Res. Org. Geochem. 31, 1 17 (2015) 地球 環境有機分子質量分析マニュアル No.29 技術論文 LC/ESI-MS * ** ** ** はじめに Eksborg and Schill, 1973; Gloor and
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(2) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. LC / MS を取りまく状況を少しでも前進させるため. 5 µm; Thermo Fisher Scientific Inc.）および同ガード. に，重要な有機分子のマススペクトルデータを示. カラム（4.6 × 10 mm, particle size 5 µm）で行った。. しておくのは将来に有益であると考える。この技 術論文では，イオンペアクロマトグラフィーを用 いたアミノ酸の分離と質量分析によるマススペク トル解析を報告する。. カラムおよびガードカラムは，カラムオーブン （Cool pocket column cooler, Thermo Fisher Scientific Inc.）で 10.0℃に保持した。溶離液は，A：20 mM ノ ナフルオロ吉草酸（Nonafluoropentanoic acid, NFPA; 分子量 264.05） ，B：100％アセトニトリル（分子量 41.05）を 用 い， 流 速 0.2 mL / min で，0 分（B 液：. 2. 分析方法. 0％）から 60 分（B 液：60％）のグラジエントで. 2.1. アミノ酸試薬 アミノ酸は，試薬メーカー（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Shanghai Hanhong Chemical Co., Ltd.; Sigma-Aldrich Co. LLC.）から入手したアミノ酸標. 行い，60 – 70 分でバックフラッシュを行った後， 30 分（B 液：0％）の平衡化時間を確保した。分 離カラムの固定相とイオンペア剤の親和性を確保. 品：グリシン（glycine） ，アラニン（L-α-alanine） ，セリ. するために，分析の前日に一晩，同条件かつ流速 0.1 mL / min でカラムの初期平衡化を行った。分析. ン（L-serine） ，トレオニン（L-threonine） ，アスパラギ. 前と分析後の十分な平衡化の時間は，分離および. ン（L-asparagine） ，グルタミン（L-glutamine） ，アスパ ラギン酸（L-aspartic acid） ，グルタミン酸（L-glutamic. 保持時間の安定性を確保するために重要である。. acid） ，プロリン（L-proline） ，バリン（L-valine） ，リ シン（L-lysine） ，ロイシン（L-leucine） ，イソロイシン （L-isoleucine） ，メチオニン（L-methionine） ，ヒスチジ ン（L-histidine） ，アルギニン（L-arginine） ，フェニル アラニン（L-phenylalanine） ，チロシン（L-tyrosine） ，. イオンペア剤の最適化は，既報（例えば，Cecchi, 2008）に詳しくまとめられている。 アミノ酸の検出は，前述のオンライン分離で電子 スプレーイオン化質量分析計（ESI, positive mode） へ導入し，質量範囲 m/z 70 – 400 で行った。イオン. ヒドロキシプロリン（L-hydroxyproline） ，サルコシ. ソースの条件は，ドライガス窒素温度 200℃，ド ライガス窒素流量 10 L，ネブライザー圧力 50 psi，. ン（sarcosine） ，β-アラニン（β-alanine） ，N-エチルグ. キャピラリー電圧 3000V で行った。ポジティブイ. リシン（N-ethylglycine） ，α-アミノ酪酸（L-α-aminobutyric acid） ，α-アミノイソ酪酸（α-aminoisobutyric. オンモードおよびネガティブイオンモードでの適. acid） ，β-ア ミ ノ イ ソ 酪 酸（D,L-β-aminoisobutyric acid） ，γ-アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid） ，イソバ. 用について，溶質と溶液に関する酸塩基理論の原 理を Figure 1 に示す。ESI で生成するイオンは，試 料溶液の pH に依存する傾向があるので，試料の. リン（L-isovaline） ，α-アミノアジピン酸（L-α-aminoadipic acid） ，ノルバリン（L-norvaline） ，ノルロイ. コンディショニングは重要である。ここで，アミ + ノ酸はイオン化され， ［M + H］ の形で検出される。. シン（L-norleucine）を用いた。各アミノ酸は，0.1M HCl を用いて pH1 に調整した純水に溶かして定容・. 光学検出器は，ダイオードアレイ検出器（DAD, Agilent 1100）を用い，吸光特性のある芳香族アミ. 調整した。タンパク性アミノ酸および非タンパク性. ノ酸を検出し，アミノ酸の分離状態とカラムのコ ンディショニングをモニターした（220 – 400 nm を. アミノ酸の分子情報を Table 1 に示す。. 検出；Appendix） 。 2.2. イオンペアクロマトグラフィーによるアミノ 酸の分離と質量分析. 3. 結果と考察. アミノ酸は，誘導体化を行わず，液体クロマ トグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析 法（HPLC / ESI-MS, Agilent 1100）を用いて分析し た（Takano et al., 2015） 。 ア ミ ノ 酸 の 導 入 量 は， 1.25 nmol から 160 nmol の範囲で行った。分離カラ ムは，Hypercarb column（4.6 × 150 mm, particle size. 3.1. アミノ酸のマスフラグメントパターン イオンペアクロマトグラフィーによる各アミノ 酸の分離例を Figure 2 に，アミノ酸の代表的なマ スフラグメントパターンを Figure 3 に示す。前述 のように，pH を酸性側に調整したアミノ酸を用い. −2−.
