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培養装置内において細胞から肝臓組織を「再生」することに成功
―胆管や血管をもった生体肝組織の３次元構築技術を確立― 平成１７年３月２日 独立行政法人物質・材料研究機構 概 要 １． 独立行政法人物質・材料研究機構（理事長：岸 輝雄）生体材料研究センター（セ ンター長：田中 順三）では、医工連携チームの谷口 英樹客員研究員（横浜市立大 学大学院医学研究科教授 併任）および岡村 愛外来研究員（大学院生）らが、微少 重力を発生させる特殊な培養装置を利用して、マウスの細胞から肝臓組織を生体外で 「再生」させることに成功した。 ２． 近年、本当の生体組織を再生する「再生医療」が急速に進歩しつつあり、肝臓・す い臓などの固形臓器についても新しい組織再生技術の開発が強く求められている。現 在、重篤な肝臓・すい臓疾患を治療するため生体臓器移植が行われているが、ドナー 不足が深刻な問題である。そのため、生体臓器と同じ機能をもった３次元構造を形成 する人工組織を生体外で作り、それを疾患部位に移植治療する技術が望まれている。 ３． 生体類似の３次元組織を作る方法として、隙間の多い人工担体の中で細胞を培養す る方法、細胞を旋回したり撹拌したりして水中に浮かせて培養する方法が行われてい るが、培養中に細胞を物理的に傷つけるため得られた組織の構造や生物学的性質が本 来の臓器と異なり、十分に人工臓器として機能を果たさない問題が残されていた。 ４． 今回開発した方法は、細胞の物理的損傷を最小限に軽減するために、模擬微小重力 環境において細胞を培養液中に自由に浮かせ、ゆっくりと集合させて３次元組織を形 成させる方法である。肝臓の細胞（マウス胎児肝臓から単離した細胞集団）をこの方 法で培養したところ、もともと健全な肝臓がもっている胆管や血管をもった組織を再 現することに成功した。得られた組織の遺伝子を解析した結果、肝臓特有の機能（ア ンモニアや薬物の代謝、アルブミン産生、グリコーゲンの貯蔵など）をもった組織で あることが実証された。今後、さらに肝臓組織ができるメカニズムを詳細に解明し、 信頼性の高い自動化培養装置の開発につなげていき、実際の治療に求められる大きさ の人工肝臓を作る技術、あるいはすい臓を構成している 0.1mm ほどの大きさのすい島 （ランゲルハンス氏島）を大量に作製する技術を確立する予定である。 ５． 本研究は、文部科学省リーディングプロジェクト「ナノテクノロジーを活用した人 工臓器の開発」で行われたものである。研究の背景 【３次元構造をもった人工臓器の必要性】 生体内の臓器や組織は、たくさんの細胞が立体的に集まってお互いに影響を与え、全体 として例えば肝臓の解毒作用など臓器特有の機能を発揮している。これまでの研究から、 細胞はタテ・ヨコの２次元平面で培養するより、タテ・ヨコ・タカサの３次元で立体的に 培養する方が高い機能を発揮することがわかっている。３次元構造は生体内に近いため本 来の機能を発揮しやすいが、これまでそのような３次元構造をうまく作ることができなか った。そのため、人工臓器を用いた移植医療を実現するためには、細胞を培養して生体類 似の３次元構造を形成することが必要である。治療には大量の細胞が集まった組織が多数 必要とされている。 【従来法の問題点】 これまで３次元培養法として、ポリ乳酸などの合成高分子１）やコラーゲンなどの生体高 分子２）から作製された隙間の多い人工担体（スキャホールド）を用いて、その中で細胞を 培養する方法、あるいは細胞を旋回したり撹拌したりして水中に浮かせながら培養する方 法が研究されてきた。 ・ スキャホールドを用いる方法では、素材の生体親和性と形状が問題となり、現在十分な 材料が得られていない。また、培養した細胞がスキャホールドの隙間に張りついて、本 来の生体内のような配置をとることができない問題などがあり、高い機能をもった組織 を作ることができていない。 ・ 旋回培養や攪拌培養は、細胞だけを培養する方法であるが、細胞に培養液の流れによる 大きなセン断応力３）や撹拌子による物理的損傷が起きて、細胞が集合して組織を効率的 に構築することがむずかしかった。 以上の問題から、これまで生体内組織に類似した３次元構造体を生体外の培養で作り出 したという報告はない。 研究成果の内容 本研究は、ＮＡＳＡ（米国）が開発した水平軸で回転する１軸円筒型回転細胞培養装置 （図１）を用いて行った。この培養装置は、細胞にかかる重力を地上の重力の 100 分の１ にすることができることから、模擬微小重力培養装置と呼ばれている。 【装置の原理】 細胞は培養液の中で沈降する。しかし、培養液を満たした容器が回転するため細胞が上 に持ち上げられ、沈降する効果を相殺して細胞は常に浮いた状態になる。そのため、細胞 は装置内であたかも無重力の中を遊泳しているような状態になり、長期間（30 日以上）沈 降しないで安定的に培養することができる。細胞はお互いの相互作用によって自由に位置 関係を決めることができ、環境はあたかも宇宙と同じように低沈降・低対流であるため、
細胞の物理的損傷は最小限に軽減されている。 【疑似微小重力装置を用いた組織再生実験】 模擬微小重力培養装置を用いて、マウス胎児肝臓から単離したひとつひとつバラバラの 細胞を培養した。図２に示すように、細胞が徐々に大きく内部に血管や胆管を持った塊に 成長していった。 注）最初のバラバラにした細胞の中には、肝細胞や胆管細胞に分化できる幹細胞（肝幹細 胞）、あるいは胆管細胞や血管細胞などの前駆細胞のようにいろいろな段階にある未分化細 胞が含まれている。 10 日間培養した結果を図２（上）に示す。直径 500∼1000 マイクロメーターの組織がで きている。組織を切断して内部構造を詳しく見ると、胆管構造や血管構造が形成されてい た（図２（下））。図３のように、培養期間を長くすると胆管構造はより大きく複雑になっ た。生体内の肝臓組織は肝細胞の隙間に血管や胆管が入り組んだ複雑な構造であるが、今 回得られた組織はその構造にきわめて類似している。 この培養系では、ひとつひとつの未分化細胞が、細胞自身が分化しながら本来あるべき 構造を形成していくことが明らかとなった。肝臓の細胞外マトリックス４）であるラミニン やコラーゲン（Ⅳ型）の免疫染色５）を行ったところ、今回できた胆管や血管構造の周囲（基 底膜）が染まったことから、細胞自身がラミニンやコラーゲンなどの細胞外マトリックス を作っていることがわかった。さらに、遺伝子とタンパク質レベルで肝臓特有の機能発現 （アンモニア代謝、薬物代謝、アルブミン産生、グリコーゲン貯蔵）を解析した結果、培 養期間に比例してその機能が活発化して、生体内の肝臓組織と同じパターンになることが 証明された。 これらの結果から、この培養装置を用いて、マウス胎児肝臓から単離したさまざまな分 化段階の細胞集団のみから構造的・機能的に生体内肝組織に類似した組織を作り出し、そ して培養系において成長させることが可能であることが判明した。「試験管の中で細胞を材 料として人工臓器を作る」ことが可能になった。 波及効果と今後の展開 本研究で作製した微小な肝臓組織体は、通常の培養皿で培養した肝細胞と比較して、よ り高い生体機能を再現している。そのため、さまざまな動物実験代替法や創薬スクリーニ ング６）（特にヒト肝臓の培養系における再構成）への応用が期待される。 現在、培養装置の中で作られる組織体は 1 個であるが、より多くの組織体を作る装置・ 技術開発の研究に展開することが重要である。当研究チームでは、新規培養装置を工夫し て「微小な組織体を大量に作製する技術」についてもすでに目処を付けている。 【本研究の関連技術】 本技術は、人工肝臓の他に人工すい臓の開発にも利用できる。今後の高齢化社会におい
