〔
Jpn.J.Hosp.Pharm. 一 般 論 文 26(6) 601-611 (2000〕
VinorelbineのHPLCに
よ る 定 量 法 と ラ ッ ト血 漿 中 薬 物 動 態 研 究 へ の 応 用
西 田 靖 子*,菊
池 一 夫,大 石 孝 義,増 池 健 年,大
森健 守
協和 発酵工業株式会社医薬総合研 究所 分析 センター†
High-Performance
Liquid
Chromatographic
Determination
of Vinorelbine
and its Application
to Pharmacokinetic
Study in Rat Plasma
YASUKO NISHIDA*, KAZUO KIKUCHI, TAKAYOSHI OHISHI, TAKETOSHI MASUIKE and KENJI OHMORI
Analytical Research Center, Pharmaceutical Research Institute, Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.t
Received August 15, 2000 Accepted September 28, 2000
In order to study the pharmacokinetics of vinorelbine and provide information necessary to de-termine the optimal therapy, a specific and reliable method to determine the levels of vinorelbine in biological fluids is required. We, therefore, established a highly sensitive and specific assay method for vinorelbine in biological fluids using reverse phase HPLC. The vinorelbine level was determined using HPLC with UV detection at 268 nm, combined with liquid-liquid extraction using diethyl ether for sample clean-up. The HPLC system used an ODS column and a mobile
phase of 48 vol% methanol containing 0.05 vol% trifluoroacetic acid. The absence of endoge-nous interference and the excellent chromatographic behavior of vinorelbine provides accurate re-sults even at low concentrations. The limit of determination is 2 ng/mL (100 ,ƒÊl_, sample), and the range of the assay is from 2 to 200 ng/mL. Consequently, this method is thus suggested to be highly sensitive and specific for determining the vinorelbine levels in biological fluids. Using this method, we measured the plasma concentrations of vinorelbine after a single intravenous ad-ministration of vinorelbine at 1.2 mg/kg in male rats. The plasma concentration ofvinorelbine disappeared triphasically after the intravenous administration of the drug.
Based on these findings,this method is considered to be useful for drug monitoring of clinical specimens and also for basic studies, using small animals.
Key words-vinorelbine, determination, HPLC, pharmacokinetics
緒
言
酒 石 酸vinorelbine(以 下,VNRと 略す)はPot-ierら に よ り キ ョウ チ ク トウ科 の ニ チ ニ チ ソ ウ の
抽 出 物 で あ る ビ ンカ ア ル カ ロ イ ドか ら半 合 成 され
た抗 悪 性 腫 瘍 薬 で あ る1).本 薬 は他 の ビ ン カ ア ル
カ ロ イ ドと異 な っ た 抗腫 瘍 スペ ク トラム を有 し,
か つ 神 経 毒 性 が弱 い とい う特 徴 を有 して い る.す
で に,フ ラ ンス を は じめ 各 国 で 優 れ た臨 床 成 績 が
静 岡 県 駿 東 郡 長 泉 町 下 土 狩1188;1188,Shimoto- gari,Nagaizumi-cho,Sunto-gun,Shizuoka,411-8731 Japan報 告 さ れ2-6),非 小 細 胞 肺 癌,乳 癌 を 適 応 症 と し て 多 く の 国 で 上 市 さ れ て お り,本 邦 に お い て も 1999年 に 非 小 細 胞 肺 癌 を 適 応 疾 患 と して 上 市 さ れ た.血 漿 中 のVNR濃 度 を モ ニ タ リ ン グ す る 方 法 と し て は,高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(HPLC) 法 と ラ ジ オ イ ム ノ ア ッ セ イ(RIA)法 が 用 い ら れ て き た.し か し,従 来 のHPLC法 に よ る 定 量 法 に は,① 血 漿 中 成 分 と の 分 離 が 不 十 分,② 定 量 下 限1-2.5ng/mLを 得 る の に 試 料0.5-2mL必 要,③ ヘ プ タ ン ス ル ホ ン酸 ナ ト リ ウ ム,ド デ シ ル ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 等 の イ オ ン ペ ア 剤 を 用 い た 分 析 で は,カ ラ ム の 寿 命 が 短 く な る 等 の さ ま ざ ま な 問 題 が あ っ た7-10).さ ら に,ヒ ト にVNR20mg/ m2投 与,72時 間 後 の 血 漿 中 濃 度 は お よ そ2ng/ mLで あ り11),TDM(Therapeutic DmgMonitoring) を 考 慮 す る と,少 量 の 試 料 を 用 い た 分 析 で2ng/ mL程 度 の 定 量 下 限 を 得 る こ と が 必 要 と 考 え ら れ た.一 方,RIA法 に よ る 測 定 法 で は,低 い 定 量 下 限(0.1ng/mL)を 得 る が,そ の 測 定 法 は 未 変 化 体 の み の 測 定 で は な くVNRの 代 謝 物 等 も 同 時 に 測 定 す る 可 能 性 が あ り,特 異 性 が 低 い と い う 問 題 が あ っ た10,12,13). そ こ で 今 回,試 料 の 前 処 理 工 程 を 改 良 す る こ と を 試 み,さ ら に,こ れ ま で の イ オ ン ペ ア 剤 の 代 わ り に 強 力 な イ オ ン ペ ア を形 成 す る こ と が 知 ら れ て い るtrifluoroacetic acid (TFA)を 用 い る こ と に よ り,特 異 性 を 改 善 し,試 料100μLで2ng/mLと い う定 量 下 限 が 得 ら れ るVNR定 量 法 を 確 立 し た の で 報 告 す る. ま た,今 回 確 立 し たHPLCに よ るVNR定 量 法 を 用 い,ラ ッ トにVNRを1.2mg/kg静 脈 内 投 与 後 の 血 漿 中VNR濃 度 を 測 定 し,薬 物 速 度 論 的 解 析 を 行 っ た の で そ の 成 績 を 併 せ て 報 告 す る.
