メタノール質化性細菌Methylomonas methanolovoransOUT8402のメタノール質化経路 (2) : ペントースモノリン酸経路 利用統計を見る

論

文

メタノール資化性細菌Methylomonas methanolovorans 0UT 8402

のメタノール資化経路（2）ペントースモノリン酸経路

天野義文

中川順

加賀美元男

高田信男

照井堯造

（昭和56年8月31日受理）

Assimilation Pathway of Methanol by Methylomonas methanolovorans

OUT 8402 (2) Pentose Monophosphate Pathway

YoshifumiAMANO JunNAKAGAWA MotooKAGAMI

NobuoTAKADA GyozoTERUI       Abstract・   A丘xation of carbon from 14C formaldehyde was carried out by cel1イree extracts of

Methylomonas methanolovorans OUT 8402 grown on methanol・Incubation of ce11−free

extracts of M． methanoloworans with 14C formaldehyde and D−ribulose 5−phosphatg or D−ribose 5−phosphate leads to incorporation of radioactivity into a non−volatile prodllct，

which has the chromatographic properties of a phosphorylated compound． Treatment

of this reaction product with a acid phosphatase， followed by chromatography， has indi− cates the presence of fructose．  It is． suggested that the bacterial extract catalyse the

condensation of formaldehyde with ribulose 5−phosphate or ribose 5−phosphate to the

丘rst stable product of fructose 6−phosphate・ These results indecate thatハ4・〃ze彦hanolov・ orans possesses an enzyme system s三milar to that Pseudomonas methdnica catalyzing the condensation of formaldehyde and ribulose 5−phosphate to give hexose phosphate， namely

the pentose monophosphate pathway．

1．緒

言

  ペントースモノ・リン酸経路はC1化合物資化経路

としてメタン資化性菌1）seudomonas methanica，

Methorlococcus caPsulatusに存在することがQua・

yleら1）により明らかにされた。本経路は細部におい

て四つに分かれるが，共通するKey reactionは

Fig．1に示した二つの初期反応である。その第1は

3−hexulose phosphate syllthaseによる HCHO と

ribulose−5−Pの縮合であり，第2はphospho−3一

hexulσ一isomeraseによる fructose−6−Pの生成であ

る。本研究においては，メタノール資化性細菌Met−

hOrlomonas methanolovorans OUT 84022）がペン

トースモノリン酸経路を有するか否かを14Cにラベ

ルしたアイソトープを使用して検討し，さらに反応の

条件および反応により生成する初期安定化合物につい

ても調べた結果を述べる。

2．実験方法

＊大阪大学工学部

 1）供試菌株 Methorlomonas methanolovoran‘s

OUT 84022）を使用した。

 2）細胞抽出液の調製 前報3）Fig．2の画分B

一47一

昭和56年12月

山梨大学工学部研究報告

第32号

      叫OH       6紫H・，xul。se ph・・p・・坦’15

HCH°＋

香o 1：i曇

・・b・1・se−・−ph・・ph… i   Hexulose monophosphate c−Arabino−3−hexulose−6−’phosphate）   CHρH   ロ   C＝O   オ HO−C−H   コ H−C−OH   ロ H−C−OH   の   CH2ρ一P Phosphohexuloisomerase Table l Fixation of 14c formaldehyde by extracts      of 1し4：θth3ゾlomonas  methanoloz／orans・       The 14C fixed was expressed as the total      amount of 14C forrnaldehyde fixed in each      assay tube during the 10min incubation      at 300C． The results were corrected for       a background count・

Reaction system

14C−HCHO丘xed

（net d．P．m．      ×10−3） Complete， ribulose−5−phosphate       used Complete， ribose−5−phosphate used Ribulose−5−phosphate omitted Ce］1 free extract omitted Complete， but boiled cell free extract used＊ 19．6 24．7 0．9 0．5 0．6    Fructose−6−phoSphate Fig．1 Reactions catalysed byL hexulose phosphate      synthase and phosphohexuloisomerase・ を使用した。

 3） Hexulose phosphate synthase活性の測定

9uayleら1）の方法に従って行った。

 4）試薬 14CラベルしたHi4CHOはThe Rad・

iochemical Center， Amershamのものを使用した。

酸性フォスファターゼ，ribulose−5−P， ribose−5−Pは

シグマ社製を使用し，その他の試薬についてもすべて

市販の特級品を使用した。

3．実験結果’t

 1）Hexulose phosphate synthase活性

 Ωuayleらの1）反応系で30°C，10分間反応させた。

熱エタノールを加えて反応を停止させた後，5％酢酸

バリウムを加え氷浴中に放置して糖リン酸を沈殿させ

た。この方法によりHi4CHOから糖リン酸として固

定された14Cを求めTable 1に示した。その結果，．

完全系では10分間の反応でribulose−5−P， ribose−5−P

の双方について約20，000d．P．m．に相当する14Cの

固定がみられた。また，糖リン酸，細胞抽出液を除い

た系および熱処理した細胞抽出液を・使用した系での

14C固定反応はなかった。

 2） 14C固定量に対するタンパク量および反応時間

の影響

 反応系の細胞抽出液中のタンパク量を変えて1・4C

固定量を求めた。30°C，5分間の反応により糖リン酸

として固定された14Cは使用したタンパク量に比例

し（Fig．2），反応時間を．変えた場合，時間経過と共

に14C固定量は増加した（Fig．3）。これらの結果は，

＊Cell extract was boiled for 10min at 1000C before  use． 弍 偽 旨 § 』 § ミ＿

詩

きエ ζ 自       50        100        150        Protein （μ9） Fig．2 Effect of protein content in reaction      system on the fixation of（14C）for．      maldehyde． The llC fixed is expre．      ssed as the total amount of 14C fixed      in each assay tube during the 5min      incubation at 300C． The cell free      extract was prepared from methanol・      grown cells by crushing a cell sus・      pension and centrifuging the crude      extract at 100，000×gfor 60min．

