Introduction to the High Pressure Enzyme Engineering Shigeru Kunugi Pressure can be a key control factor in the applied enzymology. High pressure tech

解説高圧酵素工学 の試 み

Introduction to the High Pressure Enzyme Engineering

功刀 滋

Shigeru Kunugi

Pressure can be a key control factor in the applied enzymology. High pressure tech-nique can be introduced in many aspects of enzyme engineering; preparation of enzymes, enzymatic conversion of chemical substances, modification and alternation of enzyme func -tions in chemical or biochemical ways, and enzymatic (biochemical) processes including immobilized enzymes. It could be called as high pressure enzyme engineering. Among these, the utilization of pressure dependence of enzymatic reaction rates and of the pres sure induced change in the higher order structure of enzyme proteins are explained in de -tail, by taking some hydrolytic enzymes as the examples.

1.は じ め に  酵 素活 性 に対 す る圧 力の 影響 はか な り以 前 か ら調べ られて い る[1]。 活 性 は構造 を通 して 発現 され るの だ が、 構造 変化 よ り増 幅 され た形 で と らえ る こ とが で き、 た とえ ば加圧 下 に お ける酵 素の 失活 や賦 活 によ り圧力 の影 響 を評価 す るこ とが で きるか らで あ る。 酵 素活 性 に対 す る圧 力の影 響 を調 べ る動 機 は伝統 的 な高 圧環 境下 に お いて生 息す る生物 の持 つ 仕組 み に対 す る興味 の他 に 、圧 力 と い う熱 力学 的パ ラ メー ターの 変 化 に対 す る(酵 素)反 応 の 応 答特 性 を調 べ て 反 応 機 構 を解 明 す る とい う ことが あ る。 これ らは互 いに 関連 した もの であ り、 ち ょ うど温 度 依存 性の 研 究が 耐熱 化 機 構 に対 す る興味 と反 応 機構 を知 る意欲 の 両方 に よ っ て推進 されて きたの とよ く似 て い る。  これ に加 え 最近 、 酵 素 ・タ ンパ ク質 な どが 高圧 下 で 示 す現 象 を広 くバ イオサ イエ ンスや 食品 科学 の 分野 で 利 用 す る ことが提 唱 され て い る[2]。 これ は高 圧 下 の 生 化学 現象 に対 す る三 つ 目の 動機 といえ る。  我 々 は、従 来主 と して第 二 の動 機 か ら加水 分 解酵 素 を中心 に酵 素 反応 の圧 力依存 性 を検 討 し[3]、 その 後 そ こで得 られ た 結 果 を い く つかの応 用 的 プ ロセ スに利 用 す る試 みを 行 っ て きた[4]。 こ こで は そ れ らの 結 果 を 中心 に 解説 す る。 2.酵 素反 応 の圧 力依 存性 の 利用  現 象的 には、 酵素 活性 は加 圧 によ り低下 す る場 合 と増加 す る場 合 とが あ る。非 常 に高 圧 にな れ ば どの酵 素 も失 活 す るよ うで あ るが 、常圧 で の パ ラ メー ター と して の見 か けの活 性 化体 積 は正 に な る 場 合 も負 に な る場 合 もあ る。 これ は温 度 の影 響 が反 応 速 度 で はほぼ 常 に正 で あ るの と大 きな違 い であ る。 ま た反応 の 内容 や酵 素 タ ンパ ク質 の性 質 によ って非 常 に 圧 力 の影響 を強 く受 け る場 合 と、 あ ま り圧 力の影 響 を 受 けな い場 合 とが あ る。 これ を い くつか の タ ンパ ク質 分 解 酵素 の 結果 を 例 に、 最 も簡 単 な取 扱 い(式1)に よ りkcatとKmに 対 す る効 果 に分 けて考 え、 △VKmと △V, の 符号 と して ま とめ る とTable1の よ うに な る[5]。  た とえ ば ト リ プ シ ン に よ るBzArgNH2の 加 水 分 解 反 応 の 二 次 反 応 速 度 定 数 は 、100MPaの 加 圧 に よ り、 Table 1 Effect of Pressure on Protease Reactions