方
法
1.使 用 薬 物 VNRは ナ ベ ル ビ ン(R)注10(協 和 発 酵 工 業(株)) を 使 用 し た(Fig.1).定 量 時 に 用 い た 内 標 準 物 質(rS.)で あ るvinblastineは エ ク ザ ー ル(R)(塩 野Fig. 1. Chemical Structure of Vinorelbine
義 製 薬(株))を 使 用 し た.VNRの 分 析 時 に お け る 妨 害 ピ ー ク に な る か 否 か を 確 認 す る た め, vNRの 代 謝 物 で あ るvNR-N-oxideお よ び17-deaCetyl-VNRは 協 和 発 酵 工 業 医 薬 総 合 研 究 所 に お い て 合 成 し た も の を 用 い た.臨 床 で 併 用 さ れ る vincristineは オ ン コ ビ ン(R)(塩野 義 製 薬(株))を 用 い,同 様 に5-fluorouracil(協 和 発 酵 工 業(株)), Cyclophosphamide(和 光 純 薬 工 業(株)),doxoru-biCin(フ ァ ル マ シ ア ・ア ッ プ ジ ョ ン(株)),mitomy-cin C(協 和 発 酵 工 業(株)),cisplatin(SIGMA), paClitaxel (SIGMA)を 使 用 し た.試 料 の 前 処 理 に 用 い た ジ エ チ ル エ ー テ ル は 油 脂 酸 価.過 酸 化 物 価 測 定 用(和 光 純 薬 工 業(株))を 用 い,HPLC の 移 動 相 に 用 い た メ タ ノ ー ル はHPLC用(関 東 化 学)を 使 用 し た.水 は 精 製 水 をMilli-Q system (日 本 ミ リ ポ ア)で 処 理 し た も の を 使 用 し た.そ の 他 の 試 薬 は 特 に 記 さ な い か ぎ りす べ て 市 販 の 特 級 品 を 用 い た. 2.標 準 希 釈 溶 液 の 調 製 検 量 線 作 成 用 と し てVNRは,ナ ベ ル ビ ン(R)注 10を メ タ ノ ー ル で 希 釈 し て1mg/mLの 標 準 溶 液 を 調 製 し た.さ ら に,順 次0.05vol%TFA含 有20 vol%メ タ ノ ー ル 混 液 で 希 釈 し,4,10,20,50, 100,200お よ び400ng/mL標 準 希 釈 溶 液 を 調 製 し た.I.S.と し て 用 い たvinblastineは エ ク ザ ー ル(R) を メ タ ノ ー ル で 溶 解 し て1mg/mLの 標 準 溶 液 を 調 製 し,さ ら に0.05vol%TFA含 有20vol%メ タ ノ ー ル 混 液 で 希 釈 して1μg/mLに 調 製 し た.
