MANUAL TSA Research Reagents Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only. TSA Fluorescence Systems Tyramide Signal Amp

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Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only.

TSA Fluorescence Systems

Tyramide Signal Amplification

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キットの内容

TSA Fluorescein NEL701A001KT （50 - 150 スライド分） 1x Amplification Diluent (15mL) Fluorescein Tyramide (乾燥品、300µL DMSO で溶解) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) NEL701001KT （100 - 300 スライド分） 1x Amplification Diluent (30mL) Fluorescein Tyramide (乾燥品、 DMSO 600µL で溶解) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) SAT701001KT （100 - 300 スライド分） 1x Amplification Diluent (30mL) Fluorescein Tyramide (乾燥品、 DMSO 600µL で溶解) SAT701B001KT （500 – 1,500 スライド分） 1x Amplification Diluent (2x 75mL) Fluorescein Tyramide (乾燥品、 DMSO 600µL で溶解、5 本) TSA Tetramethylrhodamine (TMR) NEL702001KT （100 - 300 スライド分） 1x Amplification Diluent (30mL) TMR Tyramide (乾燥品、DMSO 600µL で溶解) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) SAT702001EA （100 - 300 スライド分） 1x Amplification Diluent (30mL) TMR Tyramide (乾燥品、DMSO 600µL で溶解) TSA Coumarin NEL703001KT （100 - 300 スライド分） 1x Amplification Diluent (30mL) Coumarin Tyramide (乾燥品、DMSO 600µL で溶解) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) TSA Cyanine 3 NEL704A001KT （50 - 150 スライド分） 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 3 Tyramide (乾燥品、精製水 300µL で溶解) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) SAT704A001EA （50 - 150 スライド分） 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 3 Tyramide (乾燥品、精製水 300µL で溶解) SAT704B001EA （250 - 750 スライド分） 1x Amplification Diluent (75mL) Cyanine 3 Tyramide (乾燥品、精製水 300µL で溶解、5 本) TSA Cyanine 5 NEL705A001KT （50 - 150 スライド分） 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 5 Tyramide (乾燥品、精製水 300µL で溶解) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) SAT705001EA （50 - 150 スライド分） 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 5 Tyramide (乾燥品、精製水 300µL で溶解)

製品情報

保存条件 遮光下+4°C 安定性 未開封であれば最低 6 か月間は安定です。有効期限は製品ラベルに表示されています。

TSA テクノロジーとは ... 3 必要な試薬 ... 3 その他の試薬 ... 3 溶液の調整 ... 3 蛍光チラミドストック溶液 ... 3 10x TNT バッファー ... 3 TNB (TN Blocking) バッファー ... 3 蛍光チラミド反応液 ... 3 蛍光物質の励起及び発光波長 ... 4 一般的な注意事項など ... 4 内因性ペルオキシダーゼの不活化 ... 4 免疫組織化学染色(IHC)の検出フロー ... 5 IHC プロトコール ... 6 in situ ハイブリダイゼーション (ISH) の検出フロー .... 8 ISH プロトコール ... 9 トラブルシューティング ... 11 IHC ... 11 シグナルが弱い ... 11 バックグラウンドが高い ... 12 ISH ... 14 シグナルが弱い ... 14 バックグラウンドが高い ... 14 IHC 二重蛍光標識の検出フロー ... 15 異なる動物種の一次抗体が利用可能な場合 ... 15 同じ動物種の一次抗体の場合（ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に限る） ... 16 ISH 二重蛍光標識の検出フロー ... 18 参考文献 ... 19 関連製品 ... 20

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TSA テクノロジーとは

TSA (Tyramide Signal Amplification) は、免疫組織化学染 色や in situ Hybridization の検出シグナルを、簡便かつ短 時間の反応で特異的に増幅し、染色･蛍光での検出感度を向上させる方法です。キットに含まれる蛍光チラミドは、低濃度の過酸化水素の存在下、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）の触媒作用によりラジカル化され、反応のごく近傍に存在する芳香族アミノ酸と共有結合を形成します。HRP 分子の近傍に大量の蛍光分子が共有結合し、シグナルが増幅されることになります。 必要な試薬 どのような検出系を組むのかで異なりますが、TSA システムでは次の様な HRP 標識試薬が必要です。  ビオチン化されたプローブや抗体の検出には、HRP 標識ストレプトアビジン(NEL750001EA)  ジゴキシゲニン（DIG）標識されたプローブや抗体を検出する場合には、HRP 標識抗 DIG 抗体 (NEF832001EA)  フルオレセイン標識プローブや抗体を検出する場合には、HRP 標識抗フルオレセイン抗体（ヒツジ由来） (NEF710001EA)  動物種特異的 HRP 標識二次抗体 HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体（ヤギ由来） (NEF812001EA) HRP 標識抗マウス IgG 抗体（ヤギ由来） (NEF822001EA)  動物種特異的ビオチン標識二次抗体ビオチン標識抗ウサギ IgG 抗体（ヤギ由来） (NEF813001EA) ビオチン標識抗マウス IgG 抗体（ヤギ由来） (NEF823001EA)  TSA フルオレセインを発色検出する場合には、HRP 標識抗フルオレセイン抗体 (NEL710001EA)あるいは AP 標識抗フルオレセイン抗体（ヒツジ由来） (NEF709001PK) その他の試薬

