（multiple homogeneous assay）の結果 初代ラット肝細胞を0∼5 µM Staurosporineに4時間反応させ、反応前後の変 動を数値化し、従来法のAlmar Blue試験の結果と比較しました。核染色、 Mitotracker染色が従来のAlmar Blueよりも高感度であることがわかります。 Hoechst Histology Cell Number Mitotracker Almar Blue Concentration (µM) Percentage of control

Ettan MALDI-ToF Pro

クワドラティックフィールドリフレクトロンによる迅速な

PMF

および

PSD

解析

＊1

優れた検索エンジンにより、簡便かつ自動でのタンパク質同定・解析が可能

サンプルスライドローダーによる自動運転

CAF-MALDI

＊2

_{専用試薬キットにより}

_PSD

_{を用いたアミノ酸配列解析を簡便操作で実現}

製品名 包装 コード番号 価格（円）

Ettan MALDI-ToF Pro 1式 問合せ 35,500,000

Ettan Sample Slide Kit 2×12枚 18-1147-18 19,500

ご注文情報

パーソナル

質量分析計

Ettan MALDI-ToF Pro

タンパク質の発現解析手法として

2D-MS

解析

が注目されています。特に最終段階となる質

量分析計（

MS

）による同定は、欠くことので

きないキーテクノロジーでありながら装置に

ついての高度な知識や熟練が必要でした。

Ettan MALDI-ToF Pro

は、「誰にでも使いやす

い」をコンセプトとする

MS

で、簡便操作で迅

速に信頼性あるデータを得ることが可能です。

2D-MS

解析をもっと身近に

Ettan MALDI-ToF Pro

サンプルスライドローダー

カタログ番号 71-1793-03

Ettan MALDI-ToF Pro

本体

（サンプルスライドローダー付き）

サ ン プ ル ス ラ イド ロ ー ダ ー を

用いれば、一度に

288

サンプルの

自動測定が可能

サンプルスライドトレイ

＊1 PMF（Peptide Mass Fingerprinting）解析は、質量分析計による最も一般的なタンパク質同定法です。PSD（Post-Source Decay）解析とは、MALDI法において 選ばれた特定イオンをさらに分解してアミノ酸配列などのより詳しい情報を得る方法の一つで、PMF解析結果の確認や同定率の向上の目的で用いられます。 ＊2 Chemically Assisted Fragmentation-Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization

Printing

Ettan MALDI-ToF Pro

THE COM TO M IN PR

Ettan MALDI-ToF Pro

71-1793-03 （データ提供：Prof. Dr. Angelika Görg, Technische Universität, Müchen, Germany）

