解
説
フ ロ ン テ ィ ア研 究 シ リー ズ
Review: Frontier Research SeriesJ.Soc. Powder Technol., Japan, 44, 122-126 (2007)
コ ロイ ド科 学 的手法 に よる微 生物 の付 着制御
Control of Microbial Adhesion with Colloid Science Techniques
野村 俊之
Toshiyuki Nomura
The microbial adhesion is positively utilized for the immobilization of microorganisms in bioreac-tors although it causes troubles in medical implants and devices, food, metallic corrosion, pipeline, dental caries. Microbial adhesion is inevitable when solid surfaces are exposed to an aqueous phase. However, the mechanism of microbial adhesion to solid surface has not been well understood. In this paper, the interactions between microorganisms and solid surfaces are briefly reviewed. From the view-point of the colloid science, the measurements of the microbial surface characteristics, analysis of the microbial adhesion and its application are introduced.
Keywords: Microorganism, Microbial adhesion, Biocolloid, Interaction, Anaerobic biotechnology
1. は じめ に 微 生 物 の 付 着 現 象 は,固 定 化 微 生 物 を 用 い た バ イ オ リ ア ク タ ー に よ る 有 価 物 生 産 や,固 定 生 物 膜 リア ク タ ー に よ る環 境 浄 化 な ど に お い て 積 極 的 に 利 用 され て い る一 方 で,食 品 汚 染,医 療 器 具 汚 染,金 属 腐 食,配 管 の 目 詰 ま り,虫 歯 な ど,ト ラ ブ ル の 原 因 に な る こ と も多 い 。 こ の よ う な 微 生 物 の 付 着 現 象 は,身 の 回 りや 自 然 界 な ど に 多 種 多 様 に 存 在 す る 界 面 に お い て頻 繁 に 観 察 され る に もか か わ らず,そ の 基 礎 と な る微 生 物 の 固 体 表 面 へ の 付 着 メ カ ニ ズ ム の 詳 細 は 明 らか に され て い な い の が 現 状 で あ る。 した が って,コ ロ イ ド科 学 の 側 面 か ら,微 生 物 の 表 面 の 性 質 を 知 り,固 体 表 面 へ の 付 着 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る こ と は,工 業,農 業, 医 学 な ど の あ らゆ る 分 野 に お い て,付 着 した 微 生 物 を
利 用 も しくは駆除 した り,微 生物 の付着 を予 防 した り
す る上 で極 めて重 要 な課題 で あ ると言 え る。
本稿 で は,環 境 中の微生 物 に働 く相互 作 用 につ いて
概 観 し,筆 者 が これ まで に行 って きた微 生物 の表 面性
状 評価,お よ びそれ らの測 定結 果 に基 づ いた微生 物 の
付 着現 象 に関す る検討 とその応 用 につ い て紹 介す る。
2. 微生物 に働 く相 互作 用
2.1
DLVO理
論
微生 物表 面 には,カ ル ボキ シル基,リ
ン酸 基,ア
ミ
ノ基 な どの解離基 が存 在 して お り,通 常 の条件(中 性
領 域)で は,カ ル ボキ シル基
リン酸基 が解 離 して 負
に帯電 して い る。 また,カ チオ ンは アニ オ ンに比 べ て
水 和 され やす いので,カ チオ ンは水 溶 液 中,ア ニオ ン
は界面 に移 動 して安定 化 しや す く,環 境 中に おけ る界
面 は微 生物 と同 じ く負 に帯 電 して い る ことが多 い。界
面 にお ける微生物 の挙 動 は,微 生物 表層 と固体界 面 の
表 面 電 荷 に起 因 す る静 電 斥 力 と,物 質 を構 成 す る分