 DMSO (Molecular biology or HPLC grade) 例えば、Sigma-Aldrich # D 8418 注意: DMSO の蒸気は眼や皮膚に対し刺激性があるため、安全ゴーグルを着用してドラフトチャンバー内で取り扱ってください。また、皮膚への浸透性が非常に高いため、DMSO で溶けてしまうニトリル製グローブではなくラテックス性グローブを着用してください。  製品番号が SAT で始まる製品は、ブロッキング試薬 (FP1020)が別途必要です。  バッファー作成に必要な試薬 溶液の調整 以下のバッファーや試薬はサンプルスライドの準備やシグナル増幅に必要です。 蛍光チラミドストック溶液 蛍光チラミドは乾燥品として供給されます。必要量の DMSO あるいは精製水で再構成してストック溶液を作ります。このストック溶液は+4°C 保存で少なくとも 3 か月間は安定です。DMSO は+4°C で凍結しますので、使用時に解凍して下さい。より低温で保管することで安定性が高まるという知見はありません。チューブ 1 本当たりの添加量は以下の通りです。チラミド製品番号溶媒容量

Fluorescein NEL701A001KT DMSO 300µL NEL701001KT SAT701001EA DMSO 600µL TMR NEL702001KT, SAT702001EA DMSO 600µL Coumarin NEL703001KT DMSO 600µL Cyanine 3 NEL704A001KT SAT704001EA 精製水 300µL Cyanine 5 NEL705A001KT SAT705001EA 精製水 300µL 10x TNT バッファー 121.14g Trizma Base 87.6g NaCl 800mL の精製水を加え 6M HCl で pH7.5 に調整します。 10% Tween 20, 50mL を添加し、精製水で 1L に調整します。室温で数週間保存可能です。精製水で 10 倍希釈して使用します。 TNT 以外のバッファー、例えば、PBS に置き換えることも可能です。また、Tween 20 を 0.3% Triton X-100 に置換することも可能ですので、ご自分で評価しつつ適切なバッファーをお使い下さい。 TNB (TN Blocking) バッファー 1.211g Trizma Base 0.876g NaCl 80mL の精製水を加え、6M HCl で pH7.5 に調整し、精製水で 100mL とします。撹拌しながら徐々に粉末ブロッキング試薬 0.5g を加えます。撹拌を続けて 55°C まで加熱して、完全に溶かします。小分けして、-20°C で保存可能です。一日以上常温で保存した TNB バッファーは廃棄してください。 蛍光チラミド反応液 DMSO あるいは精製水で溶解したストック溶液を 1x アンプリフィケーション希釈液 (1x Amplification diluent)で 50 倍に希釈します。スライド 1 枚当たりの使用量は、 100-300µL が目安です。使わなかった反応液は、再使用せず廃棄します。

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蛍光物質の励起及び発光波長 蛍光物質励起波長発光波長 Coumarin 402nm 443nm Fluorescein 494nm 517nm Tetramethylrhodamine 550nm 570nm Cyanine 3 550nm 570nm Cyanine 5 648nm 667nm 一般的な注意事項など  各ステップの途中でスライドが乾燥しないよう注意して下さい。  インキュベーションは湿潤箱（モイストチャンバー）内で行って下さい。  希釈や不均一な反応を避けるため、洗浄から反応に移行する際には、キムワイプなどで、切片の周りをぬぐうなどして、できる限りバッファーが残らない様にして下さい。  切片を充分覆う量の反応液を使って下さい。  カバースリップを使うことで、反応液量を減らすことが可能です。  シグナルが高すぎる場合、一次抗体やプローブ、あるいは HRP 標識レポーター分子の希釈を試して下さい。 1x アンプリフィケーション希釈液には、過酸化水素が含まれていますので、チラミド反応液を水などで更に希釈することは避けて下さい。  初めて TSA システムを使う際は、他の系で検出がうまくいっているサンプルで試して下さい。 内因性ペルオキシダーゼの不活化 TSA 反応はペルオキシダーゼによって触媒されます。内因性ペルオキシダーゼはバックグラウンドを生じますので、適切に失活させる必要があります。サンプルに応じた失活条件を決めて下さい。一般には、以下の処理をお勧めします。  0.3% - 3% 過酸化水素を含む PBS で、10-60 分間インキュベーションする。  0.3% - 3% 過酸化水素を含むメタノールで、10-60 分間インキュベーションする。パラフィン包埋切片の場合、脱パラフィン、再水和の後にペルオキシダーゼ不活化を行うことができます。凍結切片あるいは細胞塗沫では固定処理の後、プロテアーゼ処理の前に不活化を行えます。不活化処理の後は、TNT あるいは 1x PBS で 5 分間洗浄します。