京 都 工 芸 繊 維 大 学 繊 維 学 部Kyoto Institute of Technology

約2/3に な るが 、 エ ス テル基 質(BaArgOEt)のkcatは 圧 力 と共 に大 き くな る。  この二 種 類 の 基質 はKmが か な り違 うの で(前 者 の 方が 大 きい)、 適 当 な濃 度 を設 定 して お くと、加 圧 に よ りみか けの 反応 速度 の 変 化が 逆 にな るこ とが 観測 さ れ る。 この例 の場 合 は その単 位 活性 が あ ま りに も異 な るの で二種 類 の基 質 で特 異性 が逆 転 す るとい うこと は な いが、 セ リンカル ボキ シペ プチ ダー ゼの一 つ で あ る 酵 母 由来 の カ ル ボ キ シペ プチ ダ ーゼY(CPY)で は、 圧 力 を加 え る ことに よ り基質 特異 性 を逆 転 させ る こと が で きる。   CPYは カル ボ キ シペ プ チ ダ ーゼ で あ るが そ の活 性 (4)の 他 に エ ステ ラー ゼ活 性(5)や ア ミダ ーゼ 活 性(6) を も示 す。 と ころが、 そ れ らの圧 力 に対 す る応答 はか な り異 な って お り、(4)の 活 性 は(5)、(6)に 比 べ て加 圧 に よる減速 の程 度 が 大 きい。 したが って、 あ る条件 下 で ア ミドとペ プ チ ドあ る い はペ プ チ ドとエ ステ ル の 反応 速度 に注 目 して 圧 力を変 化 させ て い くと、 そ う高 くな い 圧 力 に お い て 反 応 速 度 の 大 小 関 係(反 応 特 異 性)が 逆転 す るこ とに な る。 -AA1-AA2〓-AA1-AA2-AA1-OR〓-AA1-ROH-AA1-NH2〓-AA1+NH3(6) 加水 分解 過程 に お け る この様 な特性 はそれ ほ ど利 用 価 値が な いよ うに も思 え るか も しれ な いが、 この酵 素 によ って加 水 分解 の逆 反 応 を触 媒 させ 、 ペ プチ ドを 合 成 させ よ うとす ると きに は、 この 特性 が収 率 な どに か な りの変 化 を もた らす。   CPaseYに よ るペ プ チ ド合 成 反 応 は この 酵 素 が ア シル中 間体(-AA,-CPY)を 経 て反 応 を進 行 させ る と ころか ら、 い くつかの プロセ ス でペ プチ ドを合 成 す る ことがで きる[6]。 -AA1-OR+CPY〓-AA1-CPY -AA1-OR+CPY+AA2-NH2〓-AA1-AA2-NH2+CPY(7) この うち、 エステ ラーゼ活性 に よってで きた ア シル中 間 体 をア ミノ酸 ア ミドで攻 撃 しア シル ジペ プチ ドア ミドを つくる方法(7)で は圧 力を加え ることに よりジペ プチ ドの 収率 が増 加 し、特 にFuaPheOR+PheNH2の 系 にお いては大 き く収 率 が増 加 した。 この 場 合 は、 一 旦生 成 したア シル ジペ プチ ドア ミドが ア ミダ ーゼ活 性 とそれ に引 き続 いて起 こ るペ プチ ダー ゼ活 性 に よ って 再分 解 され るが 、両活 性 に対 す る圧 力 の効 き方 が上 述 の よ う に違 い、 末端 が遊 離 の ア シル ジペ プチ ドの ものが 多 く 残 るため に この様 な結 果が もた らされ る もの と解 釈 で き る。 - AA1-AA2+CPY〓-AA1-CPY -AA1-CPY+AA 3-NH2 〓- AA1-AA3-NH2+CPY(8)  一 方 ペ プチ ド基質 に ア ミノ酸 ア ミ ドを作 用 させ る こ と に よ るペ プ チ ド生 成 反 応(8)に 対 す る圧 力 の 影 響 を み ると、 ペ プチ ダー ゼ活性 を利 用 した場 合 には加 圧 に よ りア シル ジペ プチ ドア ミドの収 率 が増 加 す る と共 に 未 反応 の ア シル ジペ プチ ドが 多 く残 るよ うにな る。従 って反 応 した基 質 中の 目的生成 物 の割 合 は加圧 に よ り か な り大 き くな り、加 圧 下 で は ア シル ジペ プ チ ドア ミドか らア ミダ ーゼ活 性 に よ って生 成 され た ア シル ジ ペ プ チ ドが 見 られ る よ うにな る。 - AA1-OR+CPY〓-AA1-CPY -AA1-CPY+AA2-OR 〓- AA1-AA2-OR+CPY(9)  ま たエ ス テ ラー ゼ活 性 を 利 用 した場 合(9)に はエ ス テル 末端 を持 った ペ プチ ドが再 び 基質 と して 反応 す る ため 、 オ リゴペ プ チ ドが 生成 され る。 ア ミノ酸 エ ステ ルの濃 度 が低 い場 合 に は圧 力 の効 果 は ほ とん ど見 られ ない。 置換 効率 を上 げ よ うと して そ の濃度 を高 くす る と、 む しろ未反 応 の ア シルア ミノ酸 エ ステル の量 が 大 き くな って しま う。 これ はPheOEtが 競争 阻害 剤 と し て 働 くた めで あ り、 この酵 素 に限 らず キ モ トリプ シ ン な どで の ペ プチ ド生 成 で も問 題 と な る。 圧 力 は この阻 害 を取 り除 くの に有効 で あ り、 ア シル ジペ プ チ ドエ ス テ ルや ア シル ジペ プチ ドの収 率 を増 加 させ る。  も う一 つ の例 と してZnプ ロ テア ー ゼの 一 つ で あ る サ ー モ ラ イ シ ン(TLN)に よ る反 応 を 見 て み よ う。 Table1か ら もわ か る よ う に、TLNで は、 か な り大 きな加圧 に よ る活 性 増加 が 見 られ る。 た とえ ば 、100 MPaの 加 圧 はkcat/Kmを13倍 以 上 にす る。 これ は同 じZn酵 素で あ るカル ボ キ シペ プチ ダ ーゼA(CPA)の 活 性 が 約1/3に 低下 す るの と好 対 照 で あ る。TLNで は触 媒 反応 の進 行 と共 役 した酵 素 タ ンパ ク質構 造 と水 和 構造 の変 化(水 和 の 増 加)が お こ って お り、 そ れが 反映 されて い る もの と解 釈 され る。  この よ うな圧 力 活性 化現 象 を ペ プチ ド縮合 反 応 に応 用 す る と ど うな るで あ ろ うか。TLNは エ ン ドペ プチ ダ ーゼで あ り普通 の エ ステ ラー ゼ活 性 を持 って い な い ため 、 ペ プチ ドの生 成 は加 水分 解 反応 の逆 反 応 に よ ら なけ れば な らな い。 FuaGly+PheNH2〓FuaGlyPheNH2+H2O (10) の反 応 で は圧 力 を加 え る とか な りペ プチ ド収率 が 減少 す る。 酵素 の活 性 は大 き くな って い るはず な の に収率 が下 が るの はな ぜで あ ろ うか。 この 基質 の組 み 合 わせ