（データ提供：Prof. Dr. Angelika Görg, Technische Universität, Müchen, Germany）

2D-MS解析におけるパーソナル質量分析計

Ettan：スウェーデン語で「No. 1」を意味します。

プロテオミクスにおいてアマシャム バイオサイエンスが 研究者の皆様をNo. 1に導くお手伝いをしたいという気持ちが込められています。

Ettan MALDI-ToF Pro

の解析原理や

性能・操作性を、実サンプルの解析

データとともにご紹介しています。

Ettan MALDI-ToF Pro

カタログ

高感度で確実な

ウェスタン

ブロッティング

ECL DualVue

マーカーはブロット上では着色バンド、検出時

は発光シグナルとして確認が可能なマーカーです。ブロッ

ティングの際の転写確認および

ECL

化学発光検出時にはサ

イズマーカーとしてお使いいただけます。高感度ウェスタ

ンブロッティング

ECL Advance

と組み合せてお使いいただ

くことでブロットのトランスファー効率の確認から目的の

タンパク質の検出までをさらに確実に行えます。

ECL

シリーズに多機能マーカーと最高感度検出試薬が登場

ECL DualVue Western Blotting Markers &

ECL Advance Western Blotting Detection Kit

ウェスタンブロッティング用の多機能マーカー

ECL DualVue Western Blotting Markers

ECL DualVue

Western Blotting Markers

ブロッティング状態の目視確認が可能

ECL

化学発光検出時にサンプルと同時に検出が可能

シャープなバンドで分子量推定が容易

DualVue Western Blotting Markers

の検出原理

ECL DualVue Blotting Markers

は

3

種類の着色済みタンパ

ク質と

7

種類の

S-tagged

タンパク質を混合したマーカー

です。ブロッティング時には目視で実験状態が確認で

きます（左図

A

）。また、ウェスタンブロッティングの

抗体反応ステップでキットに付属の

S-Protein-HRP

を添

加することにより、

ECL

化学発光検出時に目的タンパ

ク質と

S-tagged

タンパク質のバンドを一枚のブロット

上で同時に検出することができます（左図

B

）

。

A）SDS-PAGE後、Hybond-ECLニトロセルロースメンブレンにトランスファー した状態。3本のシャープな着色バンドが目視確認できます。

B）A）のブロットをS-Protein-HRPとECL Western blotting detection reagentsを 用いて検出した結果（Hyperfilm ECLに1分間露光）。7本のS-taggedタンパ ク質のバンドが検出されています。

ブロッティング効率の確認から化学発光検出まで行えるECL DualVue Western Blotting Markers

＊1 Full-range Rainbow Molecular Weight Markersは着色済みタンパク質を含むマーカーで、ブロッティング時のトランスファー効率を視覚的に確認できます。

＊2 ECL Western Blotting Molecular Weight Markersはビオチン標識したタンパク質を含むマーカーで、HRP標識ストレプトアビジンを加えてECL化学発光検出時に同一メンブレン上で 検出します。

※ Full-Range Rainbow Molecular Weight Makers（RPN800）にはS-taggedタンパク質が含まれており、ECL DualVue Western Blotting Makers用のS-Protein-HRPで高濃度に検出されてしまうた め併用できません。

泳動中のモニター

ECL Western Blotting

Molecular Weight Markers

ブロッティング後の 転写確認

化学発光での 特異的検出

ECL DualVue

Western Blotting Markers

Full-Range Rainbow Molecular

Weight Marker

＊1 ＊2

NEW

100 kDa

16 kDa

15 kDa

150 kDa

100 kDa

75 kDa

50 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

A

B

最高感度の

ECL

ウェスタンブロッティング検出システム

ECL Advance Western Blotting Detection Kit

ECL Advance

Western Blotting Detection Kit

ECL Plus

と比較して最高

10

倍の高感度を実現

専用ブロッキング試薬でバックグラウンドを低減

サンプル・抗体使用量の節約が可能（ブロット面積あたり）

80 ngから等倍希釈したBSAをSDS-PAGE後、Hybond-P（PVDFメンブレン）に転 写しました。一次抗体として抗BSA抗体（1:20,000）、二次抗体としてHRP標識 抗ラビット抗体（NA934、1:200,000）を反応させました。ECL Advance/ECL Plus

検出試薬を用いて検出し、X線フィルム（Hyperfilm ECL）へ10分間露光しました。 80 ng ↓ 80 ng ↓

ECL Advance

ECL Plus

トップページ

a

_{Technical Support}

●

製品Q&A

a

_{ECL Advance Western Blotting Detection Kit}

ホームページにも製品情報が満載です！

Web

http://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/faq/lab/ecl_advance.asp

URL

製品名 包装 コード番号 価格（円）

ECL DualVue Western Blotting Markers 1 pack (25 loadings) RPN810 25,000 ECL Advance Western Blotting Detection Kit 1 kit for 1,000 cm2_{membrane RPN2135 45,000} Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers 500 µl RPN800 23,000 ECL Western Blotting Molecular Weight Markers with Strep-HRP 1 pack RPN2280 18,000

毒

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ECL Advance Western Blotting Detection Kit Q&A

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ECL Advance Western Blotting Detection Kit

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ECL Advance Western Blotting Detection Kit

http://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/tech_material/pdf/ecl_advance_prot.pdf