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免疫組織化学染色(IHC)の検出フロー

標準的な免疫染色手法

内因性ペルオキシダーゼ不活化（0.3% H2O2 in PBS for 30min or 3.0% H2O2 in PBS for 5 min）

組織への抗体の浸透性を高める（必要に応じて） ↓ ブロッキング TNB バッファー中で室温 30 分間ブロッキングを行う。 ↓ 一次抗体反応一次抗体と室温で 30-60 分間反応させる。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ HRP の導入 HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させる。ビオチン標識第二抗体と室温で 30- 60 分間反応させる。あるいは TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 SA-HRP と室温で 30 分間反応させる。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ TSA 増幅 TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄後、水気を切ったのちチラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 蛍光検出 酵素発色検出 （TSA Fluorescein の場合のみ） ↓ ↓ 可視化蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などで封入し、蛍光顕微鏡で観察する。 HRP あるいは AP 標識した抗フルオレセイン抗体で室温 30 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 発色基質を加え反応させる。対比染色を行い顕微鏡観察する。

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IHC プロトコール 操作コメント Step 1. 組織切片の準備 通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する、脱パラフィンや親水処理を行う。内因性ペルオキシダーゼ不活化を行う。 Step 2. ブロッキング TNB バッファーを添加し、湿潤箱内で室温 30-60 分間あるいは+4°C でオーバーナイトインキュベーションを行う。 TNB (TN Blocking) バッファー 0.1M Tris-HCl, pH7.5 0.15M NaCl 0.5% ブロッキング試薬 Step 3. 一次抗体との反応 TNB バッファーを除き、TNB バッファーで希釈した一次抗体と反応を行う。インキュベーション時間や温度は、抗体の製造者の指示に従う。通常スライド当たり 100- 300µL を用いる。次の濃度で TSA 検出を試て、予め適切な一次抗体の濃度検討を行って下さい。スライド 1: 通常の検出と同じ濃度（製造元の推奨濃度）スライド 2: スライド 1 の 5 分の 1 濃度スライド 3: スライド 2 の 5 分の 1 濃度スライド 4: スライド 3 の 5 分の 1 濃度(必要なら更に希釈系列を作る) スライド 5: 一次抗体無し（ネガティブコントロール） Step 4. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。 TNT バッファー 0.1M Tris-HCl, pH7.5 0.15M NaCl 0.05% Tween-20 Step 5. HRP の導入 TNB バッファーで希釈した HRP 標識二次抗体と室温で 30 分間あるいは+4°C でオーバーナイトインキュベーションを行う。スライド当たり 100- 300µL を添加し、湿潤箱内で行う。 HRP 標識抗マウス抗体 (NEF822001EA): 500- 2,000 倍希釈 HRP 標識抗ウサギ抗体 (NEF812001EA): 500- 2,000 倍希釈ビオチン標識二次抗体の場合は、以下の操作となります。 1) TNB バッファーで希釈して室温で 30-60 分間反応させる。 2) TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。 3) TNB バッファーで希釈した SA-HRP と室温で 30 分間あるいは+4°C でオーバーナイトインキュベーションを行う。キットに含まれる SA-HRP: 100 倍希釈 SA-HRP (NEL750001EA): 1,250- 2,500 倍希釈他社の HRP レポーター分子の場合、推奨されている希釈倍率よりもより希釈する必要があると思います。 Step 6. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。

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Step 7. TSA 増幅 キムワイプなどで、切片の周りをぬぐうなどして、できる限り TNT バッファーを除く。蛍光チラミド反応液をスライド当たり、100- 300µL 添加する。室温で 3-10 分間インキュベーションする。湿潤箱内で行うか、カバースリップを使い乾燥を防ぐ。蛍光チラミド反応液蛍光チラミドストック溶液を 1x アンプリフィケーションダイ希釈液で 50 倍希釈し反応液とします。 Step 8. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。 Step 9. 検出(可視化) DAPI を含む蛍光退色防止剤入りの水性封入剤などでマウントする。

蛍光物質が Coumarin の場合には、DAPI や Hoechst 33342 以外の対比染色を行ってください。 TSA Fluorescein の酵素発色検出の場合は以下の手順となります。 1) TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗フルオレセイン抗体(1: 25)あるいは AP 標識標識抗フルオレセイン抗体(1: 100)と湿潤箱内で室温 30 分間反応させる。 2) TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 3) 適切な発色基質との酵素反応を行う。 4) 対比染色を行う（例えば、DAB, AEC 発色であればヘマトキシリン、NBT/BCIP 発色であれば Nuclear fast red）。 5) Histomount あるいは ClearMount の様な封入剤を用いてマウントする。対比染色やマウント溶媒は、発色物質を溶かさない溶媒であることを確認してください。対比染色剤の互換性蛍光対比染色 TSA の蛍光物質 DAPI (359/461)- Blue Propidium iodide (536/617) Red SYTOX Green (502/523) Hoechst 33342 (346/460)- Blue Coumarin (402/443) NO YES YES NO Fluorescein (494/517)

YES YES NO YES

Tetramethylrhodamine (550/570)

YES NO YES YES

Cyanine 3 (550/570)

YES NO YES YES

Cyanine 5 (648/667)

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in situ ハイブリダイゼーション (ISH) の検出フロー