各 標 準 希 釈 溶 液 は ポ リ エ チ レ ン製 チ ュ ー ブ (Nuncミ ニ ソ ー プTMチ ュ ー ブ;12mL容 〉 に 分 注 し,遮 光 し て 冷 室(設 定 温 度:1∼6℃)で 保 存 し た. 3.試 薬 の 調 製 前 処 理 に 用 い た1 mol/L glycine・NaCl・NaOH 緩 衝 液(pH10)は,glycineお よ びNaClを1mol/L に な る よ う に 混 合 し 溶 解 後,1mol/LNaOHで pH10に 調 整 し た.HPLCに 用 い た 移 動 相 は48vol %メ タ ノ ー ル に0.05vol%TFAを 含 有 す る 混 液 を 調 製 し,脱 気 し て 使 用 し た. VNRの2種 の 代 謝 物 お よ び 臨 床 でVNRと 併 用 さ れ る7薬 物 は,メ タ ノ ー ル に 溶 解 し,1mg/ mLに 調 製 し た.さ ら に,0。05vol%TFA含 有20 vol%メ タ ノ ー ル 混 液 で 希 釈 し,2μg/mLの 溶 液 と し た. 4.コ ン トロ ー ル ヒ ト血 清 お よ び ラ ッ ト血 漿 の 採 取 検 量 線 お よ び 試 料 の 希 釈 に 用 い た コ ン トロ ー ル 血 清 は,市 販 正 常 ヒ ト血 清(コ ス モ バ イ オ)を 用 い た.ま た,特 異 性 の 検 討 等 に 用 い た 血 清 お よ び 血 漿 は あ ら か じ めinformedconsentを 得 た 健 常 人 ボ ラ ン テ ィ ア か ら採 取 し た.採 取 し た 血 液 は2分 割 し,一 方 は 室 温 下 に 放 置 後 遠 心 分 離(2100× g,10min,4℃)し て 血 清 を 得 た.他 方 は 血 液 約5mLに 対 し て ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 注 射 液(日 本 薬 局 方 品,10001.U./mL,清 水 製 薬(株))100 μLを 加 え 緩 や か に 撹 拌 後,た だ ち に 遠 心 分 離 (2100×g,10min,4℃)し て 血 漿 を 得 た.得 ら れ た 血 清 お よ び 血 漿 は 分 析 ま で 凍 結 保 存(設 定 温 度:-30℃)し た. ラ ッ ト血 漿 はWistar系 雄 性 ラ ッ ト(7週 齢, 日本 チ ャ ー ル ス.リ バ ー)の 右 大 腿 部 動 脈 お よ び 静 脈 よ り 放 血 し,ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 注 射 液100 μLを 添 加 し て 採 取 し た 血 液 を 遠 心 分 離 し て 得 た.得 ら れ た 血 漿 は 分 析 ま で 凍 結 保 存(設 定 温 度:-30℃)し た. 5.試 料 の 前 処 理 法 前 処 理 はFig.2に 示 し た 方 法 で 行 っ た.血 清 ま た は 血 漿100μLをNuncミ ニ ソ ー プTMチ ュ ー ブ (4mL容)に 入 れ,I.S.1μg/mLを50μL,1mol/L glycine・NaCl・NaOH緩 衝 液(pH10)を200μL を 添 加 し た.さ ら に ジ エ チ ル エ ー テ ル1.5mLを 加 え,30秒 間 撹 拌 し,遠 心 分 離(2330×g,5 min)し た 後,有 機 層 を 分 取 し た.同 様 に 抽 出 操 作 を2回 行 い 有 機 層 を 合 わ せ た.有 機 層 に0.1 mol/L HCI 500μLを 添 加 し30秒 間 撹 拌 し 遠 心 分 離 後,有 機 層 を 吸 引 除 去 し た.水 層 に1mol/L glycine・NaCl・NaOH緩 衝 液(pH10)を200μL 添 加 し,さ ら に ジ エ チ ル エ ー テ ル1.5mLで 上 記 と 同 様 に 抽 出 を2回 く り返 し た.分 取 し た 有 機 層 に0.05vol%TFA水 溶 液100μLを 添 加 し30秒 間 撹 拌 し遠 心 分 離 後,有 機 層 を 吸 引 除 去 し た.窒 素 気 流 下 に て 水 層 に 含 ま れ る ジ エ チ ル エ ー テ ル を 除 去 し,水 層 に メ タ ノ ー ル25μLを 添 加 しHPLC測 定 試 料 と し た.HPLC測 定 試 料 は 分 析 時 ま で オ ー トサ ン プ ラ ー 中(10±5℃)で 保 存 し,HPLCに 100μL注 入 し た. 6.HPLC装 置 お よ び 分 析 条 件 前 処 理 し た 血 清 お よ び 血 漿 の 試 料 溶 液 はHPLC に よ り 分 析 し た 。 装 置 は,日 立 製 作 所 のD-7000 シ リ ー ズ(イ ン タ ー フ ェ イ ス;L-70001F,ポ ン プ;L-7100,検 出 器;L―7400,カ ラ ム オ ー ブ ン; L-7300,オ ー トサ ン プ ラ ー;L-7200)を 使 用 し, 分 析 カ ラ ム に はTSKgel Super-ODS(4.6mm I.D. ×100mm,2μm;TOSOH)を 使 用 し た.分 析 条 件 と し て,カ ラ ム 温 度;25℃,移 動 相;0.05vol %TFA含 有48vol%メ タ ノ ー ル 混 液,流 速;0.5 mL/min,測 定 波 長;268nmに 設 定 し た. 7.特 異 性 の 検 討 健 常 成 人6名 の 血 清 お よ び 血 漿,ま た は,ラ ッ ト血 漿 の そ れ ぞ れ100μLにI.S.の 代 わ り に0.05 vol%TFA含 有20vol%メ タ ノ ー ル 混 液50μLを 添 加 し5.項 と 同 様 に 処 理 しHPLC分 析 に 供 し た. ま た,vNRの 代 謝 物 で あ るvNR-N-oxideお よ び17-deacetyl-VNR,な ら び に 抗 悪 性 腫 瘍 薬vin-cristine,mitomycinC,cisplatin,cyclophosphcide, doxombicin,paclitaxelお よ び5-forouracilに つ い
Fig. 2. Flow Diagram for Sample Preparation from Serum or Plasma Containing Vinorelbine
て,VNRの 分 析 時 に お け る 妨 害 ピ ー ク を 生 じ る か 否 か を 検 討 し た. 8.検 量 線 の 作 成 HPLCに よ る 定 量 時 の 検 量 線 の 作 成 は,血 清 あ る い は 血 漿100μLにVNRの 標 準 希 釈 溶 液 を そ れ ぞ れ50μL添 加 し,2,5,10,25,50,100, 200ng/mL血 清 あ る い は 血 漿 に 調 製 し た 試 料(n =1)を5 .項 と 同 様 に 処 理 しHPLC分 析 を 行 っ た.添 加 濃 度 とI.S.の ピ ー ク 面 積 に 対 す るVNR
の ピ ー ク面 積 の 比(LS.ratio)よ
り,重 み 付 き線
形 最 小 二 乗 法(重 み;1/y2)に
よ り得 られ た 直
線 を検 量 線 と した.