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関連資料も充実しています

Printing

ECL

ウェスタンブロッティング検出システムプロトコール

Vol.3

（カタログ番号：71-1289-06）

ECL

、

ECL plus

、

ECL Advance

それぞれのプロトコールから各製品間の移行の

ポイント、トラブルシューティングなどを満載した充実の一冊です。

ECL Western Blotting Detection System

（カタログ番号：71-2067-01）

ECL

ウェスタンブロッティングシステムのラインナップから関連製品まで

ご紹介しています。

EC

L

W

estern Blotting

Detection System

ECL

Western Blotting Detection System

ECL

Western Blotting Detection System 71-2067-01 弊社代理店までご請求ください。

Tricorn

プレパックカラム

シリーズ

生 体 分 子 精 製 用 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー シ ス テ ム

ÄKTAdesign

シリーズに直結可能な

1/16

インチネジ仕様

の高性能プレパックカラムシリーズです

＊

_{。タンパク}

質精製の最終ステップに最適な担体とカラムサイズの

組合せをご用意しています。用途や精製ステップに適

したプレパックカラムをお選びいただくことで、より

シンプルに生体分子を高純度精製することができます。

＊Tricornカラムのプレパックシリーズは中・高圧の液体クロマトグラフィーシステムにの み対応しております。ÄKTAprime（耐圧1 MPa）では使用できませんのでご注意ください。

タンパク質の最終精製ステップに最適

Tricorn

ÄKTAdesign

システムに直接接続可能

＊

旧

HR

カラムと

PE

カラムの伝統を引き継ぐ高い分離能

使いやすい三角形の上下キャップ形状

M6

変換コネクター付きなので

FPLC

での利用も可能

Tricorn Superdex / Mono Q & S Columns

精製目的に合わせてお選びください

製品名

用途／目的

仕様

Superdex 75 10/300 GL

Superdex 200 10/300 GL

Superdex Peptide 10/300 GL

Mono Q 5/50 GL, 10/100 GL, 4.6/100 PE

Mono S 5/50 GL, 10/100 GL, 4.6/100 PE

荷電基：-SO_{結合容量（IgG）：75 mg / ml gel}3−

ゲルろ過による 組換えタンパク質の分離 分画範囲（Da）： 球状タンパク質 3,000∼70,000 分画範囲（Da）： 球状タンパク質 10,000∼600,000 分画範囲（Da）： ペプチド 100∼7,000 荷電基：-N＋_{(CH3) 3} 結合容量（HSA）：65 mg / ml gel ゲルろ過による組換えタンパク質と モノクローナル抗体の最終精製ステップ ゲルろ過による低分子物質、 ペプチドなどの分離 強陰イオン交換を利用した タンパク質の分取 強陽イオン交換を利用した タンパク質の分取 製品名 包装 コード番号 価格（円） Superdex 75 10/300 GL 1 17-5174-01 200,000 Superdex 200 10/300 GL 1 17-5175-01 200,000 Superdex Peptide 10/300 GL 1 17-5176-01 200,000 Mono Q 5/50 GL 1 17-5166-01 154,000 Mono Q 10/100 GL 1 17-5167-01 640,000 Mono Q 4.6/100 PE 1 17-5179-01 190,000 Mono S 5/50 GL 1 17-5168-01 154,000 Mono S 10/100 GL 1 17-5169-01 640,000 Mono S 4.6/100 PE 1 17-5180-01 190,000

