RNA-seq

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RNA-seq解析フロー

2

• RNA-seq

発現差解析

RNA-seq

インポート

クオリティチェック

この資料では、RNA-seqからの説明となりますが、インポート、クオリティ チェックについては、サポート資料のページより内容をご確認いただけます。

データ

• 発現解析用デモデータは、以下よりダウンロードいただけます。ES細胞

（ESC）と神経前駆細胞（NPC）の発現解析を小さなデモデータで行えます。

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http://download.clcbio.com/testdata/MouseChr7dataset.zip

ダウンロード後、解凍せずにImport>Standard Import からイン ポートください。右図のようなファイルがインポートされます。

RPKM

• RPKM: Reads Per Killobases per Million

– 長さが異なるトランスクリプト、実験で使われたリードの総数による違

いについて正規化するための方法。

• C: マップされたリードの総数

• N: リードの総数(Million)

• L: トランスクリプトの長さ（kbase）

4

LN

C

RPKM



RPKM

• 例：

5

Gene 1: 300bp

10 reads

Gene 2: 400bp

13 reads

Gene 3: 500bp

15 reads

Gene 1: 300bp

6 reads

Gene 2: 400bp

10 reads

Gene 3: 500bp

13 reads

Sample A

Total reads:

6M

Sample B

Total reads:

4M

RPKM=10/(0.3*6)

=5.55

RPKM=13/(0.4*6)

_=5.42

RPKM=15/(0.5*6)

_=5.0

RPKM=6/(0.3*4)

=5.0

RPKM=10/(0.4*4)

_=6.25

RPKM=13/(0.5*4)

_=6.5

RNA-seq

6



Navigation Areaから使用するリードデータを選択。



Toolboxから Transcript Analysis > seq Analysis >

RNA-Seq Analysis を選択、ダブルクリック。

RNA-seq

7

Reference

 Genome annotated with genes and transcripts： ゲノムに遺伝子とトランスクリプト（mRNA）がアノ テーションとして付いている場合

 Gnome annotated with genes only：

ゲノムに遺伝子のみのアノテーションが付いて いる場合

 One reference sequence per transcript： 参照配列のみの場合（ESTなど）

Reference sequence, Gene track, mRNA trackはそれ ぞれ使用する、ゲノム配列、遺伝子、mRNAを選択。 Mapping

 Map to gene region only (fast): 遺伝子の領域の みにマッピングする場合

 Also map to inter-genic regions：遺伝子ー遺伝子 間についてもマッピングさせる場合

RNA-seq

8

 Maximum number of mismatches： (Short read パラメータ)

リード中に最大何個までのミスマッチを許容するか。

 Length fraction: (Long read パラメータ)マッチする際に考 慮するリードの長さの割合。

 Similarity fraction: (Long read パラメータ) Length fraction で指定した長さのうち、一致するべき割合。

 Use color space：カラースペースを使用する場合

 Auto-detect paired distances：自動でペアの距離を推定さ せる場合

 Strand specific：センス・アンチセンス鎖特異的にマップさ せたい場合のオプション

 Maximum number of hits for a read：１つのリードがマッチ する最大の数。この数以上の箇所にマップされたリードは、 マップされません。

RNA-seq

9

 Expression level:

 Count paired reads as two: ペアを2リードとカウント したい場合

 Expression value：発現量に何を指定するか

 Calculate RPKM for gene without transcripts: アノ テーションとしてmRNAがなく、遺伝子のみの場合。 この場合、遺伝子の全長でRPKMを計算します。

RNA-seq

10

 Create report：レポートの作成

 Create fusion gene table：融合遺伝子の可能性のあるテー ブルの作成（ペアエンド利用時のみ有効なオプション）

 Minimum read count fusion gene table：融合遺伝子 の可能性があるとする最小の遺伝子

RNA-seq：結果

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

ファイル名 (GE) : Gene Expression トラック



ファイル名 (TE) : Transcript Expression トラック



ファイル名 (Reads) : マッピングトラック



ファイル名 （single）,(paired): マップされなかったリード



ファイル名 report: レポート

RNA-seq：結果

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Gene Expression トラック

RNA-seq

13

Transcript Expression トラック

RNA-seq

14

マッピング トラック

RNA-seq

15

レポート

利用したデータのサマリーや、1つの遺伝子に対するトランスクリプトの 数などの統計情報が含まれています。

RNA-seq

16

結果を組み合わせたビュー

17

Toolbox > Track tools > Create track list を選択し、ゲノム、遺伝子、

mRNA、マッピング（Reads）データ、NPCのGEデータを選択します。

結果を組み合わせたビュー

18

GEトラックの赤枠部分をクリックすると、テーブルが現れます。たとえば

Sox6遺伝子などを選択すると、該当箇所の詳細が確認できます。

RNA-seq

• バッチで処理をしてみましょう！

19  最初のウィザードでBatchのボタンにチェックを入れ、 バッチ処理を行いたいフォルダを選択します。  フォルダ内の該当するデータがリス トに現れます。含めたいもの、含め たくないものは、”Only use elements containing”,”Exclude elements containing”に文字列を入 れることで、選択・排除可能です。