子 間 に 普遍 的 に働 くvan der Waals力
を考 慮 した
DLVO理
論 に よ り議 論 され て き た1)。 しか し,微 生
物 の付着現 象 を考 え る場 合,こ れ だ けで は不十 分 な場
合 もあ り,疎 水 性相互 作 用,微 生物 表 層 の柔 らか さ,
微生物 であ る ことに由来 した相互 作用 な どについ て も
考慮 す る必 要 があ る。
2.2
疎水性 相互 作 用
浮 遊微 生物 が固体 界面 に付 着す る場 合,微 生物bと
2006年7月10日 受 付 大 阪 府 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 (〒599-8531 大 阪 府 堺 市 中 区 学 園 町1-1)TEL 072-259-9300 Department of Chemical Engineering, Osaka Prefecture University(1-1 Gakuen-cho, Naka-ku, Sakai, Osaka 599-8531, Japan)
<著 者紹 介> 1993年3月 京 都大 学 工学 部 卒 業.1995年3月 同大 学 院 工学 研 究科 修士 課 程 修 了,1996年8 月 同大 学 院工 学研 究 科博 士 課 程退 学,同 年9 月大 阪 府 立大 学 工学 部助 手,2005年4月 同 大 学 院工 学 研究 科講 師 。 博士(工 学) 専 門:化 学工 学,粉 体 工学 。 現 在 は,微 生 物 の 付着 現 象 と その利 用 に つ いて研 究 122 (32) 粉 体 工 学 会 誌
液 体1の 界 面blと,固 体sと 液 体1の 界 面slが 消 滅 し,固 体sと 微 生 物bの 界 面sbが 新 た に 生 成 さ れ る 。 微 生 物 の 付 着 に よ る 単 位 面 積 当 た り の 自 由 エ ネ ル ギ ー 変 化 ΔFadh(J/m2)は,界 面 張 力 γ(J/m2)を 用 い て 次 式 で 与 え られ る。 ΔFadh=γsb-γsl-γbl (1) 表 面 張 力 は,London分 散 力 に よ る寄 与 分 γdと 分 子 の 極 性 に よ る 寄 与 分 γPの 和 と し て 考 え ら れ る 。 Busscherら2)は,Fowkesの 分 子 間 相 互 作 用 の 幾 何 平 均 式3)を 用 い て,固 体 の 表 面 張 力 を変 化 させ た と き の 微 生 物 の 付 着 に 関 す る判 別 式 と し て,次 式 を 提 案 し て い る。
(2)
γpl＞γpbのと き,固 体 の 表 面 張 力 γsが 小 さ くな る と, す な わ ち,疎 水 性 が 高 く な る と,ΔFear＜0と な っ て 微 生 物 は 固 体 界 面 に 付 着 しや す く な る。 逆 に,γpl＜γpb の と き,固 体 表 面 の 疎 水 性 が 低 くな る と,微 生 物 は 付 着 し に く くな る。 2.3 微 生 物 の 電 気 泳 動 移 動 度 微 生 物 は,通 常 の 固 体 粒 子 と は異 な り,表 面 に 帯 電 した 高 分 子 層 が 存 在 す る。 大 島 らは 表 面 に帯 電 した 高 分 子 の 層 が 吸 着 した 粒 子 を 「柔 らか い粒 子 」 と 呼 び, 次 の よ う な 電 気 泳 動 移 動 度u(m2/(V・s))の 式 を 提 案 して い る4,5)。(3)
こ こ で,εrは 溶 液 の 比 誘 電 率(-),ε0は 真 空 の 誘 電 率(F/m),η は 溶 液 の 粘 度(Pa・s),1/λ は 流 れ の 侵 入 距 離(m),Zは 表 面 電 荷 層 内 に 存 在 す る解 離 基 の 価 数(-),eは 電 気 素 量(C),Nは 表 面 電 荷 層 内 に 存 在 す る 解 離 基 の 密 度(1/m3),ψ0は 微 生 物 の 表 面 電 位(V),ψDONは 微 生 物 の ドナ ン電 位(V),κmは 表 面 電 荷 層 内 のDebyeパ ラ メ ー タ(m)で あ る 。 Eq.(3)に お い て,1/λ →0と す る とSmoluchow-skiの 式 が 得 ら れ る。(4)
Fig.1に,Methanosarcina barkeri (JCM 10043株)Fig. 1 Electrophoretic mobility of Methanosarcina barkeri as a function of ionic strength