DIG あるいはビオチン標識プローブ濃度と HRP 標識抗ハプテン分子（例えば HRP 標識抗 DIG 抗体や SA-HRP）の希釈率を適切に設定することが良い結果を得るために大切です。 in situ ハイブリダイゼーション内因性ペルオキシダーゼの不活化（必要に応じて）プレハイブリダイゼーション（必要に応じて）プローブハイブリダイゼーション洗い(Stringency wash) ↓ ブロッキング TNB バッファー中で室温 30 分間インキュベーションする。 ↓ HRP の導入適当な HRP 標識抗ハプテン分子（HRP 標識抗 DIG 抗体、SA-HRP など）と室温で 30 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ TSA による増幅余分な水分を除き、チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ 蛍光検出 酵素発色検出 （TSA Fluorescein の場合のみ） ↓ ↓ 可視化蛍光退色防止剤入りのマウント剤などで封入し、蛍光顕微鏡で観察する。 HRP あるいは AP 標識した抗フルオレセイン抗体で室温 30 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄後 ↓ 発色基質を加え反応させる。対比染色を行い顕微鏡観察する。

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ISH プロトコール 操作コメント Step 1. 組織切片の準備 通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する、脱パラフィンや再水和を行う。 Step 2. ISH 常法に従い ISH をおこなう。必要に応じてプレハイブリダイゼーションや内因性ペルオキシダーゼの不活性化を行う。標識ハプテンは、DIG、ビオチン、DNP、フルオレセインなど自由に選択可能です。通常の条件でハイブリダイゼーション後の洗い (Stringency wash) を行います。次の濃度で TSA 検出を試て、予め適切なプローブ濃度の検討を行って下さい。スライド 1: 通常の検出と同じ濃度のプローブスライド 2: スライド 1 の 5 分の 1 のプローブ濃度スライド 3: スライド 2 の 2 分の 1 のプローブ濃度スライド 4: プローブ無し（ネガティブコントロール）通常の検出系で十分なシグナルが得られているのであれば、通常の検出法でぎりぎりシグナルが出るくらいまでにプローブを希釈してから、TSA を使った検出を試みて下さい。普段の検出でも、TSA 増幅を行わないスライドと、プローブを加えずに TSA 増幅を行うネガティブコントロールを常に置いて下さい。可能ならば、次のようなコントロールもご検討下さい。 ネガティブコントロール 本来のサンプルで得られたシグナルが特異的であることを確認するための次の 3 種類のコントロール。 a) Target Control:  RNase 処理を行いサンプル中の mRNA を分解したもの b) Hybridization Control:  センス鎖プローブによりハイブリダイゼーションを行ったもの  ハプテン標識アンチセンスプローブに大過剰（10 倍程度）の標識していないアンチセンスプローブを加えてハイブリダイゼーションを行ったもの c) Detection Control:  プローブを加えずにハイブリダイゼーション以降の処理を行ったもの  抗ハプテン抗体を加えずに検出を行ったもの  TSA による増幅を行わずに、他の検出系を用いたもの ポジティブコントロール 対象の組織で確実に発現している mRNA に対するプローブを用いた TSA 検出を行う。これにより、サンプル由来のパラメーター（プロテアーゼによる浸透性の向上や、内因性ペルオキシダーゼのクエンチングが適切に行われているか）を、またプローブの標識反応あるいは免疫学的検出自体が機能しているかの確認が行えます。 Step 3. ブロッキング TNB バッファーを添加し、湿潤箱内で室温 30- 60 分間あるいは+4°C でオーバーナイトインキュベーションを行う。 TNB (TNT Blocking) Buffer 0.1M Tris-HCl, pH7.5 0.15M NaCl 0.5% ブロッキング試薬

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Step 4. HRP の導入 TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗ハプテン抗体と室温で 30 分間あるいは+4°C でオーバーナイトインキュベーションを行う。スライド当たり 100- 300µL を添加し、湿潤箱内で行う。 ビオチン標識プローブ  キットに含まれる SA-HRP: 100 倍希釈  SA-HRP (NEL750001EA): 250 – 1,000 倍希釈 DIG 標識プローブ  HRP 標識抗 DIG 抗体(NEF832001EA): 100-1,000 倍希釈 フルオレセイン標識プローブ  HRP 標識抗フルオレセイン抗体(NEF710001EA): 100-500 倍希釈 DNP 標識プローブ  HRP 標識抗 DNP 抗体(FP1129): 100-500 倍希釈他社の HRP 抗ハプテン分子の場合、推奨されている希釈倍率よりもより希釈する必要があると思います。 Step 5. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。 TNT バッファー 0.1M Tris-HCl, pH7.5 0.15M NaCl 0.05% Tween-20 Step 6. TSA 増幅 蛍光チラミド反応液をスライド当たり、100- 300µL 添加する。室温で 3- 10 分間インキュベーションする。湿潤箱内で行うか、カバースリップを使い乾燥を防ぐ。蛍光チラミド反応液蛍光チラミドストック溶液を 1x アンプリフィケーション希釈液で 50 倍希釈します。 Step 7. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す。 Step 8. 検出(可視化) DAPI を含む蛍光退色防止剤入りの封入剤などでマウントを行う。