はTLNに と って特 異 的 な もので あ るが 、 その 様 な場 合 に はペ プチ ド縮合 反 応 の進 行 はか な り速 く、一'定以 上の 酵素 濃度 で は収 率 は平 衡定 数 に よ って 決 ま って し ま うよ うで あ る。 そ うな る と、(10)式 の左 辺 の物 質 は いず れ も反 応条 件で は次式 の よ うに イオ ン化 され て い るので 、 Fua-CONH-CH-COOH 〓 Fua-CONH-CH-COO-(11) NH2-CH(CH2φ)-CONH 〓 NH3+-CH(CH2φ)-CONH(11') (10)式の 右 向 きの反 応 の全 体 は イオ ン消滅 反 応 とな る が 、加圧 下 で は イオ ン基の 周 りに密 に存在 して い る水 の方 が有 利 に働 くの で 、平 衡 は左 に偏 って しま い収率 は下 が る。  これ に対 し、   CbzAsp+PheOMe〓CbzAspPheOMe+H2O (12) の反 応 はか な りゆ っ くりと進行 し、 と くに有機 溶 媒 を 加え て イオ ン化 の影 響 を低 くした条 件 で は、圧 力 を加 え る こ とによ り一 定時 間 内 での ペ プ チ ド収 率 はか な り 高 くな った。  以 上の よ うな 例 は圧 力を 一種 の有 機 反応 の 改変 に利 用 した こ とにな るが 、一般 に有 機合 成 反応 を高 圧 下で 行 わせ るよ うな試 み の 場 合 に は、 数 百 か ら一 千MPa 以上 とい う非 常 に高 い圧 力 を加 え るの が普 通 であ る。 これ に対 し、酵 素反 応で の 利用 で は、酵 素 触媒 とい う 高分 子化 合物 で圧 力 の影 響 をむ しろ受 けや す い もの を 媒 介 と して(一 種 の トラ ン ス デ ュ ー サ ー と して)圧 力 の 影 響 を 反 応 過 程 に与 え る た め 、 よ り低 い 圧 力 で 効 果 が 顕 著 に 現 れ る と い う特 徴 が あ る 。  そ の ほ か の 加 水 分 解 酵 素 の 反 応 に 対 す る圧 力 の 効 果 の 研 究 は 必 ず し も多 く な い が 、Table2の よ う に ま と め る こ と が で き る。 多 糖 の 分 解 酵 素 で は 、 加 圧 に よ る 加 速 と共 に 、 グ ル コ シ ル 転 移 反 応 の 促 進 な ど も観 測 さ れ て い る 。   わ れ わ れ の 研 究 グ ル ー プ で は核 酸 分 解 酵 素 と して 、 こ れ ま で に 植 物 由 来 の エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ の 反 応[7] お よ び シ ク ロ デ キ ス トリ ン に よ る モ デ ル 反 応[8]を 取 り上 げ 、 い ず れ も圧 力 の 反 応 の 速 度 お よ び 特 異 性 へ の 影 響 を 手 が か り と して 、 そ の 反 応 機 構 の 一一端 を 考 察 し て き た 。  こ こで は ク ラ スIIエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ で あ るEcoRI の 結 果[9]に つ い て 詳 し く述 べ よ う。  あ らか じめ200MPaの 圧 力 を 一 定 時 間 印 加 して 処 理 し た 酵 素 を 用 い て 、 常 圧 下 で の λ一 フ ァ ー ジDNA の 分 解 反 応 を 行 っ た 結 果 、EcoRIの 標 品(供 給 者)に よ っ て 差 が み られ る が 、 わ れ わ れ が 使 用 し たEcoRI につ い て は 一 定 の 反 応 時 間 ・圧 力 範 囲 内 で は 不 可 逆 的 失 活 は 起 こ ら な い こ と が 確 認 さ れ た(Fig.1)。 λ― フ ァ ー ジで はEcoRIの 切 断 箇 所 が 複 数 あ り 解 析 に 障 害 を 生 じ る た め 、EcoRIサ イ トが 単 数 で あ るpBR322 DNAとpBluescriptDNAも 基 質 と して 用 い 、 さ ら に これ らの プ ラ ス ミ ドで のsuperhelixの あ り方 に 対 す る 圧 力 の 効 果 の 輻 輳 を 避 け る た め 、 そ れ ぞ れPstIと ScaIで 直 線 化 し た も の を 基 質 と した 。