(3) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Table 1. Summary of the ion-pair reversed-phase LC for underivatized amino acids showing elution order, chemical formula, molecular weight, parent ion, and fragment (m/z) by electrospray ionization mass spectrometry. #1, hydroxyproline is one of the important amino acids in collagen protein. #2, #3, Asparagine (Asn) and glutamine (Gln) will convert to aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), respectively, after hydrolysis. #4, The chromatographic co-elution of leucine and isoleucine may occur on this ion-pair LC separation. However, if the eluent and gradient program was modified with same ion-pair reagent, leucine and isoleucine were separated as shown in Takano et al. (2015) and the supplementary information. In the right-hand column, ‘P’ and ‘NP’ represent protein amino acid and non-protein amino acid, respectively. Elution order. Abbreviation. Glycine Serine Sarcosine Alanine Hydroxyproline β-Alanine Threonine Asparagine N-Ethylglycine Glutamine β-Aminoisobutyric acid Aspartic acid α-Aminoisobutyric acid γ-Aminobutyric acid Proline α-Aminobutyric acid Glutamic acid Isovaline Valine α-Aminoadipic acid Norvaline Lysine Leucine Isoleucine Methionine Histidine Norleucine Arginine Phenylalanine Tyrosine. Molecular weight. Formula. Gly Ser Sar Ala Hyp β-Ala Thr Asn N-Et-gly Gln β-AiBA Asp α-AiBA γ-ABA Pro α-ABA Glu Isoval Val α-AAA Norval Lys Leu Ile Met His Norleu Arg Phe Tyr. C2H5NO2 C3H7NO3 C3H7NO2 C3H7NO2 C5H9NO3 C3H7NO2 C4H9NO3 C4H8N2O3 C4H9NO2 C5H10N2O3 C4H9NO2 C4H7NO4 C4H9NO2 C4H9NO2 C5H9NO2 C4H9NO2 C5H9NO4 C5H11NO2 C5H11NO2 C6H11NO4 C5H11NO2 C6H14N2O2 C6H13NO2 C6H13NO2 C5H11NO2S C6H9N3O2 C6H13NO2 C6H14N4O2 C9H11NO2 C9H11NO3. 75 105 89 89 131 89 119 132 103 146 103 133 103 103 115 103 147 117 117 161 117 146 131 131 149 155 131 174 165 Figure 1181. R2. N. +. HA. R3 Base. Acid. Remarks. 18.6 22.3 23.6 25.2 26.3 26.4 27.0 27.3 28.3 29.3 29.5 29.5 29.6 30.1 30.1 30.4 31.9 34.4 34.8 35.4 35.7 36.6 38.5 38.5 39.0 40.1 40.4 43.1 51.3 53.2. 76 106 90 90 132 90 120 133 104 147 104 134 104 104 116 104 148 118 118 162 118 147 132 132 150 156 132 175 166 182. – 88 – – – 72 102, 74 116, 87 – 130, 101 – 116, 88 – – – – 130, 102 72 72 144, 116 72 130 86 86 133, 104 110 86 – 120 165, 136. P P NP P NP (#1) NP P P (#2) NP P (#3) NP P NP NP P NP P NP P NP NP P P P P P NP P P P. R2. 親イオン（プロトン付加分子イオン）に加え，アミ. R1. N H+. +. A-. R3. ノ酸の官能基部位で開裂した後，H 原子が付加し たプロダクトイオンが生成する。 