9.同
時 お よ び 日差 再 現性
同 時 再 現 性 は,血 清 お よ び 血 漿 にVNR標
準 希
釈 溶 液 を 添 加 し2,50お
よ び200ng/mLと
な る よ
うに調 製 した 試 料100μLを5.項
と同 様 に処 理 し
てHPLC分
析 し た.日 差 再 現 性 に つ い て は,同
時 再 現 性 と 同様 に行 い,こ れ を2日 間 く り返 して
検 討 した.
10.安 定 性 の 検 討
1)凍
結 融 解 安 定 性
ヒ ト血 清 お よび ラ ッ ト血 漿 にVNR標
準 希 釈 溶
液 を添 加 し,5お
よ び50ng/mLと
な る よ う に 調
製 した試 料(n=3)を3回
まで凍 結 融 解(-30℃/
室 温)を
く り返 し5.項 と 同 様 に処 理 してHPLC
分 析 し た.VNRの
凍 結 融 解 時 の 安 定 性 は,凍 結
前 の 濃 度 の 平 均 値 に対 す る凍 結 融 解 後 の 濃 度 の 平
均 値 よ り残 存 率 を算 出 し検 討 した.
2)短
時 間 室 温 安 定 性
1)項
と同様 に調 製 した試 料(5お よび50ng/mL,
(n=3))100μLを1時
間 放 置 後,5.項
と 同 様
に処 理 しHPLC分
析 した.VNRの
室 温 下 で の 安
定 性 は,放 置 前(調 製 直 後)の 濃 度 の平 均値 に 対
す る放 置 後 の 濃 度 の 平 均 値 よ り残 存 率 を算 出 し検
討 した.
3)オ
ー トサ ン プ ラ ー保 存 安 定 性
1)項
と同 様 に調 製 した試 料(5お よび50ng/mL,
(n=1))100μLを
用 い て5.項
と 同 様 に 処 理 し
たHPLC測
定 試 料 を オ ー トサ ン プ ラ ー 中(10±
5℃)で36時
間 放 置 後,HPLC分
析 し た.分 析 試
料 中VNRお
よびI.S.の オ ー トサ ン プ ラ ー 内 の 安
定 性 は,測 定 開 始 時 間 の ク ロ マ トグ ラム の 面 積 あ
る い はVNRの
濃 度 に 対 す る36時 間 放 置 後 の ク ロ
マ トグ ラム の 面 積 あ るい はVNRの
濃 度 よ り残 存
率 を算 出 し検 討 した.
4) 標 準 希 釈 溶 液 安 定 性
VNRの10お
よび100ng/mL,vinblastine 1μg/mL
の 標 準 希 釈 溶 液 を 遮 光 下 冷 室(設
定 温 度:1∼
6℃)で
保 存 し,保 存 後1,2,3お
よび4週 間
目 に 保 存 溶 液 を そ れ ぞ れ100μL注
入 してHPLC
分 析 し た.標 準 希 釈 溶 液 中 のVNRお
よ
びvin-blastineの安 定 性 は,調 製 直 後 の ク ロ マ トグ ラ ム
の 面 積 に対 す る各 時 間 の ク ロマ'トグ ラム の 面 積 よ
り残 存 率 を算 出 し検 討 した.