Table 2. Volumetric parameters reported for the hydrolytic enzymes of nucleic acids and polysaccharides.

  Fig.2はEcoRIお よ びBamHIを 使 っ て 、 フ ァ ー ジ のDNAを200MPaの 圧 力 下 で 切 断 させ た 結 果 で あ る 。60分 間 に 減 少 した λ一DNAイ ンタ ク トの 反 応 量 を 、 λ一DNAの 仕 込 み 濃 度 を 変 え て 測 定 し た 。Eco RIとBamHIと も に 高 濃 度 の 基 質 に 対 し て は 反 応 は stoichiometricに 進 行 し な く な る 。EcoRIと λ一 DNAの 反 応 系 で は 、 常 圧 下 で の 結 果 と高 圧 下 で の 結 果 に ほ と ん ど 差 が な い こ と か ら 、200MPaの 加 圧 に

Fig.1. The effect of pressure treatment on A - DNA cleavage reaction (after the treat-nent at 0.1 MPa) by restriction nuclease. a,b

y EcoRI incubated at 0.1 MPa; b, by EcoRI at 200MPa; c, by BarHI at 0.1 MPa; d, by Bam HI at 200 MPa.

Fig.2. The amount of A - phage DNA cleavage in 60 min. a, with EcoRI 0.1 MPa; b, with Barn HI. open, 0.1 MPa; closed 200 MPa. [nuclease]= 1.0 unit/50 u of 50 mM Tris/10 mM MgC12/1 mM DTT/100 mM NaCI pH7.5, at 37•Ž. よ る 反 応 性 の 変 化 は 認 め られ な い と い え る 。 こ の 結 果 はMacgregorの 報 告[10]と は 全 く異 な っ て い る。  さ ら にpBluescriptDNAを 基 質 に 用 い て 制 限 反 応 の 速 度 論 的 評 価 を 行 う と 、(見 か け の)Km,κ,atと し て0.1MPaで は19nM,6.2×10-2nM・min-1が 、200 MPaで は27nM,7.0×10-2nM・min-1が 得 られ た 。 二 点 だ け か ら単 純 に 体 積 パ ラ メ ー タ ー を 計 算 す る と 、 そ れ ぞ れ 、Klmが3.7mひmol-1、k,atが 一2.6m4・ mol-1と な る 。つ ま り、200MPaの 圧 力 は 表 面 上 ほ と ん ど反 応 速 度 に 効 果 を 及 ぼ さ な い が 、Kmに 対 す る不 利 な 効 果 とcatに 対 す る有 利 な 効 果 とが 相 殺 して い る こ と に な る。   一 方_{、 こ れ らのDNAに 対 す る切 断 部 位 の 変 化 は こ} の 圧 力 範 囲 で は 観 測 さ れ な か っ た 。 し か し、EcoRI な ど で は最 適 な 条 件 か ら人 為 的 に ず らせ る こ と に よ っ て 、 塩 基 配 列 特 異 性 が 甘 く な る こ と が 知 ら れ て い る(Star活 性)。 例 え ば 、 イ オ ン強 度 を 低 下 さ せ る と か 有 機 溶 媒 濃 度 を 上 げ る と 、EcoRIはGAATTCだ け で な く他 の 配 列 を も切 断 す る よ う に な る。 こ の 緩 ん で しま っ た 特 異 性 は 、 圧 力 を 高 くす る こ と に よ り元 に 戻 さ れ る こ と が 観 測 され た 。 こ の 場 合 本 来 の 活 性 は 保 存 さ れ て い る の で 、 酵 素 活 性 が 低 下 し た の で は な く基 質 認 識 の 厳 密 性 が 回 復 さ れ た こ と に な る。  こ の 結 果 は 、 こ の よ うな 酵 素 に お い て 基 質 取 り込 み に 働 い て い る非 特 異 的 な 力(静 電 的 相 互 作 用)と 特 異 的 な 相 互 作 用(水 素 結 合)に 対 す る圧 力 効 果 の 差 異 か ら生 じて い る も の と考 え られ るが 、 そ の 延 長 線 上 に は、 特 異 性 の 低 い 制 限 酵 素 の 配 列 特 異 性 を 圧 力 で 制 御 す る と い っ た応 用 的 側 面 が 期 待 さ れ よ う。 3.タ ンパ ク質 ・酵 素 の 圧 力 変 性 の 利 用   上 述 の よ うに タ ンパ ク 質 の 圧 力 変 性 は 、 あ る程 度 ま で の 範 囲 な ら可 逆 的 で あ り、 変 性 の しや す さ は タ ンパ ク質 に よ って 異 な る。 お お む ね 小 さ い 単 量 体 タ ンパ ク 質 は 圧 力 に 強 く、 大 き な 多 量 体 の もの は(そ の サ ブ ユ ニ ッ トを 比 較 して も)弱 い 。 ま た 、 分 子 内 の 架 橋 結 合 の 多 少 に よ っ て も大 き く変 わ る こ と は 容 易 に 理 解 で き る で あ ろ う。 この よ う な 個 々 の タ ンパ ク質(あ る い は そ の 他 の 成 分)の 持つ『 耐 圧 特 性 』 とで も い うべ き も の を う ま く利 用 す る こ とが 考 え られ な い だ ろ う か 。 耐 熱 性 につ い て は 、 粗 精 製 酵 素 の 熱 処 理 に よ る 選 択 的 変 性 な ど 色 々 な 局 面 で 耐 性 の 違 い が 利 用 さ れ て い る が 、 圧 力 の 方 が 選 別 性 や 活 性 の 保 存 性 に勝 れ て い る の で は な か ろ うか 。  そ の 一つ の 具 体 例 と して 、 膜 タ ンパ ク質 の 選 択 的 可 溶 化 が あ げ られ よ う。Shinitzkyの グ ル ー プ は 生 体 膜 内 に お い て タ ンパ ク質 よ り も脂 質 成 分 の 方 が 圧 力 の 影