まず，アミノ酸のマススペクトルには，カルボ. Sample [M + H] +. キシル基（-COOH）の脱離による生成したイオン + + ［M + H - HCOOH］=［M + H - 46］ が見られる分子 種がある（Figure 3-a） 。例えば，バリンのマススペ クトルは，［M + H］= 118 であり，［M + H - 46］ に 対応する m/z 72 がある（Figure 4）。このフラグメ +. O. Acid. Product ions (m/z). +. (b) Negative ion mode (pH > 7). R C OH. Parent ions + [M+H]. た ESI-MS のポジティブモードでは，［M + H］ の. (a) Positive ion mode (pH < 7) R1. Retention time (min). O +. B. R C O-. Base. Sample [M - H] -. +. H B+. Fig. 1. The principles of acid-base theory in solution chemistry for LC / ESI-MS optimization.. +. ントパターンは，アルキル基を有するアミノ酸で あるノルバリン，イソバリン，ロイシン，ノルロ イシン，芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン， チロシン，複素環式アミノ酸であるヒスチジンに −3−.
(4) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. Fig. 2. (1/2) Figure 2. . . . (a) Protein AAs. . Tyr, [M+H]+ = 182 . Phe, [M+H]+ = 166 . Arg, [M+H]+ = 175 . His, [M+H]+ = 156 . Met, [M+H]+ = 150 . Leu, [M+H]+ = 132. . . Lys, [M+H]+ = 147 Val, [M+H]+ = 118. . Asp, [M+H]+ = 134. . Thr, [M+H]+ = 120 Hyp, [M+H]+ = 132. (Phe). . Pro, [M+H]+ = 116. . . Glu, [M+H]+ = 148. Ala, [M+H]+ = 90 Ser, [M+H]+ = 106 Gly, [M+H]+ = 76 . . . . . Time (min). Fig. 2. Extracted ion chromatogram (EIC) of underivatized amino acids on LC / ESI–MS analysis. Abbreviations: Glycine, Gly; Serine, Ser; Alanine, Ala; Threonine, Thr; Aspartic acid, Asp; Proline, Pro; Glutamic acid, Glu; Valine, Val; Lysine, Lys; Leucine, Leu; Isoleucine, Ile; Methionine, Met; Histidine, His; Arginine, Arg; Phenylalanine, Phe; Tyrosine, Tyr; Asparagine, Asn; Glutamine, Gln; Sarcosine, Sar; Hydroxyproline, Hyp; β-Alanine, β-Ala; N-Ethylglycine, N-Et-gly; β-Aminoisobutyric acid, β-AiBA; α-Aminoisobutyric acid, α−AiBA; γ-Aminobutyric acid, γ-ABA; α-Aminobutyric acid, α-ABA; Isovaline, Isoval; α-Aminoadipic acid, α-AAA; Norvaline, Norval; Norleucine, Norleu. A co-injection of threonine and phenylalanine showed the same product ion (m/z 120) at differing retention times. For separation condition, please see Takano et al. (2015).. −4−.
(5) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Fig. 2. (2/2) Figure 2. . . . (b) Non-protein AAs. . Norleu, [M+H]+ = 132 . Norval, [M+H]+ = 118 1. α-AAA, [M+H]+ = 162. . . Isoval, [M+H]+ = 118 α-ABA, [M+H]+ = 104 . γ-ABA, [M+H]+ = 104 . α-AiBA, [M+H]+ = 104 . β-AiBA, [M+H]+ = 104 N-Et-Gly, [M+H]+ = 104 β-Ala, [M+H]+ = 90 Sar, [M+H]+ = 90 . . . . . . . Time (min). (Glu). . . (c) Unhydrolyzed protein AAs. (Asp). Gln, [M+H]+ = 147 Asn, [M+H]+ = 133 . . Time (min). −5−.