絶 対 値 は 減 少 して い る。 しか し,そ の 収 束 値 は,固 体 粒 子 の よ う に0と は な らず-1.9×10-8m2/(V・s)で あ っ た。 こ れ は,微 生 物 の よ う な柔 ら か い 粒 子 の 電 気 泳 動 移 動 度 の 特 徴 で あ る7)。 大 島 らの 式 とSmoluch-owskiの 式 か ら そ れ ぞ れ 求め たM.barkeriの 表 面 電 位 をFig.2に 示 す 。Smoluchowskiの 式 を 用 い て 求 め た 微 生 物 の 表 面 電 位 の 絶 対 値 は,大 島 ら の 式 を 用 い て 求 め た もの と 比 べ て か な り大 き く見 積 も って い る こ と が 分 る 。 2.4 微 生 物 由 来 の 相 互 作 用 微 生 物 由 来 の 相 互 作 用 と して,特 異 的 相 互 作 用 と架 橋 作 用 が 挙 げ られ る 。 特 異 的 相 互 作 用 と は,相 補 的 な 分 子 構 造 の 関 係 に よ り,特 定 分 子 を 選 択 的 に 認 識 す る
Fig. 3 Adhesion ratio of Escherichia coli to the glass and potential barrier energy between E. coli and the glass surface as a function of ionic strength と きの ス ペ シ フ ィ ック な 力 で あ る。 微 生 物 が 栄 養 分, 温 度 光 な どを 感 知 して 集 ま って く る走 化 性 な どが あ る 。 架 橋 作 用 と は,高 分 子 が もつ 多 数 の 吸 着 サ イ トに よ り粒 子 同 士 が 架 橋 さ れ る こ とで あ る 。 例 え ば,鞭 毛 は そ の 直 径 が わ ず か10nm程 度 で あ る の で,大 き さ が数 μmの 微 生 物 本 体 と比 べ て 電 気 的 反 発 エ ネ ル ギ ー は大 幅 に 減 少 す る 。 この こ と は,微 生 物 と 固 体 表 面 間 の ポ テ ン シ ャル 障 壁 が 高 くて も,細 胞 外 ポ リマ ー は十 分 に 越 え ら れ る こ と を 意 味 して お り,ポ テ ン シ ャ ル 障 壁 を 越 え て 固 体 表 面 に 達 した ポ リマ ー は,そ れ が もつ 多 数 の 吸 着 サ イ トに よ り不 可 逆 的 に 吸 着 す る8)。
Fig.3に,大 腸 菌Escherichia coli (JM 109株)の ガ ラ ス 表 面 へ の 付 着 率 と,DLVO理 論 よ り求 め た ポ テ ン シ ャ ル 障 壁 を 示 す9)。 懸 濁 液 の イ オ ン 強 度 が10 mol/m3の 時,菌 体 一ガ ラ ス 間 の0テ ン シ ャル 障 壁 は 400kT程 度 と か な り高 い に もか か わ らず,大 腸 菌 が 40%程 度 ガ ラ ス 表 面 に 付 着 して い た 。 こ の 付 着 菌 体 の 内,40%以 上 が 鞭 毛 に よ り ガ ラ ス 表 面 に 付 着 して お り,鞭 毛 の よ う な 曲 率 の 小 さ い 細 胞 外 ポ リマ ー は, ポ テ ン シ ャル 障 壁 を 越 え て 固 体 表 面 に付 着 で き る こ と を 示 唆 して い る 。 3. 嫌 気 性 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー へ の コ ロ イ ド科 学 的 手 法 の 導 入 3.1 メ タ ン発 酵 プ ロ セ ス 近 年,循 環 型 社 会 の 形 成 新 エ ネ ル ギ ー の 開 発 地 球 温 暖 化 の 防 止 な どの 観 点 か ら,廃 棄 物 系 バ イ オ マ ス の 再 生 技 術 と して メ タ ン発 酵 が 再 注 目 され て い る 。 し か し,従 来 の メ タ ン発 酵 プ ロセ ス は,メ タ ン生 成 菌 の 増 殖 速 度 が 非 常 に 遅 い上,発 酵 槽 内 の メ タ ン生 成 菌 が 流 出 す る な ど の 理 由 に よ り発 酵 効 率 が 低 く,未 消 化 の 残 渣 処 理 も必 要 な た め,ま だ ま だ 多 く の 課 題 を 抱 え て い る の が 現 状 で あ る。 そ れ ら の 問 題 を 解 決 し,高 効 率 メ タ ン 発 酵 プ ロ セ ス を 実 現 す る に は,発 酵 槽 内 の メ タ ン生 成 菌 を 高 濃 度 に 保 持 す る こ と が 必 要 不 可 欠 で あ る 。 メ タ ン発 酵 プ ロ セ ス は,多 種 多 様 な 微 生 物 が 高 密 度 に 存 在 す る 人 工 生 態 系 の 一 つ で あ る。 こ れ ら の 微 生 物 を す べ て 考 慮 す る こ と は事 実 上 不 可 能 で あ る の で,酸 生 成 菌 と して タ ンパ ク 質 分 解 菌 群,炭 水 化 物 分 解 菌 群,脂 肪 分 解 菌 群 の3種 類 と,メ タ ン生 成 菌 と