響 を よ く受 け流 動性 と静電 的 相互 作用 が 減少 す る こ と に よ り、 一定 以上 の圧 力 で特 定 の膜 タ ンパ ク質 が選択 的 に脱 落 す る(可 溶 化 され る)こ と を示 した[11]。 圧 力 と溶液 条件 に よ って赤 血球 膜 か らタ ンパ ク質 が遊 離 され て い く。 この よ うな原理 は赤 血 球膜 や がん細 胞 か ら抗 原性 タ ンパ ク質 や 免疫 タ ンパ ク質 を単離 す るの に 使用 され た。 また多種 類 の タ ンパ ク質 の混合 物 な どに 対 して は、 これ とは逆 に加圧 によ る選択 的 な不 溶化 が 考え られ る。 硫安 分 画の よ うに圧力 に対 す る不 可逆 的 変性(お よ び不 溶 化)の 違 い に よ って 各 タ ンパ ク質 を 分別 す る とい った こ とであ る。  一 方林 らは プ ロテア ーゼ に よ る食 品 タ ンパ ク質 の選 択的 分解 の 目的 に、 分解 を 受 け るべ き タ ンパ ク質 の圧 力変 性 の受 けや す さの 違 いを利 用 した[12]。 い くつか の タ ンパ ク質 を常 圧 と200MPaで サ ー モ ライ シ ンに よ って分 解 して み る と、 カゼ イ ンや 大豆 プ ロテ イ ンは どち らの 圧 力で も同 じ様 に分解 され るの に対 して 、四 量 体で あ るア ル コー ル デ ヒ ドロゲナ ー ゼや ヘ モ グロ ビ ンは高 圧で よ く分 解 され た。 多量 体 で な くて も β―ラ ク トグ ロブ リ ンは加 圧下 の方 が よ く分 解 され 、 α―ラ ク トア ル ブ ミンが加 圧 下 で少 し しか 分解 され なか った こ と と対 照 的 で あ った 。 これ は後 者 が 多 くのS-S結 合 を有 して い るた めだ が、 この ことを利 用 して 、 牛乳 ホ エ イ 中 に 含 ま れ る β―ラ ク トグ ロ ブ リ ン と α―ラ ク トア ル ブ ミンの うち前者 だ け を選択 的 に分解 除去 す る可 能性 を 示唆 して い る。  この 例 の発 展 と して、高 圧 力によ って(可 逆的 に)変 性 させ た タ ンパ ク質 を プ ロテ アー ゼ によ って特 異 に限 定 分解 す る ことが 考 え られ る。 タ ンパ ク質 の"状 態" を圧 力 に よ って 変 え る こ とに よ り分解 パ ター ン(切 断 位 置)を 変 化 させ る とか 、 あ るい は、 高度 な複 合体 を 形 成 して い る もの を圧 力 と い う"変 性 剤"で(可 逆 的)に 変性 させ た うえ で分 解 処理 を しよ うと い う もの で あ る。 タ ンパ ク質 の三 次 元構 造 を崩 した上で 、酵 素 や 有機 化 学 的 試 薬 で 修飾(切 断)す る と い うの は種 々 の局 面で 行 われ て い る ことだが 、化 学 的変 性剤 の使 用 には多か れ少 な かれ 事後 の 除去 操作 が必 要 で あ る。 こ れ に対 し圧 力 とい う物理 的"変 性 剤"が う ま く利用 で きれ ば、 そ の場 合 に は 「圧 力バ ル ブの 開放 」 と い う操 作 だけで 「変 性剤 無 添加 」 の状 態が 復 元で きる とい う 魅 力が あ る。 同様 の こ とは熱で もで き るはずで あ るが 、 熱の 場合 に は低 分子 化合 物 に与 え る影 響が 無視 で きな い とか、 分子 種 に よ る耐 熱 性の 差が そ う大 き くな く、 選択 的変 化 を与 え る微妙 な 条件 を捜 しに くい な どの不 便 さが あ る。  加 圧下 と常圧 下 で牛 血 清 アル ブ ミ ンを トリプ シ ンお よびTLNで 分 解 した場 合 に は、 圧 力 変性 下 で は いず れ の場 合 も特徴 あ る新 たな分 解 ペ プ チ ドが 生 じて い る [13]。 熱 あ る い は 圧 力 で 不 可 逆 的 に 変 性 さ せ て しま っ た タ ン パ ク 質 で は、 か な り 浅 く処 理 を させ て も極 め て 多 数 の ペ プ チ ドに ま で 分 解 さ れ て し ま い 、 尿 素 や SDSと い っ た 変 性 剤 存 在 下 で の 分 解 処 理 と比 べ て 、 分 解 パ タ ー ンが 異 な る の は 勿 論 で あ る が 、 条 件 の 設 定 が 容 易 で あ る と い う特 長 もあ る 。  同 様 の 原 理 を さ ら に 金 属 プ ロ テ ア ー ゼ の ズ ブ チ リシ ン(Sub)に よ る 限 定 加 水 分 解 に 応 用 した 。 Solomonら は 常 圧 で のCPAのSubに よ る 限 定 分 解 が エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 の 上 昇 を もた らす こ と を 報 告 し て い る が[14]、 こ れ に 対 す る圧 力 の 効 果 を 検 討 した わ け で あ る[15]。 所 定 の 重 量 比 のSubとCPAを 混 合 し、 定 温,定 圧 に 保 っ た 後,分 解 生 成 物 の エ ス テ ラ ー ゼ 活 性,ペ プ チ タ ー ゼ 活 性 を 、 基 質 と して 各 々 、 Hippuryl-DL-phenyllactic acid,Hippuryl-L-phenylalanineを 用 い て 測 定 し た 。 こ の 分 解 を0.1お よ び200MPa下 で 行 っ た と こ ろ(Fig.3)、 常 圧 下 で は