5) 凍 結 保 存 安 定 性
1)項 と同様 に 調 製 した試 料(5お
よび50ng/mL,
(n=3))100μLを
凍 結(-30℃)保
存 後,5.項
と 同 様 に 処 理 しHPLC分 析 し た.VNRの 凍 結 保 存 で の 安 定 性 は,凍 結 前 の 濃 度 の 平 均 値 に 対 す る 1週 間 保 存 後 の 濃 度 の 平 均 値 よ り残 存 率 を 算 出 し 検 討 し た. 11. 希 釈 検 定 試 験 ヒ ト血 清 お よ び ラ ッ ト血 漿 にVNR標 準 希 釈 溶 液 を 添 加 し2000ng/mLと な る よ う に 調 製 し た 試 料(n=3)を 検 量 線 の 中 央 付 近 濃 度 に な る よ う に 希 釈 し た.希 釈 し た 試 料100μLを5.項 と 同 様 に 処 理 しHPLC分 析 し た. 12. 定 型 的 定 量 法 の 検 討 9項 で 検 討 し た 日 差 再 現 性(3濃 度(2,50, 200ng/mL))の 測 定 値 を 用 い て,5濃 度(2,5, 10,50,200ng/mL)の 検 量 線 か ら 濃 度 を 算 出 し 直 し,真 度,精 度 を 求 め た. 13. 実 験 動 物 ラ ッ トはWistar系 雄 性 ラ ッ ト(6週 齢 〉 を 日 本 チ ャ ー ル ス リバ ー よ り購 入 後 予 備 飼 育 して7週 齢 で 用 い た.投 与 時 の 体 重 は300∼320gで あ っ た.実 験 前 お よ び 実 験 期 間 中 は 自 由 摂 食,自 由 摂 水 さ せ た.飼 料 に は 固 形 飼 料(FR-2,船 橋 農 場)を 用 い た. 14.薬 物 の 投 与 お よ び 採 血 ジ エ チ ル エ ー テ ル 軽 度 麻 酔 下 の ラ ッ ト に, VNR生 理 食 塩 溶 液 を1.2mg/0.5mL/kgの 用 量 で 大 腿 部 外 腸 骨 静 脈 よ り投 与 し た. 静 脈 内 投 与 後3,6,15,30分,1,2,4, 8,12,24お よ び48時 間 後 に 尾 静 脈 よ り ヘ パ リ ン 処 理 し た ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リ ー(Dmmmond Scien-tific)で 約300μLを 採 血 し た.デ イ ス ポ ー ザ ブ ル シ リ ン ジ に 集 め た 血 液 は 遠 心(2100×g,10min, 4℃)し,血 漿 を 分 離 し てHPLCの 測 定 に 供 し た.試 料 は 測 定 ま で-30℃ で 凍 結 保 存 し た. 15.デ ー タ 処 理 デ ー タ の 算 出,解 析 は 薬 物 動 態 試 験 シ ス テ ム ADME-DAMS(日 製 ソ フ ト ウ ェ ア)お よ びMi-crosoft Excel ver.7.0(マ イ ク ロ ソ フ ト)に よ り 行 っ た.か ら 個 体 ご と にWinNonlin Noncompartmental Amlysis program(vO2.1A)Core Version 30 Sep 98を 用 い て 計 算 し た.静 脈 内 投 与 後 の 得 ら れ た 血 漿 中 濃 度 を 対 数 変 換 後,時 間 に 対 して プ ロ ッ ト し,消 失 相 に お け る 直 線 部 分 の 傾 き を 線 形 最 小 二 乗 法 に よ り求 め,消 失 速 度 定 数(k)と し た.消 失 半 減 期(T1/2)は0.693/kと し て 算 出 し た 。 血 漿 中 濃 度 一 時 間 曲 線 下 面 積(AUC)は,最 終 検 出 時 間(t)ま で のAUC(AUC0∼1)を 台 形 公 式 で 算 出 し,さ ら にt時 間 以 降 をkを 用 い て 外 挿 して AUC0∼ ∞を 算 出 し た.平 均 滞 留 時 間(MRT)は AUMC0∼ ∞/AUC0∼ ∞に よ り 算 出 した.静 脈 内 投 与 時,初 期 濃 度(C0)は 最 初 の 測 定 時 間 お よ び 次 時 間 の 濃 度 の 直 線 部 分 の 傾 き か ら算 出 し た.総 ク リ ア ラ ン ス(CL)はDose/AUC0∼ ∞に よ り 求 め た. 定 常 状 態 に お け る 分 布 容 積(Vdss)はCL×MRT に よ り算 出 し た.
