Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析レーザーによる固相中でのイオン化

(1)

合成高分子への質量分析法の応用

1. GPC/MALDI MS

の応用例

2. GPC/ API MS

の応用例

応用分野:

(i)

平均分子量の測定

(ii)

末端官能基や繰返しユニットの測定

(ユニットは重合体の性能の特性に重要)

(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反

応のモニター

(iv)Polymerisation 重合度の測定

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は、複

雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの1つであり、bulk

polymer の MS分析に有用

GPC/MALDI MS

(2)

Matrix Assisted Laser

Desorption

Ionization (MALDI)



サンプル調製



サンプルとケミカルマトリクスの混合

(1,000-1 to 10,000-1)



Major advantage= ease of sample prep !!



質量分析



レーザーによる固相中でのイオン化



ソフトなイオン化



一般に不揮発性高分子の(準) 分子イオン [M+H]

+

_{が最小のフラグ}

メンテーションで生成

o

Proteins

o

Peptides

o

Oligonucleotides

o

Polysaccharides

o

Synthetic polymers



正・負双方のイオン化が可能

Matrix Assisted Laser

Desorption

Ionization (MALDI)



ショートレーザーパルス

(10-20 ns) がターゲット

に照射



窒素レーザーが一般的

337 nm



照射サイズ: ~10-100 mm



レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され、サンプ

ルに穏やかに移行



ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが

直接、蒸発・イオン化

(3)

ポリマー分析における

MALDI

法の制約

However,



ダイナミックレンジ、高い多分散度がある重合体の正確な質量分布等、

MALDI-TOF MSのテクニックには、制限あり



1.3以上の多分散度のサンプル(ほとんどの商品ポリマー)では、紛らわしい平

均分子量データとなる

—

Detector response vs m/z

—

多分散サンプルにおける最適matrix/sample ratio 設定の困難さ

—

Multimer形成と多価イオンによるシグナルの損失



単分散のサンプルの分析はこれらの制限を受けない



解決策は単分散フラクションに分画するためにMALDI MSの前でサンプ

ルをGPC （SEC)を使用してクロマト分離する



MALDI MS の為のサンプルのGPC （SEC)分離と溶離液分取/定

着システムの開発

アプローチ

(4)



一般的手順

—

GPC （SEC) による単分散フラクションの分離により、より簡便にMALDI MS

分析が可能

—

GPC 分離後、フラクションを分取

—

サンプルはprecoated MALDI target プレート又は適当なマトリクス溶液を

伴ったmixed post-columnに連続的に供与される

—

レーザーが連続的に供与されるサンプルに照射され, 各部位のマススペクト

ルを取得

—

ソフトウェアは、GPC分画後の個々のスペクトルを結合し、分画前の元の多分散

サンプルの分子量分布に補正・換算

Waters GPC/MALDI TYOF MS system

for polymer characterisation

Waters Micromass MALDI micro™ high performance

MALDI-TOF mass spectrometer

(5)

分析例（

Polylactide glycolide）

GPC/MALDI MS

イントロダクション



Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)はドラッグ・デリバリーに使用され

る生物学的適合性と生物分解性ポリエステル

分子量データは性能の特性に関連するため重要



PLG polymers 通常は highly polydisperse (Pd>1.5)

(6)

イントロダクション



PLG is a copolymer of lactide and glycolide.

オリゴマーも分子量の複雑な混合物として存在

O O

[–O–CH–C–]

_m

– [–O–CH

₂

–C–]

_n

CH

₃

Figure. Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)

MALDI (No GPC)



スペクトルが共重合体の組成情報を提供している間、正確な分子量分布が

得られない

8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 1 6 0 0 1 7 0 0 1 8 0 0 1 9 0 0 2 0 0 0 2 1 0 0 2 2 0 0 2 3 0 0 2 4 0 0 2 5 0 0 2 6 0 0 2 7 0 0m / z 0 1 0 0 % 7 7 2 . 6 4 6 4 8 3 0 . 5 6 5 9 8 4 4 . 5 1 7 3 8 8 8 . 4 0 0 3 9 0 2 . 3 6 2 5 9 2 0 .3 1 3 8 9 6 0 . 2 3 2 1 9 7 6 . 1 4 1 4 1 0 6 2 . 0 4 0 3 1 1 3 5 . 7 8 1 3 1 1 9 3 . 6 6 8 5 1 4 8 0 . 9 7 8 8 1 7 2 7 . 4 3 6 3

PLG GPC 分画前のPLG の

MALDI MS スペクトル

Lactide Glycolide Copolymer

MW: acid

MW: mer

Lactic acid:

C

3

O

3

H

6

90

72

(7)

プロトコール

Gel Permeation Chromatography (GPC)