Fig.3. Changes in esterase and peptidase activi-ties during Sub digestion of CPA. CPA (1 mg/ ml) + Sub(0.05 mg/ml) in 1 M NaCI/0.05 M Hepes(pH7), 4•Ž. Open, 0.1 MPa; closed 200 MPa. •›, esterase; • , peptidase.

エ ステ ラ ーゼ 活性 は16時 間後 に最 高値(275%)に 達 し、 その後 は低下 した。一 方 、高 圧下 で は活性 は当初 速 く 上 昇す る。 しか し、活 性 の低 下 もまた常 圧の 場合 に比 べ 早 く始 ま り、結 果 と して活性 の 最高 値 は低 い レベ ル に留 ま る。 これ はSubに よ るCPAの 更 な る分 解 が圧 力を 印加 す る ことに よ り促進 され るこ とを意 味す る。 CPA、CPSの 推 移 は、 次式 の よ うに概 略 化で き るが 、 第 一 ステ ップに比 べて 第ニ ステ ップの ほ うが よ り圧力 に よる促進 を 受 け ると考 え られ る。 この ことは電 気泳 動 で分 解生 成 物 を観 た結 果か ら もうか が われ た。

CPA〓CPS〓Further Fragments (13) (1st step)(2nd step)   Subに よ る 無 定 型 の ポ リペ プ チ ドの 加 水 分 解 反 応 に 対 す る 圧 力 の 効 果 は お そ ら く α一 キ モ ト リ プ シ ンの ア ミダ ー ゼ 活 性 の そ れ と 類 似 して い る と思 わ れ る が 、 後 者 の200MPaま で で の △V‡は0∼10m〓/mol程 度 (加 圧 に よ り 少 し遅 く な る)で あ り 、 従 っ て こ こ で み られ る 加 圧 に よ る分 解 の 加 速 は 主 と して 基 質 で あ る酵 素 タ ンパ ク 質 の 高 次 構 造 の 変 化 か ら生 じて い る もの と 思 わ れ る。 一 方SubでTLNを 分 解 す る と分 解 生 成 物TLN-S が 生 じそ の ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 は 低 下 す る[16]。 同 じ く 0.1お よ び200MPa下 で こ の 分 解 を 行 い 、 ペ プ チ ド基 質 と し てFua-Gly-Leu-NH2を 、 エ ス テ ル 基 質 と してFua-Gly-OLeu-NH2を 用 い て 観 測 した と こ ろ Fig.4の よ う な 結 果 が 得 ら れ た[17]。TLN-Sに 対 す