蛍光物質が Coumarin の場合には、DAPI Hoechst 33342 以外の対比染色を行ってください。 TSA Fluorescein の酵素発色検出の場合は以下の手順となります。 1) TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗フルオレセイン抗体(1: 25)あるいは AP 標識標識抗フルオレセイン抗体(1: 100)と湿潤箱内で室温 30 分間反応させる。 2) TNT バッファー内で撹拌しながら、室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 3) 適切な発色基質との酵素反応を行う。 4) 対比染色を行う（例えば、DAB, AEC 発色であればヘマトキシリン、NBT/BCIP 発色であれば Nuclear fast red）。

5) Histomount あるいは ClearMount の様な封入剤を用いてマウントする。

対比染色やマウント溶媒は、発色物質を溶かさない溶媒であることを確認してください。

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トラブルシューティング

IHC シグナルが弱い 原因対策あるいは確認方法ターゲット抗原がサンプルで発現していない、または、一次抗体の反応性が低い。同じ組織や細胞で、用いた抗体によりシグナルが得られているのかを確認します。抗原の存在量が非常に低かった。より高感度な検出が可能な TSA Plus を検討して下さい。あるいは、HRP の導入時に HRP ポリマーを利用することを検討して下さい。一次抗体の濃度が低すぎ、または高すぎた。一次抗体の濃度の検討を行います。一次抗体をより高い濃度とより希釈したものの両方で検討して下さい。濃度の高い場合に、シグナルがでないということは信じがたいことですが、一次抗体がたくさんサンプルに残ることにより、最終的に HRP が大量に存在すると、一度に活性化されたチラミド同士が反応してダイマーを作ってしまいサンプルに結合しません。 HRP 存在量とチラミドシグナルの関係（模式図）チラミドダイマーは、コラーゲンやエラスチン(Elastin)にアフィニティーがあるという報告1)_{が有ります。このため、チラミドダイマーが形成された場合、結合組織や血管で非特} 異的なシグナルが出る可能性が有ります。検出する抗原に一次抗体がアクセスし難かった。一次抗体を抗原にアクセスしやすくするために、以下の方法があります。 a) 何らかの固定が施されたサンプルでは問題ありませんが、凍結切片では抗体の浸透性をあげるために、ブロッキングバッファーに 0.1% Triton X-100 を添加することができます。ただし、核あるいは細胞質マトリクスを構成するタンパク質あるいは、細胞膜上の抗原検出には、溶出や膜構造の破壊を避けるため、全てのステップで界面活性剤を含まないバッファーの使用を薦めます。 b) ホルマリン固定パラフィン包埋切片では、エピトープの構造や電荷が変化してしまい一次抗体がうまく認識できないことがあります。このような場合、抗原賦活化(antigen retrieval)と呼ばれる操作を行います。賦活化にはいくつかの方法2-5)があります。脱パラフィン・再水和の後、例えば、10 mM クエン酸 pH 6.0 あるいは、1mM EDTA, pH 8.0 にサンプルスライドを浸し、沸騰水浴中でインキュベーションまたは電子レンジで沸騰するまで加熱します。蒸留水洗浄 2 分間の後 TBST によるブロッキング 10 分間を行います。 BioGenex, DAKO, Vector などから賦活化溶液も市販されています。チラミド反応が生じない

酵素が使われていた。

HRP 標識二次抗体あるいは SA-HRP をチラミドの反応に用います。アルカリフォスファターゼでは、チラミド反応は起こりません。

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チラミドの調整が適切でなかった、あるいは分解していた。

蛍光チラミドはこのプロトコールに示された量の DMSO あるいは精製水で再構成します。 DMSO は、Molecular Biology grade あるいは HPLC grade を使用して下さい。また、古くなった DMSO は空気中の水分を吸収し、冷蔵保存(+ 4°C)では凍結しなくなります。このような DMSO はチラミドの再構成に適しません。 a) 再構成後の保存は+ 4°C を薦めます。吸湿を防ぐため、保存容器をパラフィルムでラップする、実験台でふたを開けておいておく時間を最低限にするなど心がけて下さい。- 80°C で保存することにより安定性が向上する、または分解が進むという知見は今のところありません。 b) 何回もの凍結融解を避けるため、小分けして保存なさる方もいらっしゃいます。そのような場合には、ガラス容器をお勧めします。プラスチック容器の場合、おそらく DMSO に溶解する成分があるため、問題が生じる場合があります。 c) DMSO で再構成した後の使用期間は 3 ヶ月間を目安にして下さい。 1x アンプリフィケーション希釈液で希釈したチラミドの失活の可能性 1x アンプリフィケーション希釈液には過酸化水素が含まれるため、一度調製した蛍光チラミド反応溶液は、2‐3 時間が使用期限です。使い切れなかったものは、使用せずに廃棄して下さい。最終検出が発色反応の場合、酵素標識抗体の希釈が高すぎた。発色反応に用いた酵素標識抗体の濃度を検討して下さい。 2 倍高い濃度を試し下さい。発色基質が適切に調整されていなかった。発色基質が適切でなかった、あるいは分解していた可能性のある場合は、発色基質の再調整や新規購入を検討して下さい。試薬の使用順序が適切でなかった。操作の各ステップの順序や温度時間の再確認を行って下さい。 バックグラウンドが高い 原因対策あるいは確認方法内因性ペルオキシダーゼ活性存在した。内因性ペルオキシダーゼの不活化を行います。例えば、0.3% から 3%の過酸化水素を含むメタノールまたは PBS を使い、室温で 10-60 分間処理して、ペルオキシダーゼを失活させます。チラミドはペルオキシダーゼにより活性化されてサンプル組織に露出しているチロシン残基と結合します。もし組織や細胞に自然に含まれるペルオキシダーゼ活性が残っていると、チラミドを活性化して非特異的なシグナルを生じます。確認法：サンプル切片にブロッキングだけを行い、チラミド反応液を加えてみます。検出を行いシグナルが生じていないかを確認します。対策：バックグラウンドシグナルが生じるのであれば、クエンチングの過酸化水素の濃度を上げる、または、処理時間を延ばしてみます。あるいは、他のクエンチング条件を試みます6)_{。ホルマリン固定パラフィン包埋切片では、電子レンジ加熱による抗原の賦活化と} 同時に内在性ペルオキシダーゼ失活が行を行った例があります7)_。内因性ビオチンが存在し内因性ビオチンは、パラフィン包埋切片の場合よりも凍結切片の場合に問題になることが OH Protein N H R O OH H2O2 O2 HN R O O N H R O C O H O H Protein N H R O OH Tyrosin residue Tyramide R = Biotin, Fluorescence or DNP Peroxidase Isomers +