Column: Waters Styragel

®

_{HR2 4.6 x 300 mm at 25 °C}

HPLC Pump: Waters 616 pump with 600S controller

Detector: Waters 410 Refractive index detector

and 996 Photodiode array detector (PDA)

Flow rate: Isocratic gradient of tetrahydrofuran (THF) at

0.3 mL/min for 60 min

Injection volume: 20 mL

LC-MALDIprep Sample Collection Conditions

Sample concentration: 10 mg/mL

Sheath gas temperature: 125 °C

Nebulizer gas flow: 25

Foil: Dithranol 1 Time

®

_{/with sodium salt}

Stage speed: 5 mm/min

.005 .01 .015

10 20 30 40 50 60

Arbitrary Y / Arbitrary X Overlay Y-Zoom CURSOR

File # 1 : BASELINE GPC - UV Chromatogram of PLG (Lactel)_{absorbance at 254 nm} Res=None

GPC PDA chromatogram of the selected PLG co-polymer at UV

wavelength of 254 nm

PDA

(8)

©2007 Nihon Waters K.K. 15 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 2010.2126 4584.0635 4238.5762 4093.0759 3805.0630 3777.0925 2466.8064 4785.4629 5607.9390 5795.4712 1349.4900 3834.2188 3271.6724 1364.0499 3241.7703 1571.7360 2766.4451 4325.4932 4482.8506 4801.1978 921.7535 929.7783 1130.4019 1146.4146 1355.9354 3241.7795 1579.7407 3618.0776 929.9463 2228.8044 930.9546 2070.5942 1170.7274 2447.0364 2750.3337 3142.6060 1854.3126 1519.8180 2056.6262 2186.8171 2316.9670 2461.1458

PLG co-polymers GPC フラクションの

溶出時間に伴う

MS スペクトル

各フラクションの分子量を結合することによって、未分画サンプル

（オリジナル）の分子量分布を換算

ＧＰＣ分離による多分散（分子量分布）の軽減

MALDI target plate にスポットされたあるGPCフラクションの

MS スペクトルの１例

MALDI

-

MS data

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 m /z 0 100 % 1854 .3126 151 9.8180 907 .9029 1 461.689 2 1419.55 87 137 5.4899 13 17.3483 128 9.2689 1245.1 530 1231 .1182 944.13 31 202 8.5533 2114 .6843 21 72.7500 2186 .8171 2 230.855 7 2 258.918 7 2272.93 43 231 6.9670 2 346.969 7 240 5.0195 2461 .1458 2463.09 64 2491.1 392

The polymer distribution is

centered at about m/z=2,000 (MP)

(9)

先のスペクトルの拡大

. アイソトピック・クラスター間の１４Daの差異は

Lactide [OCH(CH

₃

)C(O)] と Glycolide [OCH

₂

C(O)]モノマーに起因

185 0 1 85 5 1 86 0 1 865 18 70 187 5 1 88 0 1 88 5 1 89 0 18 95 19 00 190 5 1 91 0 1 91 5 19 20 19 25 193 0 1 93 5 1 94 0 19 45 19 50m /z 0 10 0 % 1854.3126 1852.3837 1940.4821 1868.3789 1855.2921 1856.2722 1866.4426 1857.2819 1858.2625 1865.5198 1859.2728 1912.4049 1882.4089 1869.3622 1870.3160 1880.4655 1871.2700 1872.3138 1873.2983 1898.3832 1884.3533 1896.4314 1885.3110 1894.5406 1886.2987 1887.3168 1888.3351 1910.4761 1899.3444 1900.3357 1908.5182 1901.2976 1902.2894 1926.4480 1913.3997 1914.3647 1924.5424 1915.3604 1916.3257 1922.5773 1928.4153 1938.5695 1929.3842 1930.3834 1931.3527 1942.4260 1943.3986 1944.4015 1945.4047 1946.3776

14

14 Isotopic clusters

Isotopic clusters

MALDI technology

の利便性



MALDI 分析による the Poly-(DL-lactide-co-glycolide) (PLG)

polymer のGPC分離の確認



GPC 分画を行う事で MALDI-MS の弱点である多分散度のサンプルの問

(10)

応用分野:

(i)

ポリマー添加剤の分子量測定

(ii)

末端官能基や繰返しユニットの測定

(ユニットは重合体の性能の特性に重要)

(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター

(iv)極性ポリマーや低分子領域の重合度の測定

API 大気圧イオン化法 (ESI, APCI) は、最も一般的なLC/MSイオン化

法であり、比較的極性を有する低分子領域化合物のMS分析に非常に適

しています。

GPC/ API MS

LC(RP)/UV &

APcI

chromatograms

of

polymer additives

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Time 0 100 % -0 100 % std_1 3: Diode Array 273 9.40e5 2.73 8.33 7.56 4.99 2.93 5.79 9.54 13.09 std_1 1: Scan AP- BPI 1.13e8 9.53 8.32 5.34 2.92 2.70 4.98 5.79 7.55 13.06

