2017 年 4 月 5 日 国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター (NCNP) Tel：042-341-2711（総務部 広報係）
第 4 回リサーチフロントアワード（トムソン・ロイター）を受賞した木村英雄
シグナル分子硫化水素（H
2S）と一酸化窒素（NO）の相乗効果が
ポリサルファイド（H
2S
n）生成によることを解明
国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター（NCNP、東京都小平市 理事長：水 澤英洋）神経研究所（所長：武田伸一）の神経薬理研究部 木村英雄らのグループは、明治 薬科大学教授小笠原裕樹、東京大学教授浦野泰照、同准教授花岡健二郎との共同研究により、 硫化水素（H2S）と一酸化窒素（NO）との相乗効果が、ポリサルファイド（H2Sn）生成によ ることを明らかにしました。これは、H2S と NO が反応して活性のより強い H2Snが生成し たことを示すものです。H2Snのうち特に、n = 2, 3 の H2S2とH2S3が生成したことを明治薬 科大学との共同研究でLC-MS/MS を使って検出し、さらに、痛みの伝達を行う骨髄後根神経節細胞のtransient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1)チャネル活性化を、東京大学薬学
部と共同開発した H2Sn選択的蛍光プローブと Ca2+イメージングリアルタイム計測によって 示しました。このことにより、それぞれH2S あるいは NO 単独により伝達されると考えられ たTRPA1 を介した痛みの伝搬が、H2Snにより行われている可能性が高くなりました。すな わち、H2S と NO の相互作用はシグナル分子 H2Sn生成の新規経路である可能性を示唆しま す。 今回使用した蛍光プローブは、H2Snに選択性を示す、初の可逆的プローブであり、従来開 発されていた不可逆プローブが、H2Snと反応すると H2Snが消滅した後も蛍光を発している のに対して、H2Snの消失とともに蛍光も消光することが可能になりました。このプローブを 使って、H2Sn動態をリアルタイムで感知することができました。 H2S2とH2S3がH2S と NO から生成される生理活性分子実態であることが明らかになった ことで、これまでNO 単独によると考えられていた血管平滑筋弛緩作用等が、H2S と相互作 用して生成されたH2S2とH2S3によるものである可能性が出てきました。 今後、抗不安薬や抗疼痛薬開発への進展が期待されます。神経分化の促進作用もあるた め、再生医療への応用も期待されました。 本研究成果は、日本時間 2017 年 4 月 5 日午後 6 時（報道解禁日時：イギリス時間 4 月 5 日午前 10 時）に、Nature Publishing の英国オンライン科学雑誌「Scientific Reports（サイエンティ フィック･リポーツ誌）」に掲載されます。
■硫化水素（H2S）の研究経緯について 木村英雄らは、これまでに人体内で生成される硫化水素H2S が神経伝達調節因子として機 能していることを1996 年に世界で初めて報告し、その後、硫化水素が血管弛緩を誘導するこ と及び神経細胞を酸化ストレスから保護する機能を発見、続いて、脳と腎臓内でH2S が効率 よく生合成される経路を発見、硫化水素が結合したポリサルファイド（H2Sn）が脳内のシナ プスによる神経伝達を活性化させる仕組みを発見、硫化水素からも生成される生理活性物質 のトリサルファイド（H2S3）が主なポリサルファイドであることを発見するなど、生合成経 路や仕組みを次々と明らかにしてきています。 ■研究の背景 本研究グループは、血管平滑筋弛緩において、H2S と NO とが相乗効果を示すことを 20 年前 に発見し（＊1）、その発見はその後の H2S/NO クロストーク研究を拓くこととなりました。最近、 H2S と NO との相互作用により、HNO（ニトロキシル）、HSSNO（ニトロソパーサルファイド）、 H2Sn ができることが報告されましたが、H2Sn についてはほとんど考察がなされていませんでし た。 本研究グループは、H2Snが脳に存在し、記憶や痛みの伝達などに関わるTRPA1 チャネルを活 性 化 す る こ と （ ＊2 ）、 そ し て 、 H2S3 や H2S2 が 3-mercaptopyruvate (3MP) か ら 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3MST)によって生合成されること（＊3）をそれぞれ 2013 年と 2015 年に報告しています。2013 年の報告に続いて、H2Snによる神経分化促進、抗高 血圧、抗酸化ストレス制御、癌抑制因子制御などが次々と報告されました。
＊1（引用元）Hosoki, R., Matsuki, N. & Kimura, H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Comm. 237, 527-531 (1997). PMID:9299397
＊2（引用元）Kimura, Y., Mikami, Y., Osumi, K., Tsugane, M., Oka, J-I, and Kimura, H. Polysulfides are possible H2S-derived signaling molecules in rat brain. FASEB J. 27,
2451-2457, 2013. doi: 10.1096/fj.12-226415.