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確認法： a) ブロッキングを行い、蛍光または酵素標識ストレプトアビジンを反応させる。シグナルが生じないかを確認します。 b) ブロッキングを行い、HRP 標識ストレプトアビジン(SA-HRP)だけを反応させ、さらにチラミド反応を行い、シグナルが生じていないかを確認します。対策：可能であれば、サンプルをパラフィン包埋に変更します。市販の内因性ビオチンブロッキングキット (DAKO X0590, Life Technologies 00-4303)を使用する。あるいは、ビオチン‐ストレプトアビジンの介在する反応を回避する系を検討して下さい。一次抗体または標識二次抗体あるいは SA-HRP の濃度が高かった。何枚かのスライドを準備し、TSA を用いずに検出していた場合、あるいは抗体の製品説明書で推奨する希釈の、4‐5 倍希釈した一次抗体を検討します。一次抗体を 100 倍希釈で使用していた場合、1: 100, 1: 500, 1: 2,500 や 1: 12,500 の希釈を検討します。二次抗体であれば、2 倍希釈を検討してみます。確認法：内因性ペルオキシダーゼのクエンチングを行い、一次抗体を用いずに、その後の全ステップを行ったコントロール切片サンプルで非特異的シグナルが生じていないかを確認します。対策：一次抗体をより希釈する。更に、バックグラウンドが出るようであれば、二次抗体を希釈する。HRP 標識二次抗体をより種特異性の高いものに換えて下さい。 HRP 標識二次抗体や SA-HRP のストック溶液に凝集物が含まれ、それが切片に沈着してしまった。ストック溶液を軽く遠心して、上清を希釈して使って下さい。非特異的結合のブロッキングが不十分だった。 TSA ブロッキング試薬に 2- 10 %の通常血清を組み合わせて使ってみます。通常血清は、用いる二次抗体の由来動物種と同じものを用います。TSA ブロッキング試薬を、一次抗体、二次抗体あるいは SA-HRP 希釈液に添加することも、非特異的バックグラウンドを抑えるため効果があることがあります。

粉末の TSA ブロッキング試薬を溶解する場合、0.1M Tris-HCl, pH7.5, 0.15M NaCl バッファーに徐々に加え、撹拌したまま 55°C 程度に加熱して下さい8)_{。30-60 分間撹拌して完全に} 溶かして下さい。小分けして-20°C 保存が可能です。洗浄が不十分だった。 TSA プロトコールに示されている洗いの回数は最低限必要な回数です。回数を増やしたり、時間を延ばしたり、振盪することが効果的であることがあります。細胞表面や/オルガネラ膜の染色以外では、洗浄バッファーに界面活性剤を添加します。切片が部分的に乾燥してしまった。組織や細胞の乾燥が起こった場合、（特にサンプルの端で）まだら状の高いバックグラウンドを生じます。対策：サンプルを覆うのに十分な量の試薬を用います。また、カバースリップを使ったり、インキュベーションを湿潤箱内で行い乾燥を防いでください。自家発光を回避する。内在性リポフスチン(Lipofuscin)やエラスチン由来の可能性や、グルタルアルデヒドあるいはホルムアルデヒド固定に由来する自家発光が考えられます9)_。 対策： a) 発色による検出に切り替える、あるいは Cyanine 5 の使用を検討してください。 b) アルデヒド固定した切片では自家発光が生じることがあります。これは、修飾された ε-アミノ基と蛍光物質が結合しているものと思われます。一次抗体の反応の前に、 50mM NH4Cl を含む PBS 中で 10 分間室温インキュベーション後、PBS でリンスします。