Hi4CHOの14Cが酵素反応により糖リン酸に固定さ

れていることを示している。

 3） 反応の最適pH

 14C固定反応に対するpHの影響について検討した

ところ，最適pHは7．0∼7。5付近にあることがわ

かった（Fig．’4）。

 4）反応により得られる初期安定化合物の検討

 反応系1）を5倍にスケールアップして実験を行っ

た。反応液に熱エタノールを加えて反応を停止させた

一48一

メタノール資化性細菌Methbllomanas methanolovorans OUT 8402のメタノ9eル

資化経路（2）ペントースモノリン酸経路

12    ’”t’     月     早

   3

   6     ￡    8     昏     §     §     §    ミ    ミ    ℃    ミ    盆    冨    芸    留    ζ    2

       0 5101520

       Time （min） Fig．3 Progress curves for the reaction be・      tween（14C）formaldehyde and ribose−5−      phosphate catalyzed by extract of      ルfethovlo〃zonas sl）・○， complete system      containing 50μg of protein． The cell      extract was prepared by centrifuging      crude extract at 100，000×gfor 60min．      ●，contrbl lacking the cell extract・      The reaction tbmperature was at 300C．

 8

言

ξき §召

ジ

§

9

b

’9 ’口 器． ．2 頴 8

8

Fig．4 2．0 1．5 1、O 0．5 0        pH pH optimum for the fixation of 14C−

HCHO by extracts of methano1−grown

Mθ彦hOVIomonas sl）． The extract （1，000μgof protein／m1）was prepared by crushing a suspension of cells in a bu ffer mixture（50mM sodiumphosphate buffer， pH 7．0， containing 5mM MgC12）． The extract was diluted

with 200mM monopotassium phosphate−

dipotassium phosphate buffer of various pH to the concentration of 150μg of protein per．m1・ 1．0 0．75 倉 0・5 0．25         RibOse

oooo

         OF。u，t。s。

  oooo o

ABCDE

DE

0，5 0・25禽 0       （1）        （2） Fi9．5 Diagram of one−dimensional chromatogra．      ms of hydrolyzates of phosphorylated com．      pounds and some sugars・      Reaction time：（A）15min， but boiled cell      extract was used，（B）3min，（C）15min，      （D）30min，（E）45min．      Solvent system：（1）phenol．water（100：40，      v／v），（2）n−butanol−propionate−water（47：      22：31， v／v）．

後，3，800×gで遠心分離してその上澄液を減圧乾固

（40°C）した。乾物を0．1mlの水で溶解し，これを東

洋濾紙No・51を使用してクロマト展開した。展開溶

媒は1次にフェノールー水（100：40，v／v），2次にブ

タノールーフ゜ロピオン酸一水（47：22：31v／v）を使用

し4），2次元展開を行った。アルドース，ケトースの

検出4）を行い，原点付近に残っている糖リン酸区分を

切りとって水で溶出させ，これに酸性フォスファター

ゼを加え脱リン酸した。その反応液にエタノールを加

え遠心分離して沈澱を除き，得られた上澄液を減圧濃

縮した後，再クロマトした。その結果，反応時間と共

にリボースに相当するスポットは小さくなり，フラク

トースに相当する大きなスポットが表れた（Fig．5）。

反応時間が長いものについてはグルコースに相当する

小さなスポットも検出された。スポットの同定には2

種類の展開溶媒を使用してその Rfを確認した。熱

処理した細胞抽出液を使用した系の場合にはリボース

のスポットしか検出されないことから，フラクトー

ス，グルコースのスポットは反応による生成物である

ことが確認された。これらの結果は，Methylomonas

methanolovorans OUT 8402におけるペントース

モノリン酸経路の主要な初期安定化合物がフラクトー

スリン酸であることを示している。

4，考

察

  14Cホルムアルデヒドがリブロースー5一リン酸あ

るいはリボースー5一リン酸と細胞抽出液中の酵素とに

一49一

昭和56年12月

_{山梨大学工学部研究報告}

_第32号

依存する反応によって糖リン酸へ固定された。リブロ

ースー5一リン酸，リボースー5一酸の双方について高い活

性が検出されたのは，phosphoribose isomeraseによ

り相互変換が行われているためと推定される。固定さ

れた14Cの大部分はフラクトースリン酸であるとこ

ろから，ホルムアルデヒドと5炭糖リン酸から6炭糖

リン酸を生合成する酵素系の存在することが明らかと

なった。ペントースモノリン酸経路においては，ホル

ムアルデヒドとリブロ ・一スー5一リン酸とからhexulose

phosphate synthaseにより生成する化合物はhex−

ulose monophosphate（＝＝D−arabino−3−hexulose−6−

phosphate）であるが5），この化合物をペーパークP

マト上で確認することはできなかった。これはphosp・

hohexuloisomeraseによる， hexulose monophosph・

ateからフラクトースリン酸への素早い変換が行われ

ているためと考えられる6）。14C−HCHOの消費速度

から計算されたhexulose phosphate synthase活性

は，pH7．5のとき 92．2×10−3（mmol／mg protein／

hr）の高い活性を示し，ペントースモノリン酸経路利

用菌として知られている．Pseudomonas C7）， Pseudo・

monas methanicaおよびMeth5tlOCOCCUS caPsula・

tusl）の活性にひってきする値であった。以上の結果，

MethPtlomonas methanolovoransはペントースモ

ノリン酸経路によりメタノールを資化していることが

明らかとなった。

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一50一