20

発現解析

• RNA-seqの結果を使から、「ES細胞と神経前駆細胞での違

いを調べる」という事を行います。

• 7.0から新しく搭載されたEdgeRについて使い方を説明します。

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群

群内のレプリケート

Gaussian Test

T-test

2群

必須

ANOVA

3群以上

必須

Proportional

Test

Kal’s test

2群

不要

Bagglaley’s test 2群

必須

Empirical

Analysis of DGE

2群

必須

Expression Analysis

• RNA-seqのデータはMicroarrayの

ように発現差の解析を行うことが

可能です。

• そのためには、まずRNA-seqの

データをExperimentという形へ変

更し、その後、発現解析ツールを

使って解析を行います。

22

Set Up Experiment

23



Navigation Areaから使用するRNA-seqデータを選択。



Toolboxから Set Up Experiment を選択、ダブルクリック。

Set Up Experiment

24



Two-group comparison: 2群比較



Unpaired/Paired:2つの群のサンプ

ルに対応があるかどうか。（同じ固

体で違う条件など）



Multi-group comparison:多群比較



Use existing expression values from

samples: RNA-seqで指定した発現量を

そのままつかう場合。



Set new expression value: 別の発現量

を使う場合。

Set Up Experiment

25

Set Up Experiment

Expression Analysis：EDGE

27



Navigation Areaから使用するExperimentデータを選択。



Toolboxから On Gaussian Data を選択、ダブルクリック。

Expression Analysis: EDGE

28



Exact test comparisons



すべての組み合わせ



指定したものをコントロールとする

場合



Add corrected p-value: p値の補正



ボンフェローニ



FDR



Total count filter cutoff: 発現量があるとする

ための最小のカウント数



Tagwise dispersions：タグごと（Set Up

Experimentを遺伝子レベルで作成した場合

は、遺伝子ごと）のばらつきを計算させるか。

通常はチェックをいれたままにしておいてくだ

さい。

Expression Analysis: 結果

Expression Analysis: 結果

30



黒い▼ボタンをクリック

Expression Analysis: 結果

31



FDR < 0.001, Fold Changeの絶対値2以上 でフィルターをかけてみま

しょう。

32

33

P値の補正

•

検定を繰り返すと、指定した閾値よりも実際は高いエラーを含むことになります。

たとえば、p < 0.05 となる遺伝子のリストを得たい場合、3つの遺伝子について検

定を行った場合、これは検定の繰り返しとなり、実際には1-(1-0.05)^3 = 0.14 と

いうエラーを含んだ結果となるのです。

•

Bonfferroni 法ではくりかえしの検定数で閾値を割ることで、繰り返しを考慮した閾

値を設定します。上記の例では、 0.05 / ３ とした閾値で検定します。

•

しかし、遺伝子数が膨大になると、閾値が非常に小さくなり、どの遺伝子も検定で

棄却できず、リストが作成できなくなり、現実的ではありません。

•

ボンフェローに法の閾値で棄却されたリストと言うのは、False Positiveを全く含ま

ないリストとなります。これを少し緩くし、ある程度のエラーを含むことを覚悟した

上でのリストを得ようとする方法が次のFDRになります。

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P値の補正

FDR

• P値を小さい順に並べます。

𝑝

₁

< 𝑝

₂

< 𝑝

₃

< ⋯ < 𝑝

_𝑖

< ⋯ < 𝑝

_𝑚

•

𝛼 を検定で棄却したい値とします。

•

𝑖 = 𝑚として

•

𝐼𝑓 𝑝

_𝑖

< 𝛼

_𝑚

𝑖

(1) を計算する。

• if not set 𝑖 = 𝑚 − 1 then calculate (1)

P-value correction

FDR

• Say 𝑝

₁

< 𝑝

₂

< 𝑝

₃

< ⋯ < 𝑝

_𝑖

< ⋯ < 𝑝

_𝑚

and

𝛼 is threshold.

•

𝑖 = 𝑚

•

𝐼𝑓 𝑝

_𝑖

< 𝛼

𝑖

𝑚

1 を満たすならば、 𝑘 = 𝑖

• （１）式が満たされない場合 𝑖 = 𝑚 − 1 として (1)を再度計算

• 𝑝

₁

, ⋯ , 𝑝

_𝑘

に対応する仮説を棄却する。

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