結
果
1. 特 異 性 ヒ ト血 清,血 漿 お よ び ラ ッ ト血 漿 の ブ ラ ン ク, VNRお よ びI.S.を 添 加 し た ヒ ト血 清,血 漿 お よ び ラ ッ ト 血 漿 の 典 型 的 な ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig.3に 示 し た.溶 出 時 間 は,VNRが 約11分, I.S.が7.5分 で あ っ た.6名 の ヒ ト血 清 お よ び 血 漿 の ブ ラ ン ク,6匹 の ラ ッ ト血 漿 の ブ ラ ン ク に は 定 量 の 妨 げ と な る ピ ー ク は 存 在 し な か っ た.ま た,VNRの 代 謝 物 で あ るVNR-N-oxideお よ び17-deacetyl-VNRの 溶 出 時 間 は7.0お よ び7.3分 で あ り,I.S.の 溶 出 時 間 と ほ ぼ 同 値 で あ りI.S.と は 分 離 で き な か っ た. Vincristine,mitomycin C,cisplatin,cyclophos-phamide,doxombicin,paClitaxelお よ び5-forou-racilは そ れ ぞ れVNRの 定 量 の 妨 げ と な る ピ ー ク を 生 じ な か っ た. 2.検 量 線 の 作 成 ヒ ト血 清,血 漿 お よ び ラ ッ ト血 漿 にVNRを2-・ 200ng/mLに な る よ う に 添 加 し て 作 成 し た 検 量 線 の 回 帰 式 は,ヒ ト血 清 でy=0.00254x-0.000667, ヒ ト血 漿 でy=0.00247x-0.000352,ラ ッ ト血 漿 でy=0.00252x-0.001924で あ り,相 関 係 数 は ヒ ト血 清 で0.999988,ヒ ト血 漿 で は0.999720,ラ ッ ト血 漿 で は0.999981で あ っ た.2-200ng/mLの 濃 度 範 囲 で 値 線 性 を 有 す る 検 量 線 が 得 ら れ た. 3.同 時 お よ び 日 差 再 現 性 本 定 量 法 に お け る ヒ ト血 清 ま た は 血 漿 お よ び ラ ッ ト血 漿 を 用 い た 同 時 お よ び 日差 再 現 性 試 験 結 果 をTable 1に 示 し た.2,50お よ び200ng/mL の 濃 度 に お い て,同 時 再 現 性 試 験 時 の ヒ ト血 清 で の 精 度(相 対 標 準 偏 差)は そ れ ぞ れ12.7,2.0お よ び3.3%(平 均 値;n=5),真 度(相 対 誤 差) は そ れ ぞ れ3.2,-0.7お よ び2.0%,ヒ ト血 漿 で の 精 度 は そ れ ぞ れ16.8,10。4(平 均 値;n=4) お よ び2.0%,真 度 は そ れ ぞ れ 一12.2,-4.7(平 均 値;n=4)お よ び5.4%,ラ ッ ト血 漿 で の 精 度 は そ れ ぞ れ13.0,2.2お よ び0.3%(平 均 値;n= 5),真 度 は そ れ ぞ れ5.2,6.0お よ び3.1%で あ っ た.ヒ ト血 清 と 血 漿 の 間 に 有 意 な 差 は 認 め られ な か っ た.ヒ ト血 清 で の 日 差 再 現 性 試 験 時 の2,50 お よ び200ng/mLの 濃 度 に お け る 精 度 は,そ れ ぞ れ11.5,3.2お よ び2.5%(平 均 値;n=15),真 度 は そ れ ぞ れ0.4,-1.7お よ び3.6%,ラ ッ ト血 漿 で の 精 度 は そ れ ぞ れ12.6,2.7お よ び2.7%(平 均 値;n=15),真 度 は そ れ ぞ れ5・4,4.1お よ び 4.4%で あ っ た.判 定 基 準 は 精 度 お よ び 真 度 と も に50お よ び200ng/mLの 濃 度 の 試 料 は そ れ ぞ れ ± 15%以 内,2ng/mLの 濃 度 の 試 料 は そ れ ぞ れ ± 20%以 内 を 許 容 と し た.以 上 の 結 果 よ りVNRの 定 量 下 限 は2ng/mLと し,定 量 範 囲 は2-200 ng/mLと し た. 同 時 再 現 性 時 のVNRお よ びI.S.の ピ ー ク 面 積 か ら 算 出 し た 回 収 率 は ヒ ト血 清 で そ れ ぞ れ83.5% (平 均 値;n=15)お よ び74.1%,ヒ ト血 漿 で そ れ ぞ れ82.1%お よ び74.2%,ラ ッ ト血 漿 で そ れ ぞ れ 79.0%お よ び79.2%で あ っ た. 4。 安 定 性 安 定 性 の 検 討 に お い て,安 定 性 の 判 定 基 準 を 残 存 率90%以 上 と し た.retention time (min)
Fig. 3. Chromatograms of an Extract of (a) Blank Human Serum Sample, (b)
Blank Human Plasma Sample, (c) Blank Rat Plasma Sample, (d) Blank
Human Serum Sample Spiked with 200 ng/mL of Vinorelbine (VNR)
and 500 ng/mL of Vinblastine as Internal Standard (I.S.), (e) Blank
Hu-man Plasma Sample Spiked with 200 ng/mL of VNR and 500 ng/mL of
I.S., (f) Blank Rat Plasma Sample Spiked with 200 ng/mL of VNR and
500 ng/mL of I.S..
1) 凍 結 融 解 安 定 性
VNR 5お よ び50 ng/mLヒ
ト血 清 お よ び ラ ッ ト
血 漿 試 料 を凍 結 融 解 した 時 の,凍 結 融 解3回
まで
のVNRの
残 存 率 は ヒ ト血 清 に お い て そ れ ぞ れ
91%以 上,ラ
ッ ト血 漿 に お い て それ ぞれ97%以
上
で あ り,凍 結 融 解 は3回
まで 可 能 で あ っ た.