ては、糖尿病患者が莫大に増加すると予測されており、すい臓の臨床的医療技術として「す い島移植」が開発されつつあり、大きな期待を集めている。すい島はすい臓の基本となる 分泌組織である。しかし、すい島移植では、移植治療の最大の問題点であるドナー不足の 問題は解決できない。そこで、高い増殖能をもち、なおかついろいろな細胞に分化できる 多分化能をもった幹細胞（stem cell）が注目されている。本方法を用いることにより、幹 細胞からすい島を工業的に大量に生産する技術に発展させることが可能である。現時点で はすい臓の幹細胞をフローサイトメトリー７）を用いた方法で分離する技術は確立している。 今後、大量のすい島組織を工業的に生産する技術開発を行って、糖尿病治療に貢献するこ とを考えている。 なお、本研究は文部科学省リーディングプロジェクト「ナノテクノロジーを活用した人 工臓器の開発」で行われたものである。 問い合わせ先： 〒305-0047 茨城県つくば市千現１−２−１ 独立行政法人物質・材料研究機構 広報室 TEL:029-859-2026 研究内容に関すること： 独立行政法人物質・材料研究機構 生体材料研究センター センター長 田中 順三（たなか じゅんぞう） TEL: 029-851-3354（内）4490 FAX: 029-860-4714
用語解説 １）合成高分子 目的の物性に応じたモノマー（単量体）を用いて人工的に合成した高分子。 例：ナイロン、ポリエステル、アクリル、塩化ビニルなど。 ２）生体高分子 植物や動物などの生物が生産する高分子。 例：綿、絹、麻、羊毛などの繊維、酵素、DNA、タンパク質などの生体構成成分など。 ３）セン断応力 ずれに伴い、材料の横断面に、互いに平行で向きが逆に生ずる応力。 ４）細胞外マトリックス 組織中の個々の細胞と細胞、あるいは細胞集団と細胞集団の間の隙間を満たす複雑な生体 高分子集合体を指し、生体内のあらゆる臓器に広く存在している。400種類に上ると推定さ れているが、主なものはコラーゲン、エラスチン、ファイブロネクチン、ラミニンなどの構 造タンパク質と、プロテオグリカン、ヒアルロン酸など複合多糖類に大別することができる。 細胞外マトリックスには大きな役割があり、第一には臓器を支持したり境界を作ったりする 役割で、臓器の固さ、強さ、柔軟性など物理的な性質を決めている。第二の役割は細胞の生 存環境をつくることであり、増殖、分化、移動などの細胞機能に関与して、発生、がんの転 移、創傷の治癒、生体の防御、加齢など多彩な生命活動にかかわっている。 ５）免疫染色 細胞内や組織内のある特定の物質の存在部位を、免疫（抗原−抗体）反応を利用して、そ れに対する特異抗体を作製し、これを反応させて検出する。標的抗原と反応した特異抗体 を標識した物質を組織化学的染色することにより可視化するが、標識物によってその方法 は 1)蛍光色素（FITC、ローダミンなど）、2)重金属（フェリチン、コロイド金など）、3)酵 素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）の三つに大別される。 ６）創薬スクリーニング 標的とするタンパク質の細胞表面にぴったりと結合して化学的な活性を発揮する物質を 探すこと。創薬とは新薬を開発することであり、人体を構成するタンパク質に結合するこ とで何らかの薬効を発揮する化学物質を見つけなければならず、膨大な数の候補物質から 段階的に選別していく。その過程では動物実験や臨床試験を行わなければならず、例えば 制ガン剤の開発などは 10 年から 15 年という時間がかかるといわれる。
７）フローサイトメトリー 数種類のレーザーが装備されており、細胞の解析や分離（ソーティング）が可能な装置。 細胞の表面に存在している分子（表面抗原）の発現パターンに基づいて細胞を定義付け、 その相対頻度を定量化する。すなわち、蛍光色素が標識されたモノクローナル抗体を細胞 表面分子に結合させレーザー光で励起させると、細胞はさまざまな蛍光を発する。この発 せられた蛍光強度を電気信号に変換することで、細胞の表面抗原の有無が定量的に解析可 能となる。また、使用する蛍光色素により蛍光の波長が異なるので、その違いを利用して いくつかの種類の異なる蛍光色素を用いた多重染色を行えば、1 個の細胞表面にある種々 の分子を多元的に解析できる。