＊3（引用元）Kimura, Y., Toyofuku, Y., Koike, S., Shibuya, N., Nagahara, N., Lefer, D., Ogasawara, Y., Kimura, H. Identification of H2S3 and H2S produced by 3-mercaptopyruvate
sulfurtransferase in the brain. Sci. Rep. 5:14774, 2015. DOI: 10.1038/srep14774.
■研究内容 H2S と NO との相乗効果について、ドイツの Ebenhardt らは、両者の相互作用により HNO と H2Snができることを報告し、HNO が TRPA1 チャネル活性化の分子実態であることを結論付けま した（＊4）。一方、イギリスの Cortese-Krott らは、相互作用により HSSNO と H2Snができるこ とを報告し、HSSNO が NO のキャリアとして働くことを報告しています（＊5）。両グループ間 で、HNO と HSSNO については論争中ですが、残念ながら、H2Snについての実験と考察がほと
んどなされていませんでした。日本のMoustafa＆Habara は、H2S あるいは NO 放出剤投与によ り、細胞内の対応分子との相互作用によりH2Snができることを報告しています（＊6）。 本研究部グループは、H2S と NO との相互作用により、H2S2と H2S3 とが生成されることを LC-MS/MS で確認し、H2Sn選択的蛍光プローブにより、H2S と NO の投与時に細胞内・外に H2Sn が上昇し、脊髄後根神経節細胞のTRPA1 チャネルが活性化され Ca2+流入が惹起されることを示 しました。H2Snがシアンにより分解され、一方HNO は耐性であることを利用し、H2S と NO と の相乗効果がシアンにより消失することから、HNO ではないことを示しました。また、H2Snが 還元性物質によって分解され、一方HSSNO は耐性であることを利用して、同様に HSSNO では ないことを示しました。これらの結果から、H2S と NO との相乗効果の分子実態は、H2Snである と結論付けました。
＊4．Eberhardt, M. Dux, M., Namer, B., Miljkovic, J., Cordasic, N., Will, C., Kichko, T.I., Roche, J. d. l., Fischer, M., Suarez, S. A., Bikiel, D., Dorsch, K., Leffler, A., Babes, A., Lampert, A., Lennerz, J.K., Jacobi, J., Marti, M.A., Doctorovich, F., Hogestatt, E.D., Ygmunt, P.M., Ivanovic-Burmazovic, I., Messlinger, K., Reeh, P., & Filipovic, M.R.H2S and
NO cooperatively regulate vascular tone by activating a neuroendocrine HNO-TRPA1-CGRP signaling pathway. Nat. Commun. 5: 4381 (2014).
＊5．Cortese-Krott, M.M. Kuhnle, G.G.C., Dyson, A., Fernandez, B.O., Grman, M., DuMond, J.F., Barrow, M.P., McLeod, G., Nakagawa, H., Ondrias, K., Nagy, P., King, S.B., Saavedra, J.E., Keefer, L.K., Singer, M., Kelm, M., Butler, A.R., & Feelisch, M. Key bioactive reaction products of the NO/H2S interaction are S/N-hybrid species, polysulfides, and nitroxyl. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 112, E4651-4660 (2015)
＊6．Moustafa, A., & Habara, Y. Cross talk between polysulfide and nitric oxide in rat peritoneal mast cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310, C894-C902 (2016).
■今後の展望 本研究によって、H2S と NO との相互作用によって生成される分子実態が H2S3、H2S2である ことが明らかになりました。中枢神経系では、H2S3、H2S2の生産酵素である 3MST の欠損マウ スが不安症状を示し、H2S3やH2S2によって活性化されるTRPA1 チャネル欠損マウスでは、抗 不安作用が報告されています。一方、末梢神経系においては、TRPA1 チャネルは痛みを伝搬する ことが分かっています。これらのことから、本研究成果は抗不安薬や抗疼痛薬開発への進展が期 待されます。神経分化の促進作用もあり、再生医療への応用も視野に入ります。 そのほか、H2Snの効果として、抗酸化遺伝子群転写因子 Nrf2 の核内移行を促し、細胞の抗酸 化ストレス作用を誘導することから、虚血性疾患における再還流時酸化ストレス軽減にも応用で
きます。また、癌抑制因子PTEN 活性制御作用の癌治療に向けての研究にも期待がかかります。 ■用語解説 ・ポリサルファイド（
H
2S