2) 短 時 間 室 温 安 定 性
VNR 5お よ び50 ng/mLヒ
ト血 清 お よ び ラ ッ ト
血 漿 試 料 を室温 下 で 放 置 した 時 の,ヒ
ト血 清 に お
け るVNRの
室 温 下1時 間 後 の 残 存 率 は そ れ ぞ れ
97%以
上,2時
間 後 の 残 存 率 は そ れ ぞ れ87%以
上,さ
らに4時 間後 は そ れ ぞ れ 残 存 率78%以
上 で
あ っ た.ラ
ッ ト血 漿 に お い て は室 温 下1時
間放 置
後 のVNRの
残 存 率 は そ れ ぞ れ94%以
上 で あ っ
た.室 温 下1時
間 の放 置 以 降,時 間 経 過 と と もに
残 存 率 低 下 が認 め られ た.
3) オ ー トサ ンプ ラー 保 存 安 定 性
VNR 5お よ び50 ng/mLヒ
ト血 清 お よ び ラ ッ ト
Table 1. Accuracy and Reproducibility for the Determination of Vinorelbine in Human Serum, Plasma and Rat Plasma
a) Precision and accuracy expressed as relative standard deviation and relative error,
respectively. b) mean •} S.D., n=5 c) n=4
血 漿 のHPLC測
定 試 料 を オ ー トサ ン プ ラ ー 中 に
保 存 した 時 の,ヒ
ト血 清 に お け るVNRの
濃 度 よ
り算 出 した36時 間 ま で の残 存 率 は それ ぞれ97%以
上,ラ
ッ ト血 漿 に お い て は95%以
上 で あ っ た.ま
た,ピ ー ク面 積 で 算 出 した残 存 率 は,ヒ
ト血 清 に
お い てVNRは92%以
上,I.S.は93%以
上,ラ ッ ト
血 漿 に お い てVNRは92%以
上,I.S.は93%以
上
で あ り,36時 間 の 連 続 分 析 が 可 能 で あ っ た.
4) 標 準 希 釈 溶 液 安 定 性
検 量 線 用 のVNR標
準 希 釈 溶 液10お よび100ng/
mL,I.S.1μg/mLの
希 釈 溶 液 に つ い て1∼6℃
で 保 存 し た 時,VNR10ng/mLの
溶 液 の 残 存 率 は
2週 間 後 ま で92%以
上 で あ っ た が,そ れ 以 降 は
90%以
下 で あ っ た.VNR100ng/mLの
溶 液 の 残 存
率 は4週 間 後 ま で90%以
上 で あ っ た.I.S.1μg/
mLの
溶 液 の 残 存 率 は4週
間 後 ま で96%以
上 で
あ っ た. 5) 凍 結 保 存 安 定 性 VNR5お よ び50ng/mLラ ッ ト血 漿 試 料 を 凍 結 保 存 し た 時 の,凍 結 保 存1週 間 ま で のVNRの 残 存 率 は そ れ ぞ れ91%以 上 で あ っ た. 5. 希 釈 検 定 試 験 VNR2000ng/mLの ヒ ト血 清 お よ び ラ ッ ト血 漿 試 料 を 希 釈 し て 測 定 し,希 釈 倍 率 で 補 正 し た 後 の 濃 度 の ヒ ト血 清 に お け る 精 度 は4.1%,真 度 は 4.6%,ラ ッ ト血 漿 に お け る 精 度 は6.1%,真 度 は −6.5%で あ り,希 釈 に よ る 測 定 が 可 能 で あ っ た. 6. 定 型 的 定 量 法 の 検 討 日 差 再 現 性 の 測 定 値 を 用 い て5濃 度(2, 5,10,50,200ng/mL)の 検 量 線 か ら3濃 度 (2,50,200ng/mL)の 真 度,精 度 を 求 め た.日 差 再 現 性 試 験 時 の 精 度 は2,50お よ び200ng/mLの 濃 度 に お い て そ れ ぞ れ11.6,3.6お よ び2.2%, 真 度 は そ れ ぞ れ0.1,-0.8お よ び4.5%と 良 好 で あ っ た.こ の こ と か ら5濃 度 の 検 量 線 を 用 い て の 測 定 は 可 能 で あ る と 考 え られ た. 7. ラ ッ トのVNR静 脈 内 投 与 後 の 血 漿 中 動 態 ラ ッ ト にVNRを 静 脈 内 投 与 後 の 血 漿 中VNR 濃 度 をHPLC-UV法 に よ り 測 定 し た 。 投 与 量 は, す で に 体 内 動 態 試 験 で 実 施 し て い る1.2mg/kgに 設 定 し た10). ラ ッ トにVNRを 静 脈 内 投 与 後30分 の 血 漿 の ク ロ マ ト グ ラ ム をFig.4に,血 漿 中 濃 度 推 移 を Fig.5に 示 し た.ま た こ の 時 の 薬 物 速 度 論 的 パ ラ メ ー タ をTable2に 示 し た. ラ ッ ト にVNRを1.2mg/kg静 脈 内 投 与 後 の 血 漿 中VNR濃 度 は,最 初 の サ ン プ リ ン グ 時 間 で あ る0.05時 間(3分)に253±48ng/mL(平 均 値 ± 標 準 偏 差,n=3)を 示 し た 後,3相 性 に 消 失 し た.投 与 後24お よ び48時 間 の 血 漿 中VNR濃 度 は 5.09±0.54ng/mLお よ び2.22±0.07ng/mLで あ っ た.消 失 半 減 期(T1/2)は14.9±2.0時 間 で あ っ
retention time (min)
Fig. 4. Chromatogram of an Extract of Rat Plasma
Sampled 30 min after a Single Intravenous
Administration of 1.2mg/kg of
Vinorel-bine (VNR)
Vinblastine at concentration of 500ng/mL
was used as internal standard (I.S.).