1. Tinuvin P

2. Irganox 245

3. Tinuvin 326

4. Tinuvin 234

5. Tinuvin 327

6. Irganox 1010

7. Irganox 1330

8.Irganox 1076

9. Irgafos 168

2 3 4

₅

6

7

8

9

1

(11)

GPC/ API MS

C

H

₂

*

CH

₃

COOCH

₃

*

_n

分析例（

Poly methyl methacrylate, PMMA

）

Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 % 77 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 A U 0.0 2.0e-2 4.0e-2 6.0e-2 8.0e-2 1.0e-1

SEC_PMMA1uv 3: Diode Array

Range: 2.588 8.62 210 6.47 215 6.95 215 7.17 214

SEC_PMMA1uv 1: Scan ES+

TIC 1.02e6 12.16 789 5.87 1040 0.80 739 5.05 1246 1.81 2601278 3.402.21 ₁₀₁₇4.25 1140 8.47 1253 6.40 1227 8.40 981 9.52 1355 10.01 593 10.87 1179 14.93 405 12.29 730 14.98 1247

N

ormal GPC (THF)

(12)

Scheme of Make

-

Up solvent Flow for

API

HPLC (GFC)

Mobile phase: for SEC

e.g.,THF, CHCl3

0.3-1.0 mL /min.

MS

(Q-p single-MS,

ESI/APcI)

HPLC

SEC Column(s)

UV/PDA

T joint

Make up pump

(bilt in syringe pump etc.)

Make up sol.:for poler solution

e.g., CH3CN, MeOH

0.3mL/min.

Mn776 Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 % 1 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 A U 0.0 2.0e-2 4.0e-2 6.0e-2 8.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array

Range: 2.578 8.64 6.49 6.97 7.19 7.45 10.40

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+

BPI 1.03e8 8.23 7.55 7.23 6.98 6.83 6.70 6.61 6.50 6.16 3.70 1.26 8.46

GPC/ API MS

(13)

Mn776

Time 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 % 1 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 A U 0.0 2.0e-2 4.0e-2 6.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-2 6.49 6.97 7.19 7.45 7.79

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ BPI 9.85e7 8.25 7.23 7.02 6.93 6.72 6.59 7.46 Mn776 m/z 400 600 800 1000 1200 1400 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100

SEC_PMMA1_MS 386 (7.795) 1: Scan ES+ 5.94e7

425.9 525.0 625.1825.3

526.0 425.9 _{625.1 725.2}

625.1 526.0

725.2

SEC_PMMA1_MS 342 (6.966) 1: Scan ES+

7.32e7

725.2 625.1

825.3

825.3 725.2

925.4

925.4 825.3 1025.5

1025.5 925.4

1125.5

ESI at Low MW range

Mn776 Time 6.00 7.00 8.00 % 0 6.00 7.00 8.00 % 0 6.00 7.00 8.00 % 0 100 6.00 7.00 8.00 % 0 100 6.00 7.00 8.00 % 0 100 6.00 7.00 8.00 A U 0.0 5.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-2 6.49 _6.97

7.19 7.79

1425.654 7.34e6 6.10

6.05

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1325.575 1.01e7 6.16

6.27

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1225.583 9.50e6

6.25 6.20 6.31

6.42

1125.522 1.49e7 6.37

5.74

1025.454 1.74e7 6.48 5.84 Mn776 Time 6.00 7.00 8.00 % 0 100 6.00 7.00 8.00 % 0 6.00 7.00 8.00 % 0 6.00 7.00 8.00 % 0 6.00 7.00 8.00 % 0 100 6.00 7.00 8.00 A U 0.0 1.0

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 1.469 6.49 _6.97

7.45 7.79

925.379 3.20e7 6.59

5.86

825.297 5.40e7 6.72

725.208 8.52e7 6.93

6.85 7.32

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 626.082 8.27e7

7.15 7.08

7.34

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 525.979 9.76e7 7.42

ESI mass chromatograms

(14)

©2007 Nihon Waters K.K. 27 Time 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 A U 0.0 2.5e-2 5.0e-2 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 A U 0.0 5.0e-2 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 A U 5.0e-2 1.0e-1 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 A U 5.0e-2 1.0e-1 1.5e-1

Range: 1.857e-1

5.46 216

SEC_PMMA3_MS 3: Diode Array Range: 1.469e-1

5.67 215

Range: 9.755e-2

5.96 215

Range: 6.814e-2 6.49;215 6.97 214_7.79 210 m/z 500 1000 1500 2000 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100

SEC_PMMA4_MS 244 (5.120) 1: Scan ES+

1.30e5 1825 1725 1325 1075 1024 484751807 1425 1926 1927 1928 1983

SEC_PMMA3_MS 309 (6.347) 1: Scan ES+ 1.32e6 1225 1125 1025 724 674 1325 1326 1426 1626 1727 1926