してMethanosaeta concilii (DSM 3671株)とMethano-sarcina barkeri (JCM 10043株)の2種 類 を 選 定 し,そ れ ら の 表 面 性 状 の 測 定 を 行 い,メ タ ン生 成 菌 の 選 択 的 固 定 化 に つ い て 検 討 した 。 3.2 代 表 的 な 微 生 物 の 表 面 性 状 メ タ ン 発 酵 に お け る 代 表 的 な 微 生 物 の 表 面 性 状 を Table 1に 示 す10)。微 生 物 の 電 気 泳 動 移 動 度 はpH7.0, イ オ ン強 度100mol/m3の リ ン酸 緩 衝 液 で 測 定 した 。 3種 類 の 酸 生 成 菌 とM.barkeriは 負 に 帯 電 し た 微 生 物 で あ る こ とが 分 る 。E.coliに 代 表 さ れ る よ う に,微 生 物 は 負 に帯 電 して い る 場 合 が ほ とん どで あ る 。 そ れ に 対 して,M.conciliiの 電 気 泳 動 移 動 度 は 非 常 に 小 さ く ほ ぼ 無 帯 電 で あ る こ と が 分 る。 これ は,一 般 的 な微 生
Table 1 Physico-chemical properties of microorganisms in anaerobic sludge
Fig. 4 Methane production using immobilized microorganisms with incubation time (medium: DSM 120 medium, substrate: sodium acetate (initial concentration 20mot/m3)) 物 コ ロ イ ドと は 大 き く異 な る 特 徴 的 な 結 果 で あ り,現 在 の と こ ろ,至 適pH付 近 に お い て 無 帯 電 と報 告 され た 微 生 物 は 数 種 類 に 過 ぎ な い11)。 微 生 物 の 疎 水 性 は,MATH法12)に よ り有 機 溶 媒 へ の 微 生 物 の 付 着 率 と して 評 価 した 。E.coliの 有 機 溶 媒 へ の 付 着 率 が 約6%で あ る の に 対 して,M.concilii, M.barkedお よ び3種 類 の 酸 生 成 菌 の 付 着 率 は ほ ぽ50 %以 上 で あ る こ と か ら,メ タ ン発 酵 菌 群 に 存 在 す る 嫌 気 性 菌 は 疎 水 性 で あ る と推 察 で き る 。 し た が って, 菌 体 の 極 性 に 起 因 す る表 面 張 力 は 水 に 比 べ て 明 らか に 小 さ く,Eq.(2)に お い て γpL＞γpBとな り,固 体 表 面 が 疎 水 性 に な る と微 生 物 は 付 着 し や す くな る と 予 測 さ れ る。 3.3 固 定 化 微 生 物 に よ る メ タ ン発 酵 微 生 物 を 固 定 化 した 担 体 を 用 い て メ タ ン発 酵 した と き の メ タ ン ガ ス 発 生 量 をFig.4に 示 す10)。担 体 に は, 大 き さが 約5mmの 竹 炭(負 帯 電 疎 水 性)と ア ル ミ ナ(正 帯 電,親 水 性)を 用 い た 。 固 定 化 担 体 と して 竹 炭 を 用 い た 時,メ タ ン ガ ス の 発 生 が 観 察 さ れ た が,ア ル ミナ を 用 い た 時,メ タ ン は ほ と ん ど発 生 し な か っ た 。 竹 炭 に 固 定 化 さ れ た 微 生 物 のSEM写 真 をFig.5 に 示 ず10)。竹 炭 表 面 に は 鞘 状 のMethanosaeta属 が 多 く 付 着 して い る こ と が 分 った 。 な お,ア ル ミナ 表 面 に は 微 生 物 が ほ とん ど付 着 して い な か っ た 。 こ れ ら の結 果 よ り,竹 炭 に は 酢 酸 資 化 性 メ タ ン生 成 菌 が 付 着 して い る が,ア ル ミナ に は ほ と ん ど 付 着 し て い な い こ と が
Fig. 5 SEM image of immobilized microor-ganisms on the bamboo charcoal