(6) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. 共通している。アミノ基を 2 つ有するグルタミン やアスパラギン等にも見られる。 Figure 3. (a) -COOH fragment. 次に，アミノ基（-NH2）の脱離による生成したイ + + オン［M + H - NH3］=［M + H - 17］が見られる分子. [M + H - 46]+. R. 種もある（Figure 3-b）。例えば，リシンのマススペ + + クトルは， ［M + H］= 147 であり， ［M + H - 17］ に 対応する m/z 130 がある（Figure 4） 。このフラグメ. COOH. ントパターンは，アスパラギンやグルタミン，あ. H. るいは，含硫アミノ酸であるメチオニン等にも共. NH2. 通する。 ヒドロキシル基（-OH）の脱離による生成したイ オン［M + H - H2O］=［M + H - 18］が見られる場合も ある（Figure 3-c） 。例えば，セリンのマススペクト +. [M + H]+. ルは， ［M + H］= 106 であり， ［M + H - 18］ に対応 する m/z 88 がある（Figure 4） 。このフラグメントパ +. (b) -NH2 fragment. H2N. +. ターンは，ヒドロキシル基を有するアミノ酸である. [M + H - NH3]+. R'. +. トレオニン，酸性アミノ酸のアスパラギン酸やグル タミン酸，あるいは，α-アミノアジピン酸や β-アラ ニンにも共通する。. COOH. 3.2. 本質量分析の留意点と他の検出器への応用. H. 各アミノ酸の保持時間とマススペクトルを比較. NH2. することにより，アミノ酸の同定を行うことがで き，さらに，濃度既知のスタンダードを用いれば，. [M + H]+. 定量を行うことができる。ここで挙げているプロダ クトイオンは，前述の質量分析計の条件で行った. (c) -OH fragment. ものであり，例えば，イオン化の設定条件を変え. [M + H - H2. H R". ることにより，フラグメントパターンにも多少の 変化が現れることがある。前述 3.1. のような主要. O]+. イオンの他，例えば，グルタミン酸では， ［M + H HCOOH - H2O］+ が生じ，グルタミンでは， ［M + H. OH. - HCOOH - NH3］+ が生じる。. COOH. + トレオニン（ ［M + H］= 120）とフェニルアラニ + ン（ ［M + H］= 166）を共打ちすると，フェニルア. NH2. ラニンのカルボキシル基由来のフラグメント化 + により（ ［M + H- 46］= 120） ，同じイオンクロマト グラム（EIC, m/z 120）上にシグナルが検出される. [M + H]+ Fig. 3. Representative fragmentation patters for diagnosis ion of underivatized amino acids showing, parent ion [M + H]+ with (a) –COOH fragment (-HCOOH), (b) –NH2 fragment (-NH3), and (c) –OH fragment (-H2O).. （Figure 2） 。質量数が同一で保持時間が近いアミノ 酸分子が含まれる試料の場合，後述の 2 次元分析 によるクロスチェックが重要である。タンパク性 および非タンパク性アミノ酸の溶出順序，略記， 化学式，分子量，プロダクトイオンを Table 1 にま とめた。ここで用いているノナフルオロ吉草酸の. −6−.
(7) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Fig. 4. (a) (1/5). (a) Protein AAs . Figure 4 Gly, [M+H]+ = 76. O H2N. CH C. OH. H. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. Chemical Formula: C2H5NO2 Exact Mass: 75.03 Molecular Weight: 75.07. Ser, [M+H]+ = 106 O H2N. OH. 100. 120. 140. 160. 180. 200. Ala, [M+H]+ = 90. O H2N. CH C. OH. CH3. 100. 120. 140. 160. 180. Chemical Formula: C3H7NO2 Exact Mass: 89.05 Molecular Weight: 89.09. 200. . 80. Chemical Formula: C3H7NO3 Exact Mass: 105.04 Molecular Weight: 105.09. OH. . 80. CH C CH2. . [M+H-H2. O]+. Thr, [M+H]+ = 120 O. [M+H-46]+. H2N. . . [M+H-H2. 80. 100. O]+. CH C CH OH. OH. Chemical Formula: C4H9NO3 Exact Mass: 119.06 Molecular Weight: 119.12. CH3. 120. 140. 160. 180. 200. m/z Fig. 4. (a) Underivatized protein amino acids and (b) non-protein amino acids for the identification. Observed product ions and their fragmentation patterns by ESI–MS were shown. The chemical formula, exact mass, molecular weight, and theoretical values of their corresponding masses (m/z) are also shown.. −7−.