SEC_PMMA2_MS 327 (6.687) 1: Scan ES+ 5.18e6 925 825 484 654 1025 1125 1126 1325 1525 1727 1926

725 625 825

925 1025 1226 1426

ESI mass spectra

分子量分布

GPC elution (PDA/ESI, Map)

(15)

GPC elution (ESI, Map)

質量分析計

イオン化（

ESI

＆

APCI

）

の原理

M：サンプル分子

X：H2OやNH3などの溶媒分子

キャピラリ 4 kV

イオン蒸発

--

+ + +

-+ + + + +

-帯電液滴の生成

--

+ + + +

--

+ + +

--

+ + + +

--

+ + +

-脱溶媒が進むにしたがって

イオン濃度が上昇

++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-キャピラリ 4 kV

イオン蒸発

--

+ + +

-+ + + + +

--

+ + +

-+ + + + +

-帯電液滴の生成

--

+ + + +

--

+ + +

--

+ + + +

--

+ + +

--

+ + + +

--

+ + +

-

+ + + +

--

+ + +

--

+ + + +

--

+ + +

--

+ + + +

--

+ + +

-脱溶媒が進むにしたがって

イオン濃度が上昇

++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-++

-+

-

+ + +

-ESI

x

HH++ MM

コロナ放電により

試薬イオンが生成

x

HH++ M M

試薬イオンとサンプル分子が

反応してサンプルイオンが生成

(プロトン転移またはチャージ転移）

コロナニードル

x

M M

キャピラリ

加熱

x

HH++ MM

x

HH++ MM

コロナ放電により

試薬イオンが生成

x

HH++ M M

x

HH++ M M

試薬イオンとサンプル分子が

反応してサンプルイオンが生成

(プロトン転移またはチャージ転移）

コロナニードル

x

M M

x

M M

キャピラリ

加熱

APCI

Waters ESCi

(16)

SEC_PMMA1_ESCi 4: Diode Array

Range: 3.304e-1 6.50 215 _6.98 216 7.46 217

SEC_PMMA1_ESCi 1: Scan ES+ TIC 7.49e8 7.48 426 4.27 365 7.75;426

SEC_PMMA1_ESCi 2: Scan AP+

BPI 8.95e7 7.69 425 7.12 625 7.92 325 m/z 400 600 800 1000 1200 1400 % 0 100 % 0 100

SEC_PMMA1_ESCi 190 (7.481) 1: Scan ES+ 2.91e7 425 325 327 525 426 441 442 625 526 541 542 725 641726 825 741 925 1025 1126 1226 1426 SEC_PMMA1_ESCi 191 (7.538) 2: Scan AP+

1.87e7 425 325 379 525 426 625 526 542 725 641 _{825 925} 1025 1126 1226 1346

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製 サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析 レーザーによる固相中でのイオン化

合成高分子への質量分析法の応用

合成高分子への質量分析法の応用

1. GPC/MALDI MS

1. GPC/MALDI MS

の応用例

の応用例

2. GPC/ API MS

2. GPC/ API MS

の応用例

の応用例

応用分野:

(i)

平均分子量の測定

(ii)

末端官能基や繰返しユニットの測定

(ユニットは重合体の性能の特性に重要)

(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反

応のモニター

(iv)Polymerisation 重合度 の測定

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は、複

雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの1つであり、bulk

polymer の MS分析に有用

GPC/MALDI MS

Matrix Assisted Laser

Matrix Assisted Laser

Desorption

Desorption

Ionization (MALDI)

Ionization (MALDI)



サンプル調製



サンプルとケミカルマトリクスの混合

(1,000-1 to 10,000-1)



Major advantage= ease of sample prep !!



質量分析



レーザーによる固相中でのイオン化



ソフトなイオン化



一般に 不揮発性高分子の(準) 分子イオン [M+H]

+

が最小のフラグ

メンテーションで生成

o

Proteins

o

Peptides

o

Oligonucleotides

o

Polysaccharides

o

Synthetic polymers



正・負双方のイオン化が可能

Matrix Assisted Laser

Matrix Assisted Laser

Desorption

Desorption

Ionization (MALDI)

Ionization (MALDI)



ショートレーザーパルス

(10-20 ns) がターゲット

に照射



窒素レーザーが一般的

337 nm



照射サイズ: ~10-100 mm



レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され、サンプ

ルに穏やかに移行



ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析レーザーによる固相中でのイオン化

(iv)Polymerisation 重合度の測定

一般に不揮発性高分子の(準) 分子イオン [M+H]

_{が最小のフラグ}

サンプルはprecoated MALDI target プレート又は適当なマトリクス溶液を

分析例（