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ISH シグナルが弱い 原因対処法あるいは確認方法 mRNA が対象サンプルで発現していない。 RT-PCR で発現を確認してみて下さい。ターゲット mRNA が分解してしまった可能性は無いか。凍結切片の場合、組織は- 80°C で一ヶ月以上保存しない。クリオスタット切片は 48 時間以内に使用する。RNase の混入を避ける基本的な操作を行って下さい。プローブおよびハイブリダイゼーション条件ブローブの標識効率や濃度の確認を行う。組織や細胞にプローブを浸透しやすくするために、プロテアーゼ処理や界面活性剤処理を試みて下さい。 バックグラウンドが高い ISH におけるバックグラウンドの原因は、プローブ標識やハイブリダイゼーションの条件あるいは免疫学的手法を使った検出のどちらかまたは両方に由来します。 プローブに由来するバックグラウンド  プローブ濃度が高すぎた。  静電気によりプローブが非特異的に切片に付着した。  ハイブリダイゼーションやその後の洗いのストリンジェンシーが低かった。 免疫学的手法に由来するバックグラウンド  内因性ペルオキシダーゼまたは内因性ビオチンの影響。  ハプテンを認識する抗体濃度が高い、あるいは凝集物を含んでいた。  ブロッキングや洗いが不十分だった。  用いる試薬の量が不十分で切片の乾燥が生じた。  サンプルの自己蛍光。確認法：バックグラウンドが何に由来するのかを確認するため、プローブを省くか、センス鎖プローブを使ったコントロールスライドで TSA 検出操作を行ってください。コントロールスライドでバックグラウンドが見られないのであれば、プローブ濃度あるいはハイブリダイゼーション条件、洗いのストリンジェンシーを検討して下さい。バックグラウンドが見られたら、免疫学的検出の条件を検討して下さい。原因対処法あるいは確認方法プローブおよびハイブリダイゼーション条件 a) プローブ濃度を通常の検出の場合の 2‐10 倍に希釈してみる。 b) プレハイブリダイゼーションの時間を延ばす、あるいは行っていなければ行ってみる。 c) ハイブリダイゼーション温度を上げる、バッファーのホルムアミド濃度を上げるなどにより，ストリンジェンシーを上げる。 d) 洗いのストリンジェンシーを上げる（塩濃度を下げる、温度を上げる、SDS 濃度を上げる）。 e) 静電的なプローブの非特異的結合を減らすため、切片のアセチル化(0.25% acetic anhydride in 0.1M triethanolamine)を行ってみる。 f) Riboprobe を用いた場合、ハイブリダイゼーションの後に RNase A 処理を行う。 g) T3 プロモーターによるプローブ作成であれば、T7 や SP6 プロモーターに替えてみる。免疫学的検出条件 IHC の項を参照

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IHC 二重蛍光標識の検出フロー

異なる動物種の一次抗体が利用可能な場合 標準的な免疫染色手法内因性ペルオキシダーゼの不活化（必要に応じて）組織への抗体の浸透性を高める（必要に応じて） ↓ ブロッキング TNB バッファー中で室温 30 分間ブロッキングを行う。 ↓ 一次抗体反応異なる抗原を認識する異なる動物種由来一次抗体を同時に室温で 30-60 分間反応させる。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ 1st HRP の導入どちらか一方の一次抗体に対する HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させる。ビオチン標識第二抗体と室温で 30- 60 分間反応させる。 TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 SA-HRP と室温で 30 分間反応させる。 ↓ ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ 1st TSA 増幅水気を切ったのち蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。 ↓ ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ HRP 不活化 1% 過酸化水素を含む PBS pH7.0 中で、室温 15 分間インキュベーションする。あるいは、0.01N HCl 中で室温 10 分間インキュベーションする。 ↓ ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ 2nd HRP の導入ビオチン標識第二抗体と室温で 30 – 60 分間反応させる。もう一方の一次抗体に対する HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させる。 TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 SA-HRP と室温で 30 分間反応させる。 ↓ ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 2nd TSA 増幅水気を切ったのち蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 可視化蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などでマウントし、蛍光顕微鏡で観察する。

TSA の蛍光ラインアップの中で、感度の高い順は Cyanine 3, TMR, Fluorescein となります。存在量が低いと予想される抗原に対してより感度の高い蛍光物質のチラミドを使うことをお勧めします。

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同じ動物種の一次抗体の場合（ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に限る） Step 1. スライドの準備 通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する、脱パラフィンや再水和処理を行う。例えば 1) キシレン中で 10 分間、3 回 2) 100% エタノール中 5 分間 3) 95% エタノール中 5 分間 4) 70% エタノール中 2 分間精製水で洗浄し、TBST 中で 2 分間維持する。普段の検出でも、TSA 増幅を行わないスライドと、一次抗体やプローブを加えずに TSA 増幅を行うネガティブコントロールを常に置いて下さい。バックグラウンドシグナルを下げるため、オートクレーブ滅菌した精製水を用いてください。