ご注文情報

プレパックカラムカタログ2003

弊社代理店までご請求ください

Printing

●

組換えタンパク質や抗体精製に便利なカラムセットをご紹介しています

●

初期から最終精製までの各ステップに最適なプレパックカラムを豊富な製品ラインナップ

からお選びいただけます

カタログ番号：71-1987-03

マイクロアレイ

解析の

パーフェクトシステム

CodeLink Bioarray

は、従来のマクロアレイで

は解析が困難だった低発現遺伝子の網羅的発

現解析も行える可能性を持つ、新世代のプレ

アレイスライドです。得られるデータは定量

PCR

の結果とも高い相関性を示し、いままで

は検出不可能であったパスウェイ上流の転写

因子などの低発現遺伝子の解析も可能です。

CodeLink Bioarrayについては、2∼4ページの記事もあわせてご覧ください。

見えなかった低発現遺伝子をつかむ

CodeLink Bioarray Perfect System

CodeLink

定量

PCR

に匹敵する感度で低発現遺伝子の網羅的解析が可能

サンプル調製から解析ソフトまでを含んだパーフェクトシステムにより最高のパフォーマンスを実現

実サンプルを用いた機能試験によりデザインされた最適配列の

30 mer

プローブを採用

三次元構造スライドの採用により高いハイブリダイゼーション効率を実現

CodeLink Expression Bioarray

UniSet Human 20K I （約20,000 genes）

UniSet Human I （約10,000 genes）

UniSet Human II （約10,000 genes）

UniSet Mouse I （約10,000 genes）

UniSet Rat I （約10,000 genes）

ADME Rat （約 1,000 genes）

製品名 包装 コード番号 価格（円）

CodeLink Bioarray Perfect System Basic 1式 問合せ 9,810,000

（内訳）

GenePix Personal 4100A Microarray Scanner, Red only 1 6,060,000

CodeLink INNOVA Shaker 1 1,530,000

Shaker kit, 12 slides 1 170,000

Expression Parallel processing kit, 12 slides 1 550,000

CodeLink System Software 1 1,000,000

PC set for CodeLink System Software 1 500,000

GenePixTM_{Microarray Scanner}

開発製造元：Axon Instrument社／国内総販売代理店：（株）インターメディカル

ご注文情報

オリゴプローブ

ポリアクリルアミド

Gene List（搭載している遺伝子のリスト）については下記URLをご参照ください。

www.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/codelink_literature NEW CodeLinkプレアレイスライドの表面構造（イメージ） スライドガラス上にポリアクリルアミド層を形成させ、プロー ブはこの層の中で自由度をもって固定されています。そのため ターゲットと自由度をもってハイブリダイズすることが可能で、 感度、特異性、再現性が高く、低バックグラウンドな結果を得 ることができます。

DeStreak Rehydration Solution

●

Product Information

DeStreak Rehydration Solution

コード番号：

17-6003-195

×

3 ml

14,000

円

DeStreak Reagent

コード番号：

17-6003-18

1 ml

7,000

円 ●二次元電気泳動の塩基性領域の分離を改善 ●サンプルの非特異的酸化を防止し、ストリーキング （横すじ）、偽スポットを軽減

DeStreak Rehydration Solution

は、

urea

、

thiourea

、

CHAPS

、

DeStreak Reagent

を含むプレミックスタイプ

の膨潤液で、

IPG Buffer

を加えるだけで使用できます。

独自の組成の膨潤液を使用する場合には

DeStreak

Reagent

をご使用ください。

固定化pH勾配ゲルImmobiline DryStrip専用の膨潤試薬

pH 6 pH 9 pH 6 pH 9 標準的な膨潤液を用いた場合 DeStreak Rehydration Solutionを用いた場合 膨潤液：1 % IPG Buffer pH 6-11, 8 M urea, 0.5 % CHAPS, 10 mM DTT 膨潤液：1 % IPG Buffer pH 6-11を 含むDeStreak Rehydration Solution

サンプル ：Mouse liver protein, 80 µg

一次元目 ：Immobiline DryStrip pH 6-9, 24 cm / Ettan IPGphorにて泳動 二次元目 ：SDS-PAGE（12 %）/ Ettan DALTtwelveにて泳動

染  色 ：PlusOne Silver Staining Kit, Protein

使用上の注意：DeStreak Rehydration Solution、DeStreak Reagentは

pH 6-9、6-11、3-10、3-10NLのImmobiline DryStripにおいて効果を発 揮します。またDeStreak Rehydration Solution、DeStreak Reagentの使用 にはロットNo.294813以降のImmobiline DryStripを推奨しています。こ のロットNoより前に製造されたImmobiline DryStripでは効果が得られな いことがありますのでご注意ください。

RediGrad

細胞・細胞内顆粒・ウイルス分離用密度勾配媒体

コード番号：

17-1270-02

250 ml

24,700

円 ●等浸透圧溶液に調整後の再滅菌が可能 ●細胞毒性をチェック済（エンドトキシンレベル ＜2 EU / ml） ●分離媒体として実績あるPercollの実験結果を再現可能

NEW

Ficoll Ficoll-Paque Percoll RediGradNew

Cells Organelles Viruses 密度勾配作製用媒体の選択

ホームページに製品

Q&A

公開中！

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Web

http://www.jp.amershambiosciences.com

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_{Technical support}

_●製品Q&A a_{DeStreak Rehydration}

Solution / DeStreak Reagent（●電気泳動システム、試薬）

RediGrad

の他にも、細胞分離・細胞培養に関する製

品を各種取り揃えています。

ホームページに製品情報公開中！

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http://www.jp.amershambiosciences.com

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_Products

_{●製品情報}a_{●アッセイシステム、細胞分離} 使用上の注意：本品はin vitroにおける細胞、細胞内顆粒、ウイルス等 の分離のために開発された研究用試薬です。ヒト精子分離のための遠心 媒体としての使用を目的としたものではありません。