Fig.4 Changes in esterase and peptidase activi-ties during Sub digestion of TLN. TLN(1mg/ m〓)+Sub(0.05mg/m〓)in 1M NaCl,4℃.a, peptidase; b,esterase. Open,0.1MPa;closed 200 MPa.〇,pH7;□,PH8;◇,pH9;△,pH10. るエ ステ ラーゼ 活性 は ここで初 め て測 定 され たが 、ペ プチ ダーゼ活 性 と同様 に限 定分 解反 応 の進 行 につ れ低 下 した。 これ は、CPAの 場 合 とは異 な った様 相 で あ る。 これを加 圧下 で 行 うと活性 低下 の 程度 も速 度 も大 き くな り、12時 間後 の 活性 は常 圧 の場 合 の それの50% にな った。PAGEの 結 果 か ら加 圧下 で の 反 応 は常 圧 よ り も早 く進 行 し、 高度 に分解 され た もの もふ え る こ とがわ か った。  一方_{、酵 素 的修 飾だ けで な く化 学的 な修 飾反 応 を圧} 力変性 酵素 タ ンパ ク質 に施 す ことにつ いて は多 種 多様 な応用 が あ る。 その よ うな試 みの 一つ と して 、酵 素 タ ンパ ク質 の フ ェロセ ン化 にお いて 圧 力変性 を利 用 した。  一般 に酸化還 元 酵 素で は電子 を受渡 しをす る部 位 は 分子 の外 表面 に はな く、 従 って電 極 との 間の電 子 の 直 接的 な 授受 を 媒介 す る物 質(メ デ ィエー ター)を 共 存 さ せ る こと によ り酵 素触 媒 反応 を電 極 過程 と リン クさせ る試 み が行 われ て い る。  グ ル コ ース オ キ シタ ーゼ(GOD)を 例 に とれ ば 、 基 質(グ ル コー ス)の 酸 化(式14)に よ っ て還 元 され た GOD(+補 酵 素)は 通 常02に よ って 再酸 化 され るが (式15)、 これ を メ デ ィエ ー タ ー(M)を 介 して 電 解 酸 化 す る(式16,17)わ けで あ る。 メデ ィエ ー ター と し て は フ ェ ロセ ン(Fc)や キ ノ ン類 が 用 い られ る。 タ ン パ ク質性(高 分 子性)の メデ ィエ ー ター を得 る こ と は、 これ らの 反 応 を包 括 固定 化 ・膜 内封 入化 した 系 で行 わ せ るの に有 利 で あ るが 、 その 目的 の た め に水 谷 らは Fcで 修 飾 したBSAを 調節 して固 定 化電 極 系 を構成 す る ことに成 功 した[18]。 その際 フ ェロセ ンカル ボキ シ アル デ ヒ ドに よ る修飾 を6M尿 素共 存 下 で行 う方 が導 入 され るFc量 が 多 くま た電 子伝 達 媒 介能 も高 い と報 告 して いる。 GOD(ox)+Glucose〓 GOD(red)+Gluconolactone (14) GOD(red)+O2〓GOD(ox)+H2O2 (15) GOD(red)+M(ox) 〓 GOD(ox)+M(red) (16) M(red)〓M(ox)+e-(to electrode) (17)   彼 らの 方 法 に 準 じてFe-BSAの 調 製 を 高 圧 下 で 行 って み た[19]。 得 ら れ たFc-BSAのFe原 子 吸 光 分 析 か ら、BSA一 分 子 に 結 合 して い るFcの 個 数 を 求 め た と こ ろTable3の よ う な 結 果 が 得 ら れ た 。 圧 力 変 性

Table 3. Number of Fe found in Fc-BSA pre-pared under different conditions.

を使 って 調 節 したFc-BSAに は6M尿 素 変 性 や 未 変 性 よ りも多 くのFcが す ばや く導 入 され て い る。  一 方 、タ ンパ ク質 内部 に修飾 され るFcの 量が問題 とされ るGODそ の もの のFc化 に よ る 自 己電 子 伝 達 型 酵 素 はHellerら が 最 初 に提 案 した もの で あ るが [20]、 酵 素 分 子 内 にFcに よ って電 子 伝 達 回 路 を形 成 させ電 極 と酵 素 との 電子 授受 を 可能 に しよ うとす る も ので あ る。  種 々の 条 件 下 で のFcの 導 入量 はTable4の 様 で あ った。 他 の メデ ィエー ターを添 加 しな い無 酸 素 条件 で

Table 4. Properties of Fc-GOD prepared under different conditions.

