) 岡山大学 医学部産科婦人科学教室(主 任:橋 本 清教授) 大 院 学 生
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(2) 564. 森. PBSに 浸 し約2時. 山. 雍. 間冷 蔵 庫 に保 存 した後 以下 の如 く. 方. め られ 線 維芽 形 細 胞 が 上 皮 形 細 胞 の 島状 集 団 を網 の. 処 理 した.尚 以 下 の処 理 は す べて 無 菌 室 内 に おい て. 目状 に 取 囲 む とい う所 見 を呈 して い た.尚 線 維 芽形. 無 菌 操 作 の も と に行 な わ れ た.. 細 胞 は そ の後 も更 に 増 強 し,培 養8日. 1.. 胎 児 の肺,肝,腎,筋. 肉お よび皮 膚 の組 織 培. 養.前 記 の 妊 娠 約4ヶ 月 の胎 児 をPBSで3回. の 約80%を. 目に は全 細胞. 占 め る に至 つ た(図1,2).. 洗浄 し. 血 液 そ の他 の 附 着 物 を 出来 る限 り除 い た 後肺,肝, 腎,筋 肉 お よ び皮 膚 の各 組 織 を 無 菌 的 に 別 々に シ ャ ー レ に取 出 した .尚 筋 肉 と皮 膚 と は分 け る こ とな く 一 つ に して 処 理 した .こ れ らの各 組 織 を 数 個 の組 織 片 に切 断 してPBSで2回. 洗 浄 し血 液成 分 を 出 来 る限. り除 い た 後,更 に直 鋏 で 直 径1〜2mmの. 大 き さに 細. 切 した.細 切 した 組 織 片 を 各組 織 別 に100ccの. 三角. フ ラス コに移 し,各 フ ラス コに トリプ シ ンを 約30cc 宛 加 え孵 卵 器(36.5℃)に1時. 間30分 放 置 した 後 取. り 出 し,手 で 強 く振盪 し,数 分 間静 置 した後,未 消 化 の組 織 片 以 外 を ス ピ ッツ グ ラスに移 し, 500〜700 rpmで3分. 図1.. 4ヵ 月 胎児 腎 細 胞.培 養2日 目.多 数 の 上 皮形 細 胞 と少 数 の 線 維芽 形 細. 間遠 沈 し,上 清 を捨 て,沈 渣 と して集 め. られ た 細 胞 を1cc当. 胞 の着 生を み る. り2×105個 と な る如 く培 養 液 に. 浮 游 させ た後,試 験 管 当 り1ccず つ 分 注 し, 36.5℃ の 孵卵 器 中 に静 置 し,以 後 毎 日観察 した.培 養 液 に はYLEと. 牛 血 清 とを80:20の. 割 合 に混 和 した もの. を 使 用 した.尚 培養 液 の 液換 え は培 養 液 のpHに つ て4〜5日 2.. 従. 置 き に行 な わ れ た.. 妊 娠7ヵ 月 の胎 児(♂)の. 筋 肉 と皮 膚 の 組 織. 培 養.前 記 の妊 娠4ヵ 月 胎児 の筋 肉と皮 膚 の培 養 の 場 合 と同様 に行 なわ れ た. 3.. 継代 培 養.旧 培 養 液 を取 除 き,一 度 試 験 管 当. り1ccのPBSで. 洗 滌 した後,ト. リプ シ ン1ccを 加 え, 図2.. 孵 卵 器 に放 置 し,細 胞 が 剥 脱 した 後 取 出 して,遠 沈. 浮 游 させ,試 験 管 当 り1ccず. に と りか こむ.. 80,牛 血 清20)に つ 分 注 し, 36.5℃. 目.線 維 芽 形 細 胞が. 強 く増 生 し,上 皮 形 細 胞 を網 の 目状. 管 に集 め て 遠 沈 して細 胞 を集 め,細 胞 数が 約2×105 個/ccに な るよ うに培 養 液(YLE. 同上.培 養5日. で. 培 養 した.. 2). 肺細胞. 培 養1日. 尚培 養 細 胞 の 観 察 は す べ て 生標 本 に つ い て行 なわ. 目に線 維 芽 形 細 胞 の 良好 な着 生 を 認 めた.. 細 胞 は以 後 良 好 な 増殖 を示 し,培 養5日. 目に は整然. と排 列 した 線維 芽 形 細 胞 の シー トを形 成 した(図3).. れ た.. 3) 実. 験. 結. 果. 肝細 胞. 培 養1日. 目 に線 維 芽形 細胞 お よび 少 数 の上 皮 形細. Ⅰ. 初 代 培 養. 胞 の着 生 を認 め た.然. 1.. 4ヵ 月 胎 児 組 織. の もの に比 し極 め て低 率 で あつ た.又 着生 した細 胞. 1). 腎細 胞. の増 殖 も他 の組 織 の もの に比 し劣 るよ うに思 われ た.. 培 養1日. 目 に着 生 の認 め られ た の は 殆 ん どす べ て. し細 胞 の 着 生 は肺 あ るい は腎. 殊 に上 皮 形 の もの の増 殖 は弱 く,増 殖 の朗. な線維. 目 よ り上 皮 形. 芽 形 細 胞 に次 第 にお おわ れ,培 養13日 目 には殆 ん ど. 細 胞 と と もに 線 維芽 形 細 胞 も次第 に強 く増 殖 して来. 線維 芽 形細 胞 の み よ りな る シー トを 形成 した(図4).. 上 皮 形 細 胞 の み で あ つ た が,培 養2日. 始 め た.培 養5日. 目 に は良 好 な 細 胞 シー トを 形 成 し. たが,上 皮 形 細 胞 と線 維 芽 形 細 胞 と が 略 々同量 に認. 4). 筋皮 細胞. 培 養1日. 目 に線 維 芽 形 細 胞 の 良好 な着 生. 認め た..