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Step 2. 電子レンジによる加熱処理 10mM クエン酸水溶液 pH6.0 を満たしたプラスチック容器にスライドグラスを入れ、電子レンジの出力を最高にして沸騰するまで加熱する（容器の底には、紙タオルなどを敷いて置く）。出力を 20％に落とし、15 分間連続加熱する。途中でスライドが乾燥しないよう注意する。レンジから取出し室温まで放冷する。精製水で洗浄を 2 分間行い、ブロッキングに進む。電子レンジの出力 20%調整ができなければ、20-30 秒ごとに最大出力で沸騰させることを繰り返して、適した回数を決めて下さい。この処理は、抗原賦活化と内因性ペルオキシダーゼの失活を行うものです。抗原賦活化に用いる溶液や温度条件は、抗原や抗体の組合せで異なりますので、適した条件を選んでください。また、内因性ペルオキシダーゼの失活は、過酸化水素を用いる方法でも結構です。 Step 3. ブロッキング TNB バッファーを添加し、室温で 10-60 分間あるいは +4°C でオーバーナイトインキュベーションを湿潤箱内で行う。 TNB (TNT Blocking) Buffer 0.1M Tris-HCl, pH7.5 0.15M NaCl 0.5% ブロッキング試薬 Step 4 から 6 までは、IHC プロトコールと同じです。 Step 7. 電子レンジによる加熱処理 10mM クエン酸水溶液 pH6.0 を満たしたプラスチック容器にスライドグラスを入れ、電子レンジの出力を最高にして沸騰するまで加熱する。出力を 20％に落とし、 15 分間連続加熱する。室温まで放冷する。精製水で洗浄を 2 分間行い、ブロッキングに進む。

市販の抗原賦活化溶液 DAKO Target Retrieval Solution, pH6.1、BioGenex Antigen Retrieval Citra Solution なども使用可能です。

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ISH 二重蛍光標識の検出フロー

in situ ハイブリダイゼーション内因性ペルオキシダーゼの不活化（必要に応じて）プレハイブリダイゼーション（必要に応じて）プローブハイブリダイゼーション（DIG、フルオレセインあるいはビオチン標識プローブを同時にハイブリダイゼーション）洗い(Stringency wash) ↓ ブロッキング TNB バッファー中で室温 30 分間インキュベーションする。 ↓ 1st HRP の導入 TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗 DIG 抗体あるいは抗フルオレセイン抗体と室温で 30 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 1st_{TSA 増幅} _{余分な水分を除き、蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。} ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ HRP 不活化 1% 過酸化水素を含む PBS pH 7.0（あるいは、0.01N HCl）を加え、室温 10 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ ↓ DIG あるいはフルオレセインプローブのどちらかとビオチンプローブの組合せの場合 DIG とフルオレセインプローブの組合せで、最初にフルオレセインプローブを検出した場合 2nd HRP の導入 TNB バッファーで希釈した SA-HRP と室温で 30 分間反応させる。 TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗 DIG 抗体と室温で 30 分間インキュベーションする。 ↓ ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 2nd TSA 増幅余分な水分を除き、蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする。 ↓ TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄する。 ↓ 可視化 蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などでマウントし、蛍光顕微鏡で観察する。 Note: 1) DIG プローブとフルオレセインプローブを組み合わせた場合には、一般には最初の TSA 増幅でフルオレセンプローブ検出を行うことを薦めます。しかし、発現レベルが明らかに低い対象には、シグナルが強い DIG プローブを使い最初に TSA 検出を行ってください。 2) 0.1% H2O2/ MeOH による HRP 不活化は、フルオレセインには影響ありませんが、Cyanine 系蛍光物質は影響を受けるという報告10)_{がありますので、最初に TSA Cyanine 3/5 を用いた検出の場合は、は使わないでください。}

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参考文献

1) Roth, K.A. Tyramide signal amplification strategies for fluorescence labeling [on line]

http://www.uab.edu/medicine/neurosciencecore/images/forms-documents/SfN_Short_Course.pdf

2) McNichol, A.M. & Richmond, J.A. Optimizing immunohistochemistry: antigen retrieval and signal amplification. Histopathology 32, 97-103 (1998).

3) Loup F., Weinmann O., Yonekawa Y., Aguzzi A., Wieser H.G. & Fritschy J-M. A highly sensitive immunofluorescence procedure for analyzing the subcellular distribution of GABAA receptor subunits in the human brain. J. Histochem. Cytochem. 46, 1129-1139 (1998).

4) Toda, Y., Kono, K., Abiru, H. Kokuryo, K. Endo, M., Yaegashi, H. & Fukumoto, M. Application of tyramide signal amplification system to immunohistochemistry: A potent method to localize antigens that are not detectable by ordinary method. Pathology International 49, 479-483 (1999).

5) Evans, M. F. Aliesky, H.A. & Cooper, K. Optimization of biotinyl-tyramide-based in situ hybridization for sensitive background-free applications on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens. BMC Clinical Pathology 3, 1-17 (2003).

6) Liu, G., Amin, S. Okuhama, N. Liao, G. and Mingle, L.A. A quantitative evaluation of peroxidase inhibitors for tyramide signal amplification mediated cytochemistry and histochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 126, 283-291 (2006). 7) Tóth, Z.E. & Mezey, È. 2007 Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using

Antibodies from the same Species. J. Histochem. Cytochem. 55, 545-554 (2007).

8) TSA protocol for ISH. [on line] http://www.brainshark.com/caliper/vu?pi=zGYzNSUJrz5ITJz0

9) Autofluorescence: Causes and Cures, Wright Cell Imaging Facility, University Health Network Research. [on line]

http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf

10) Brend, T & Holley, S.A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. [on line]

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