Incubated for 12 hrs.

Measured at pH5.7 (10mM MES), 20•Ž with [Glc]=5mM. の グ ル コー ス酸 化反 応 は、同 じ表 の 四列 目に示 した通 りで あ るが 、Fc-CHOを 用 い た 場 合 は導 入Fc当 り の 電流 増 加量(第 五 列)が 余 り上 が らず 、 沢 山Fcが 入 る割 に は 、 効果 的 で は なか った 。Fc-COOHで は 、 圧 力変性 下 で修 飾 した酵素 は十 分 に電 極 と電 子の 交換 が で きたが 、3M尿 素 条件 で 得 られ た もの よ り も活性 は低 く、 コ ン トロール 以下 で あ った。   Fc-GODの 反 応 は、Hellerら が示 した よ うな文 字 どお りの 自 己伝 達 型 と して分子 内 で行 わ れ る もの の 他 に、分 子 間で行 わ れ る ものが考 え られ るはず で あ る。 GODの 周 囲 に つ い て い るFcは 他 のGODに と っ て(上 記 のFc-BSAの 場 合 と同 じ く)メ デ ィエ ー 夕 ーその もので あ り、 また 修 飾操 作 中 に変 性 ・失 活 して し ま ったFc-GODは 、 タ ンパ ク質 性 メ デ ィエ ー ター 以 外 の なに もの で もな い。 この ことの寄 与 を調 べ るた め に、 一 定 量 のFc-GODの 存 在 下 で 、 未 修 飾 のGOD を加 え た場 合 に見 か けの 活 性(電 流 の 増 分)が ど う変 わ るか を見 た と ころ、 尿 素処 理 に よ るFc-GODで は、 未 修 飾 のGODを 添加 す る こと に よ り観 測 電流 量 が 非 常 に大 き く増加 し、明 らか に分子 間 の メデ ィエ ー ター と して 働 いて い る分が か な りあ る ことが わか るの に対 し、 圧 力 変 性 に よ るFc-GODで は 未修 飾 のGODの 添 加 によ る電流 増 加の 効果 はほ とん ど見 られ ず、 従 っ て このFc-GODは 分 子 間 メデ ィエ ー ター と して の働 きはせ ず、 低 い値 なが ら もほ とん ど全 て が分 子内 伝達 に よ る もの で あ る ことが判 明 した。 4.お わ りに  以上 ご く限 られ た例 を取 り上 げ ただ けで も、 それ ら と高圧 プロセ ス とを組 み 合わせ る ことに よ って い くつ もの応 用 の可能 性 が現 れて くる こ とが お わか りいた だ けた と思 う。  酵 素 の 工 業 的 利 用 に関 す る一連 の 体 系 は 「酵 素 工 学 」 と呼称 され る ことが 多 く、 この体 系 に 「高 圧 力 」 と い う概念 を導入 す る こ とで 、 「高 圧 酵 素工 学 」 とで もい うべ き領 域が 形成 され るので はな いか と考え 、 こ の小 文の 表題 と した。  酵 素工 学 に は有 用酵 素 の大 規模 生産 か ら酵 素 に よ る 物 質 の変 換、 固定 化酵 素 を含 む プ ロセ ス化技 術、 お よ び これ らを 目指 した酵 素 改変 の技 法等 が 包含 され よ う が、 そ の中で 物質 変換 の段 階 が最 も高 圧 力 を導入 す る 対 象 とな りやす く、上 の解 説 もそれ に関 す る事柄 が 多 くな った。 しか し酵 素調製 の た めの一 部 の過 程 に も加 圧処 理 を組 み入 れ る ことがで き、 また固 定化 酵素 プ ロ セ スに対 す る圧 力の 効果 も調 べ られ て い る。 さ らに、 タ ンパ ク質工 学 に よ る高圧 下 で の使 用 に適 した(耐 圧 性 の)酵 素 タ ンパ ク質 への 改 変 と い う新 た な分 野 も考 え られ よ う。  熱 、高 温 とい う環 境 を色 々な局 面 に使 うこ とにつ い て は、我 々は人 類の 歴史 と同 じぐらい長 い 間習熟 して きたの で、生 化学 的 な分 野 に も抵 抗 な くまた さ して 意 識 もせ ず に(?)導 入 されて い るが 、高 圧 環 境 と い うの は我 々が 獲得 して た かだ か100年200年 とい った と こ ろで あ ろ う し、装 置 的 に して も恒 温装 置 の よ うに はい か なか った。 今後 は、様 々な研究 対 象 を熟知 した方 が 試 され る こ とによ って飛 躍 的な進 展 が あ る もの と期 待 す る。 参考文献 [1]比 較 的最 近の 総説 と して は次 の もの があ る。

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