た.AUCo∼ ∞は635±65ng･hr/mL,平 均 滞 留 時 間 (MRT)は14.3±2.3時 間,初 期 濃 度(Co)は366 ±98ng/mL,総 ク リ ア ラ ン ス(CL)は1.91±0.21 L/hr/kg,定 常 状 態 に お け る 分 布 容 積(Vdss)は 27.6±7.7L/kgで あ っ た.
考
察
HPLCを 用 い た 従 来 の 定 量 法 で は,前 処 理 法 に お い て 血 漿 成 分 の 除 去 が 十 分 で は な い た め 低 い 定 量 下 限 を 得 る の は 困 難 で あ り,ま た,TDMを 考 え る 上 で,出 来 る だ け 少 量 の 検 体 を 用 い た 定 量 法 を 確 立 す る 必 要 が あ っ た.そ こ で 今 回,試 料 の 前 処 理 法 やHPLC条 件 に 工 夫 を 加 え る こ と に よ り,特 異 性 が 向 上 し,ヒ ト血 清,血 漿 中,ラ ッ ト 血 漿 中VNR定 量 に お い て も 少 量 の 試 料(100μL) で2ng/mL定 量 下 限 が 得 ら れ る か ど う か 検 討 し た. 特 異 性 の 検 討 に お い て,ヒ ト血 清 お よ び 血 漿 な ら び に ラ ッ ト血 漿 の ブ ラ ン ク や,他 の 抗 悪 性 腫 瘍 薬 はVNR定 量 の 妨 害 と な る ピ ー ク は 生 じ な か っ た.VNRの2種 の 代 謝 物 をI.S.と 分 離 す る こ と は 出 来 な か っ た が,VNRを30mg/m2静 脈 内 投 与 し た 患 者 の 血 清 中 に はVNR-N-oxideお よ び17-deacetyl-VNRは 検 出 さ れ な か っ た こ と が 報 告 さ れ て い る14.15).こ の こ と よ り比 較 的 高 濃 度 に 添 加 す るI.S.の ク ロ マ トグ ラ ム に は ほ と ん ど 影 響 が な く,VNR定 量 に は 問 題 は 生 じ な い と 考 え ら れ た.ま た,RIA法 で は,カ タ ラ ン チ ン 部 を 認 識 し て 測 定 す る た め,17-deacetyl-VNRの よ う な ビ ン ド リ ン部 の 代 謝 物 や 他 の ビ ン カ ア ル カ ロ イ ド と 交 差 反 応 を 示 す と 報 告 さ れ て い る が9.12-14),HPLC 法 で は 未 変 化 体 と そ の 代 謝 物 と を 分 離 で き る こ と か ら,RIA法 よ り優 れ て い る 測 定 法 で あ る と 考 え られ た. 次 に 今 回 確 立 し た 方 法 を 用 い て,ラ ッ ト に VNR1.2mg/kgを 静 脈 内 投 与 後 の 各 パ ラ メ ー タ を 測 定 し た と こ ろ,こ れ ま で 報 告 さ れ て い る HPLC-UV法 に よ っ て 測 定 し たAUC0∼ ∞694ng･ hr/mL,CL1.73L/hr/kg10)と 近 似 し て い た.以 上,Fig. 5. Mean Plasma Concentrations versus Time of
Vi-norelbine in Rat after the Intravenous
Administra-tion of 1.2 mg/kg
Each point with a bar represents the mean+ S.D.
(n=3).
Table 2. Pharmacokinetic Parameters of
Vi-norelbine in Rat Plasma after a
Sin-gle Intravenous Administration of
1.2 mg/kg of Vinorelbine
今 回 確 立 したVNR定
量 法 は,従 来 のHPLC法
の
問題 点 を改 善 した定 量 法 で あ り,感 度,再 現 性 と
も に優 れ て お り,臨 床 に お け るTDMな
らび に 小
動 物 を用 い た基 礎 研 究 に も十 分 有 用 で あ る と考 え
られ た.
引 用 文 献
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