こ の 理 由 は,微 生 物 の 表 面 性 状 に 基 づ い て 次 の よ う に 推 察 で き る 。 竹 炭 の 場 合,Methanosaeta属 と の 間 に は静 電 斥 力 は ほ とん ど作 用 せ ず,van der Waals 引 力 に よ り固 体 表 面 に 接 近 した 微 生 物 は,そ の 疎 水 性 に よ り竹 炭 表 面 に安 定 に 固 定 化 され る 。 一 方,Meth-anosaeta属 以 外 の 微 生 物 は 負 に 帯 電 し た 疎 水 性 微 生 物 で あ る た め,竹 炭 と の 間 に は 静 電 斥 力 が 作 用 す る こ と に よ っ て 付 着 が 抑 制 さ れ る 。 一 方,ア ル ミナ-微 生 物 間 に は 静 電 引 力 が 作 用 して 微 生 物 は表 面 に 接 近 で き る が,両 者 の 疎 水 性 の 違 い に よ り安 定 的 に 固 定 化 さ れ な い 。 Fig.6に,竹 炭 に 固 定 化 さ れ た 微 生 物 を 長 期 培 養 し た と き のSEM写 真 を 示 す13)。竹 炭 上 に は鞘 状 のMeth-anosaeta属 が 優 占 種 と な って お り,コ ロ イ ド科 学 的 側 面 か ら得 られ た 上 記 の 推 察 を 裏 付 け る 結 果 で あ る 。 4. お わ り に コ ロ イ ド科 学 で 対 象 と さ れ る 固 体 粒 子 と微 生 物 粒 子
microor-の大 きな違 い は,微 生物 が 『
生 き た コロイ ド』 であ る
とい う点 であ る。 す なわ ち,微 生 物 は固 体界 面 を能動
的 に感知 して 付着(棲 息)し て い る ことが十 分 に考 え
られ る。 また,微 生 物 が棲 息 して いる界 面 は,バ ル ク
相 の巨視 的環境 とは異 な る微視 的環境 を 形成 す る こと
が でき,自 然生 態 系で は異 な る微 生物 の 棲 み分 けを可
能 と して い るの か も しれ な い。 さ らに,付 着 微 生 物
は,固 体界 面 か らの表面 間 力を強 く受 け る場 に存 在す
るため,微 生物 表 層 に非対 称性 が誘 起 され,そ れ が微
生物 内部 に伝達 す るこ とに よる生 理 活性 の 向上 も期待
で き るか も しれ ない。
以 上 の よ うに,微 生 物 の付着現 象 を積 極的 に利 用 し
た り,予 防 した りす るた めに は,本 稿 で紹介 した コロ
イ ド科学 的側 面か らのア プ ローチ に加 えて,微 生物 特
有 の諸現 象 も考慮 しなが ら,固 体 表 面へ の付 着 メカニ
ズムを明 らか に して い く必要 が あ る。
Nomenclaturee: elementary electrical charge (C) N: density of the charged groups in the
polyelectrolyte layer (1/m3) u: electrophoretic mobility (m2/(V• s)) Z: valance of charged group in the polyelectrolyte
layer (-)
ƒÁbl: bacterium-solid interfacial free energy (J/m2) ƒÁpb: polar component of surface energy of bacterium
(J/m2) ƒÁpl: polar component of surface energy of liquid
(J/m2) ƒÁs: surface energy of solid (J/m2) ƒÁsb: solid-bacterium interfacial free energy (J/m2) ƒÁsl: solid-liquid interfacial free energy (J/m2)
ƒÁps: polar component of surface energy of solid (J/m2) ƒ¢Fadh:interfacial free energy of adhesion (J/m2) ƒÃr: relative permittivity of the medium (-)
ƒÅ: permittivity of a vacuum (F/m) ƒÈ: viscosity of the medium (Pa• s) ƒÈ m: Debye-Huckel parameter of the polyelectrolyte
layer (m)
1/ƒÉ: softness of the polyelectrolyte layer (m) ƒÕDON :Donnan potential in the polyelectrolyte layer
(V)Vo : potential at the boundary between the
polyelectrolyte layer and the medium (V)
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