(3) 人 胎 児 諸 組 織 の培 養 とそ の アデ ノウ イル ス12型 に対 す る感 受 性 の比 較 的 研 究. 細 胞 の増 殖 は 極 めて 良 好 で,培 養5日. 目に は整 然 と. 並 ん だ線 維 芽 形 細胞 の シー トを形 成 した(図.5). .. 然 し細 胞 の増 殖 は 前 述 の4ヵ. 565. 月胎 児 の筋 皮 細 胞 の も. の よ り遅 く,培 養10日 目 に 漸 く整 然 と列 んだ 線 維 芽 形細 胞 の シ ー トを形 成 した. Ⅱ. 継 代培 養 前 記 の諸 種 培 養 細 胞 の うち4ヵ 月胎 児 の腎 細 胞, 肺 細 胞,筋 皮 細胞 お よ び7ヵ 月 胎 児 の筋 皮 細 胞 が そ れ ぞ れ 継代 培 養 さ れ た. 1.. 4ヵ 月 胎 児 腎 細胞 の 継 代 培 養. 前 記4ヵ 月胎 児 の 腎 細胞 は 初代 培 養 の5日 目 に シ ー トを 形 成 し たの で8日 目に ト リプ シ ン処 理 に よ り 第 二 代 へ 継 代 培 養 を行 な つ た(方 法 の 項 参照).尚 細 胞 は ト リプ シ ン処 理 に よ り容 易 に ガ ラ ス面 か ら剥 図3.. 4ヵ 月 胎 児 肺 細 胞 .培 養5日. 目.整. 離 した. 継 代 培 養1日. 然 と並 ん だ 線 維 芽 形細 胞 の シ ー トを. 目に細 胞 は か な りの着 生 率 を 示 した. が,そ の 大部 分 は上 皮 形 細 胞 で あ り,継 代 前 に 全 細. 形 成 す.. 胞 の 約80%を. 占 めて い た線 維 芽 形細 胞 は第 二 代 で は. 極 く少 数(全 着 生 細 胞 の約1%程. 度)で. あつ た.細. 胞 の増 殖 も,初 代 の もの に比 し上 皮 形,線 維 芽 形 の 両 細 胞 と もか な り遅 く,培 養14日 目 に漸 くや や粗 な シー トを形 成 した.形 成 され た シー トもそ の大 部 分 は上 皮 形 細 胞 で あ り,線 維 芽 形 細 胞 は小 部 分(全 ー トの 約3〜5%)を 占 め るに過 ぎな か つ た . 培 養15日 目に更 に第 三 代 目の 継 代 が,同. シ. じ くトリ. プ シ ン処 理 に よ り行 な わ れ た.培 養1日 目 に極 く少 数 の上 皮 形 細 胞 の みの 着 生 を 認 め た が,以 後 の細 胞 の増 殖 は極 めて 遅 く,1週 図4.. 4ヵ 月胎 児 肝 細 胞.培 養13日 目.整 然 と並 ん だ 線 維 芽 形 細 胞 の シ ー トを 形 成 す.. 間経 過 した後 に も極 く僅. か の 増 殖 を み た の み で あ つ た.更 に2週 間 液換 え を 行 な つ て培 養 し観 察 を続 け たが それ 以 上 の細 胞 の増 殖 は全 くみ られ ず,逆. に変 性 脱落 が少 数 で は あ るが. 認 め られ だ したの で,以 後 の継 代 は行 なわ れな かつ た. 2.. 4ヵ 月 胎 児 肺 細 胞 の継 代 培 養. 前 記4ヵ 月 胎 児 の 肺 細 胞 は 初代 培 養5日 目 に整 然 と 排 列 しだ 線 維 芽形 細胞 の シ ー トを形 成 した の で8 日 目に 第二 代 の 継代 培 養 を行 なつ た.継 代 は トリプ シ ン処 理 に よ り行 な わ れ たが,細 胞 は トリプ シ ン処 理 に よ り容 易 に剥 脱 し,格 別 の困 難 は 認 め られ な か つ た. 