(8) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. Fig. 4. (a) (2/5). . Figure 4. H2N. [M+H-H2O]+. C. . . . . CH C. OH. CH2. [M+H-46]+. 100. O. Chemical Formula: C4H7NO4 Exact Mass: 133.04 Molecular Weight: 133.10. OH. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. Asp, [M+H]+ = 134. O. Pro, [M+H]+ = 116 O C. OH. Chemical Formula: C5H9NO2 Exact Mass: 115.06 Molecular Weight: 115.13. HN. 100. 120. 140. 160. 180. [M+H-46]+. H2N. OH Chemical Formula: C5H9NO4 Exact Mass: 147.05 Molecular Weight: 147.13. CH2. . . . CH C CH2. [M+H-H2O]+. C. O. OH 120. 140. 160. 180. 200. . . 100. Glu, [M+H]+ = 148. O. [M+H-H2O -46]+. 80. 200. . 80. Val, [M+H]+ = 118. [M+H-46]+. O H2N. CH C. OH. CH CH3 CH3. 80. 100. 120. 140. 160. 180. m/z. −8−. 200. Chemical Formula: C5H11NO2 Exact Mass: 117.08 Molecular Weight: 117.15.
(9) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Fig. 4. (a) (3/5) Figure 4 . O H2N. CH C. OH. CH2. [M+H-NH3]+. Chemical Formula: C6H14N2O2 Exact Mass: 146.11 Molecular Weight: 146.19. CH2 CH2. . . Lys, [M+H]+ = 147. CH2 NH2. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. Leu, [M+H]+ = 132 O H2N. [M+H-46]+. CH C. OH. Chemical Formula: C6H13NO2 Exact Mass: 131.09 Molecular Weight: 131.17. . CH2 CH CH3 CH3. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. O NH2 CH C. [M+H-NH3]+. OH. . CH2. Chemical Formula: C5H11NO2S Exact Mass: 149.05 Molecular Weight: 149.21. CH2 S CH3. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. . . [M+H-46]+. Met, [M+H]+ = 150. His, [M+H]+ = 156. O. [M+H-46]+. H2N. CH C. . CH2 N NH 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. m/z. −9−. OH Chemical Formula: C6H9N3O2 Exact Mass: 155.07 Molecular Weight: 155.15.
(10) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. Fig. 4. (a) (4/5) Figure 4. O . H2N. CH C. OH. CH2 CH2. Arg, [M+H]+ = 175 Chemical Formula: C6H14N4O2 Exact Mass: 174.11 Molecular Weight: 174.20. CH2 NH NH. C NH2 100. 120. 140. 160 . 80. 180. 200. O H2N. CH C. [M+H-46]+. Phe, [M+H]+ = 166. OH. CH2 . Chemical Formula: C9H11NO2 Exact Mass: 165.08 Molecular Weight: 165.19. 100. 120. 140. 160. 180 . 80. 100. O H2N. CH C. OH. Tyr, [M+H]+ = 182. CH2. [M+H-NH3]+ . Chemical Formula: C9H11NO3 Exact Mass: 181.07 Molecular Weight: 181.19. OH. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. . . [M+H-46]+. 200. Hyp, [M+H]+ = 132 O C. OH. Chemical Formula: C5H9NO3 Exact Mass: 131.06 Molecular Weight: 131.13. HN OH. 80. 100. 120. 140. 160. 180. m/z. −10−. 200.