n）： H2S よりも S の数が多い化合物。常温では H2S のようなガスとしては存在しない。ポリサルファイ ドが脳内でも微量に生成されていることが分かっている。ポリサルファイドは H2S が酸素によっ て酸化されても生成される（2nH2S + 1/2(2n-1)O2 → H2S2n + (2n-1)H2O ）。この経路も 3MST によ って触媒される。また、ニューロンを取り囲むアストロサイトのカルシウムイオンチャネルを活 性化して、カルシウム流入を促進させ、神経伝達物質を生成することで神経伝達活性化を調整し ている。 アストロサイトを活性化するポリサルファイドは S が 2 個から 7 個まで直鎖状に繋がったもの。 この状態で水溶性であるが、8 個つながると環状になり不溶性になり機能しないと考えられる。 HS-↔
HSS-↔
HSSS-↔
…..↔
HS 7-→
S8 ・ヒドロキシル（HNO
）： H2S と NO とが反応してできる物質で、NO の還元型物質である。H2S と NO から同様にできる H2Snが シアンによって分解されるのに対して、HNO はシアンに対して抵抗性を示し、安定である。 ・ニトロソパーサルファイド（HSSNO
）： H2S と NO とが反応してできる物質で、NO のキャリアとして働く。H2Sn が還元性物質によって分解 されるのに対して、HSSNO は勧化性物質に対して分解されず安定である。 ・脊髄後根神経節： 脊髄後根（背側）にある神経節で、末梢からの感覚情報の中継点として機能する神経細胞群。 ・アストロサイト： 脳内で神経細胞（ニューロン）と同じ幹細胞に起源を持ちながら電気的活動をしないグリア細胞 と呼ばれる細胞がある。アストロサイト（astrocyte）はグリア細胞の代表であり、脳内最大の細 胞集団である。アストログリア（astroglia）とも言う。星型の形態を示すことから、「星状」グ リアの名称を持つ。アストロサイトは二種類の突起を持ち、一方は脳表面や血管、もう一方はニ ューロンと接している。ニューロンと接触する側は、ニューロンの結合細胞シナプスを覆い尽く すように、細かい突起をいくつものばし、グルタミン酸などの神経伝達物質を放出して神経伝達 を増強する。 ・TRPA1 チャネル： 細胞膜に存在するチャネルで、Ca2+や Na+などのカチオンを細胞内に流入する。痛みに関わること が示唆されている。 ・Nrf2: 転写因子。Keap1 と複合体を形成し細胞質に存在するが、刺激により、Keap1 から離れて核内に移 行し、抗酸化遺伝子群の転写亢進を誘導する。 ・PTEN: 癌抑制因子。 ・LC/MS/MS: 液体クロマトグラフィ―で分画したサンプルを、質量分析する装置。 ・3MST: 細胞質およびミトコンドリアに存在し、3MP を基質として H2S や H2Snを合成する酵素。■挿入図と解説 （図 1） H2S と NO から H2S2と H2S3が生成されることを LC-MS/MS によって検出 H2S, H2S2, H2S3を monobromobimane で検出した。H2S の Na 塩である Na2S に NO 発生剤である DEA/NO を 混合すると、S-ビマンとして検出される H2S が減る（図 1A 右カラム）。このとき、SS-ビマン及び SSS-ビマンとして検出される H2S2および H2S3が生成されている（図 1B 及び C の右カラム）。 （図 2） 脊髄後根神経細胞において、H2S と NO から生成された H2Snを特異的蛍光プローブによってリ アルタイムで検出し、誘導された Ca2+流入を Ca2+イメージングで計測した。 ＜左図の見方＞ Na2S（H2S）と DEA/NO（NO）を混合して生成される H2Snが細胞内に H2Sn特異的プローブで検出される （上図）。 同様の条件下で、Ca2+プローブで細胞内 Ca2+濃度が 上昇しているのが、観察される。（下図）
(図 3) H2S と NO との相乗効果の分子実態は H2Sn, HNO, SSNO-の可能性が示されている。シアン及び 還元剤への不安定性から、H2Snであると結論づけた。
■原論文情報
論文名： Polysulfides (H2Sn) produced from the interaction of hydrogen sulfide (H2S) and
nitric oxide (NO) activate TRPA1 channels.
著 者： Ryo Miyamoto, Shin Koike, Yoko Takano, Norihiro Shibuya, Yuka Kimura, Kenjiro Hanaoka, Yasuteru Urano, Yuki Ogasawara, Hideo Kimura.
掲載誌： Scientific Reports DOI：10.1038/srep45995 URL： www.nature.com/articles/srep45995 ■助成金 本研究は、木村英雄：JPSP 科研費（26460115）、AMED、上原記念生命科学財団助成金、山崎香 辛料振興財団助成金、渋谷典広：JPSP 科研費（16K15123）、木村由佳：JPSP 科研費（26460352） の助成を受けて行われました。
■お問い合わせ先： 【研究に関するお問い合わせ】 木村英雄（きむら ひでお） 国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 神経薬理研究部 〒187-8502 東京都小平市小川東町 4-1-1 TEL: 042-341-2711（代表） E-mail: 【報道に関するお問い合わせ】 国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター 総務課 広報係 〒187-8551 東京都小平市小川東町 4-1-1 TEL: 042-341-2711（代表） Fax： 042-344-6745 本リリースは、厚生労働記者会、厚生日比谷クラブに配布しております。