(11) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Fig. 4. (a) (5/5) . Figure 4 Asn, [M+H]+ = 133 O H2N. [M+H-46]+. C. . 140. 160. 180. 200. H2N. CH2 C. . . CH C. OH. CH2. [M+H-46]+. 100. Gln, [M+H]+ = 147. O. [M+H-46 -NH3]+. 80. O. . 120. [M+H-NH3]+. Chemical Formula: C4H8N2O3 Exact Mass: 132.05 Molecular Weight: 132.12 m/z: 132.05 (100.0%), 133.06 (4.5%). NH2. . . . 100. OH. CH2. [M+H-NH3]+. 80. CH C. O. Chemical Formula: C5H10N2O3 Exact Mass: 146.07 Molecular Weight: 146.14 m/z: 146.07 (100.0%), 147.07 (6.3%). NH2 120. 140. 160. 180. 200. m/z. 分子量は，264.05 であり，Table 1 に示すアミノ酸. 析確度保証にも有効である。Hamase et al.（2014）. 分子のマススペクトルに干渉しない。. では，非タンパク性アミノ酸を含む網羅的な立体 異性体比（D / L 比）の正確な記載を報告している。. アミノ酸の同定について十分な確認が行われて いる場合，質量分析計の代わりにコロナ荷電化粒 子検出器（Corona CAD, Charged Aerosol Detector） や蒸発光散乱検出器（Evaporative Light Scattering Detector, ELSD）による検出を行うことが可能であ る。Corona CAD（Appendix: Thermo Fisher Scientific Inc.）は，定量性に優れ，日常のメンテナンスが質 量分析計よりも比較的容易であることから，質量 分析法やフォトダイオードアレイ検出法の補完的 な検出装置として有効と考えられる。. また，アミノ酸に揮発性を持たせるために，適切 な誘導体化（例えば，N- ピバロイルイソプロピル 化 ; 力石ら，2009；エトキシカルボニル - エチル エステル化；山口ら，2009）およびガスクロマト グラフィーによる分離（例えば，Chikaraishi et al., 2010）を経て，包括的 LC x GC，あるいは，マル チハートカット LC-GC へと応用することも可能と なる。すなわち，試料由来の網羅的なアミノ酸組 成（例えば，Chikaraishi et al., 2009）から，任意の 分子レベルで，より高分解能なターゲット分析へ 進めることを意味する。. 4. 今後の展望 4.1. 二次元クロマトグラフィーへの応用. 4.2. アミノ酸分子レベル同位体研究への展望. 有機分子を 1 次元 LC で分離し，必要性に応じて 2 次元目のクロマトグラフィーへの展開することが. 行っていない。著者らは，アミノ酸のアミノ基由. 可能である。2 次元クロマトグラフィーへのアプ. 来の窒素について，前処理と分離の際に同位体分. ローチは，非タンパク性アミノ酸とタンパク性アミ. 別が無い分析条件の最適化を行ってきた（例えば， Chikaraishi et al., 2010; Takano et al., 2010, 2015） 。こ. ノ酸が混在している特殊な試料を測定する際の分. 本稿で述べたアミノ酸の分離は，誘導体化を. −11−.
(12) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. Fig. 4. (b) (1/3). (b) Non-protein AAs . Figure 4 Sar, [M+H]+ = 90. O H3C NH CH2. 100. 120. 140. 160. 180. OH. 200. . 80. C. Chemical Formula: C3H7NO2 Exact Mass: 89.05 Molecular Weight: 89.09. β-Ala, [M+H]+ = 90 O H2N. CH2. CH2. C. OH. Chemical Formula: C3H7NO2 Exact Mass: 89.05 Molecular Weight: 89.09. . [M+H-H2O]+. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. N-Et-Gly, [M+H]+ = 104. O C2H5. 100. 120. 140. 160. 180. C. OH. 200. . 80. NH CH2. β-AiBA, [M+H]+ = 104 O H2N H2C. CH C CH3. 80. 100. Chemical Formula: C4H9NO2 Exact Mass: 103.06 Molecular Weight: 103.12. 120. 140. 160. 180. OH. Chemical Formula: C4H9NO2 Exact Mass: 103.06 Molecular Weight: 103.12. 200. Fig. 4. (a) Underivatized protein amino acids and (b) non-protein amino acids for the identification. Observed product ions and their fragmentation patterns by ESI–MS were shown. The chemical formula, exact mass, molecular weight, and theoretical values of their corresponding masses (m/z) are also shown.. −12−.
(13) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Fig. 4. (b) (2/3) . Figure 4 α-AiBA, [M+H]+ = 104 CH3 O H2N. C. C. Chemical Formula: C4H9NO2 Exact Mass: 103.06 Molecular Weight: 103.12. OH. CH3. 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. γ-ABA, [M+H]+ = 104. O H2N. 100. 120. 140. CH2. CH2. 160. C. OH. 180. 200. . 80. H2C. Chemical Formula: C4H9NO2 Exact Mass: 103.06 Molecular Weight: 103.12. α-ABA, [M+H]+ = 104 O H2N. CH C CH2. OH. Chemical Formula: C4H9NO2 Exact Mass: 103.06 Molecular Weight: 103.12. CH3. 100. [M+H-46]+. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. Isoval, [M+H]+ = 118. . CH3 O H2N. C. C. OH. CH2 CH3. 80. 100. 120. 140. 160. 180. . −13−. 200. Chemical Formula: C5H11NO2 Exact Mass: 117.08 Molecular Weight: 117.15.
(14) 高野 淑識・力石 嘉人・大河内 直彦. Fig. 4. (b) (3/3). Figure 4 . O H2N. . . . CH2 O. C OH. 120. 140. 160. 180. 200. . [M+H-46]+. α-AAA, [M+H]+ = 162 Chemical Formula: C6H11NO4 Exact Mass: 161.07 Molecular Weight: 161.16. CH2. [M+H-H2O]+. 100. OH. CH2. [M+H-46]+. 80. CH C. Norval, [M+H]+ = 118. . O H2N. CH C. OH Chemical Formula: C5H11NO2 Exact Mass: 117.08 Molecular Weight: 117.15. CH2 CH2 CH3 100. 120. 140. 160. 180. 200. . 80. Norleu, [M+H]+ = 132. [M+H-46]+. O H2N. . CH C CH2 CH2 CH2. OH Chemical Formula: C6H13NO2 Exact Mass: 131.09 Molecular Weight: 131.17. CH3 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. m/z のことは，マトリックス効果を効率的に除去する. 謝 辞. ことでアミノ酸分子レベルあるいは立体異性体分 子レベル（Takano et al., 2009; Ohkouchi and Takano,. 本研究を進めるにあたり，エムエス機器株式会. 2014）での窒素同位体比の挙動を高精度かつ高確. 社の海宝 弘行 様からは，技術的な助言を頂いた。. 度で記載できることを意味する。ここで示した. 山本修一教授（創価大学）と一名の匿名査読者に. 既報では，アミノ酸の炭素同位体比の検証（例え ば，Chikaraishi and Ohkouchi, 2010）については触. は，本稿の査読を行って頂き，有益なコメントを頂. れていないが，分離条件と精製法の最適化を行う ことにより，極微量スケール（例えば，Ogawa et al., 2010）での炭素同位体比（δ C）の動態を含め， 13. アミノ酸分子レベル放射性炭素年代測定（例えば， Itahashi et al., 2014）への展開に道が開かれる。. いた。本研究の一部は，文部科学省（MEXT）の科 学研究費補助金・新学術領域研究（No. 25108006; Y.T.）および科学技術振興機構（JST）の戦略的創 造研究推進事業（CREST; N.O., Y.C.）によって行わ れた。. −14−.
(15) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法 （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Anal. Chem. 45, 2092-2100.. 引用文献. Gloor R. and Johnson E.L. (1977) Practical aspects of reverse phase ion pair chromatography. J.. Antignac J.-P., de Wasch K., Monteau F., De Brabander. Chromatogr. Sci. 15, 413-423.. H., Andre F. and Le Bizec B. (2005) The ion suppression phenomenon in liquid chromatography–. Hamase K., Nakauchi Y., Miyoshi Y., Koga R., Kusano. mass spectrometry and its consequences in the field. N., Onigahara H., Naraoka H., Mita H., Kadota Y. and. of residue analysis. Anal. Chim. Acta 529, 129-136.. Nishio Y. (2014) Enantioselective determination of. Arpino P. J. and Guiochon G. (1979) LC / MS coupling.. extraterrestrial amino acids using a two-dimensional. Anal. Chem. 51, 682-701.. chiral high-performance liquid chromatographic system. Chromatogr. 35, 103-110.. Cecchi T. (2008) Ion pairing chromatography. Critical Rev. Anal. Chem. 38, 161-213.. Itahashi Y., Takano Y., Ogawa O. N., Ohkouchi N. and. Chaimbault P., Petritis K., Elfakir C. and Dreux. Yoneda M. (2014) Radiocarbon dating of single. M. (2000) Ion-pair chromatography on a porous. amino acid in archaeological bone specimens.. graphitic carbon stationary phase for the analysis. Anthropological Sci., 122, 190.. of twenty underivatized protein amino acids. J.. Kaneko M., Takano Y., Chikaraishi Y., Ogawa N.O.,. Chromatogr. A 870, 245-254.. Asakawa S., Watanabe K., Shima S., Krueger. Chikaraishi Y., Ogawa O.N., Kashiyama Y., Takano. M., Matsushita M., Kimura H. and Ohkouchi N.. Y., Suga H., Tomitani A., Miyashita H., Kitazato H.. (2014) Quantitative analysis of coenzyme F430 in. and Ohkouchi, N. (2009) Determination of aquatic. environmental samples: a new diagnostic tool for. food-web structure based on compound-specific. methanogenesis and anaerobic methane oxidation.. nitrogen isotopic composition of amino acids.. Anal. Chem. 86, 3633-3638.. Limnol. Oceanogr.: Methods 7, 740-750.. Knox J.H. and Hartwick R.A. (1981) Mechanism of. Chikaraishi Y. Takano Y., Ogawa N.O. and Ohkouchi N.. ion-pair liquid chromatography of amines, neutrals,. (2010) Instrumental optimization for compound-spe-. zwitterions and acids using anionic hetaerons. J.. cific nitrogen isotope analysis of amino acids by gas. Chromatogr. A. 204, 3-21.. chromatography / combustion / isotope. mass. Mallet C.R., Lu Z. and Mazzeo J.R. (2004) A study of. spectrometry. Earth, Life, and Isotopes (Edited by. ratio. ion suppression effects in electrospray ionization. Ohkouchi N., Tayasu I. and Koba K.), Kyoto Univ. from mobile phase additives and solid‐phase extracts.. Press, pp. 367-386. Chikaraishi Y. and Ohkouchi N. (2010) An improved method for precise determination of carbon isotopic composition of amino acids. Earth, Life, and Isotopes (Edited by Ohkouchi N., Tayasu I. and Koba K.),. Rapid Comm. Mass Spectrom. 18, 49-58. 中村 洋（2014）LC / MS, LC / MS / MS の基礎と応用 （日本分析化学会 編） ，オーム社，pp.1-278. 大河内直彦（2010）高速液体クロマトグラフィー. 地球化学講座 第 8 巻 ｢地球化学実験法｣（田中 剛・吉田尚弘 共編） ，培風館，pp. 153-157.. Kyoto Univ Press, pp. 355-366. 力石嘉人，高野淑識，大河内直彦（2009）アミノ. Ohkouchi. N.. and Takano Y.. (2014). Organic. 酸（N-ピバロイル-イソプロピルエステル誘導体） の GC / MS による解析． Res. Org. Geochem. 25,. nitrogen: sources, fates, and chemistry. Treatise on. 61-70.. (Edited by Birrer, B., Falkowski, P., Freeman, K.),. Geochemistry, Vol. 12, 10: Organic Geochemistry. Covey T.R., Lee E.D., Bruins A.P. and Henion J.D. (1986) Liquid chromatography / mass spectrometry.. Elsevier, pp. 251-289. Ogawa O.N., Nagata T., Kitazato H. and Ohkouchi N.. Anal. Chem. 58, 1451A-1461A.. (2009) Ultra sensitive elemental analyzer / isotope. Eksborg S. and Schill G. (1973) Ion pair partition. ratio mass spectrometer for stable nitrogen and. chromatography of organic ammonium compounds.. carbon isotope analyses. Earth, Life, and Isotopes. −15−.
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(17) イオンペアクロマトグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法Appendix （LC/ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析. Nebulizer (gas shown in red) Electrospray ions. Solvent spray. . . . MS. Neutral Molecules Clusters Salts. appendix. 1. Illustration of typical electrospray source (ESI).. Illustration of typical electrospray source (ESI). . (i) Corona CAD Phe Tyr. Intensity (CAD). Arg. Appendix. Intensity (DAD). (ii) UV 260 nm. (iii) multi-absorbance 320. Wavelength (nm). 310 300 290 280 270 260 250 240. Time (min) Comparison of responses determined by other online detectors for corona appendix. 2. Comparison of responses determined by other online detectors for corona CAD (Thermo Fisher Scientific Inc.) and the diode array detector (DAD) with the UV absorbance. Modified after Takano al. (2015) CAD (Thermo Fisher Scientific Inc.) etand the diode array detector (DAD) with the UV absorbance. Modified after Takano et al. (2015). −17−.
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