継代 培 養1日 図5.4. ヵ月 胎 児 筋皮 細 胞 .培 養5日. 目.. 整 然 と並 ん だ線 維 芽 形 細 胞 の シー ト を形 成 す. 2.. 7ヵ 月 胎 児 の筋 皮 細 胞. 培 養1日 目 に線 維 芽 形 細 胞 の 良好 な着 生 を 認 め た .. 目に線 維 芽 形 細 胞 の良 好 な 着 生 を 認. め た.細 胞 の増 殖 も.良好 で培 養7日. 目 に は第 一 代 と. 同様 の 整 然 と排 列 した線 維 芽 形 細 胞 の シー トを形 成 した. 培 養10日 目に 同 じ く ト リプ シ ン処 理 に よ り第 三 代 の 継 代培 養 を行 な つ た.培 養1日. 目 に線 維 芽 形 細 胞. の 良好 な着 生 を 認 め た が,以 後 の細 胞 の 増 殖 速 度 は.
(4) 566. 森. 山. 第二 代 の もの に 比 し可成 り劣 る よ うで あ り,培 養. 雍. 方. *目 に漸 くや や 粗 な細 胞 シ ー トを 形 成 した. .然 し更 に. 14日 目に漸 く線維 芽 形 細 胞 のや や 粗 な シー トを形 成. 液換 え を行 な つ て培 養 を継 続 して も それ 以 上 の著 明. した.更 に 液 換 え を 行 なつ て 培 養 を 継続 した が,そ. な細 胞 増 殖 は認 め られ な か つ た の で以 後 の 継代 は行. れ 以 上 の細 胞 増殖 は 認 め られな か つ た の で 以 後 の 継. なわ れ なか つ た. 4.. 代培 養 は行 な わ れ な か つ た. 3.. 4ヵ 月 胎児 筋 皮 細 胞 の継 代 培 養. 7ヵ 月 胎 児 筋 皮細 胞 の継 代 培 養. 前 記 の如 く7ヵ 月 胎 児 の筋 皮 細 胞 は初 代 培養 の10. 前 記4ヵ 月 胎 児 の 筋皮 細 胞 は初 代 培 養 の5日 目に. 日目 に線 維 芽 形 細 胞 の シ ー トを形 成 した の で,培 養. は整 然 と排 列 した 線 維芽 形 細 胞 の シー トを 形 成 した. 12日 目 に トリプ シ ン処 理 に よ り第 二 代 の継 代 培 養 を. の で,. 行 な つ た.培 養1日. 7日 目 に トリプ シ ン処 理 に よ り第 二 代 継 代 培. 目に 線維 芽 形 細 胞 の 着 生 を認 め. 養 を 行 なつ た.尚 細 胞 は ト リプ シ ン処 理 に よ り容 易. たが,着 生 率 も,或 は 又 以後 の増 殖 も可 成 り低 く,. に剥 脱 した.. 培 養21日 目 に漸 くや や粗 な細 胞 シ ー トを形 成 した.. 継 代 培 養1日. 目 に線維 芽形 細 胞 の良 好 な 着 生 を 認. 更 に液 換 えを 行 な つ て 観察 したが それ 以上 の細 胞 増. め,細 胞 の増 殖 は極 め て 良好 で7日 目 に は密 に 並 ん. 殖 は殆 ん ど認 め られ な かつ た ので,以 後 の継 代 は行. だ線 維 芽 形 細 胞 の シー トを形 成 した.. なわ れな か つ た.. 培 養9日. 目 に第 三 代 の継 代 培 養 を行 な つ た.培 養. 1日 目 に線 維 芽 形 細 胞 の良 好 な着 生 を 認 め,細 胞 の 増 殖 も第 二 代 目 と略 々同程 度 に良 好 で,培 養10日 目. 総括お よび考按 現 在 の実 験 に お い て は 腎,肝,肺. およ び筋 肉 と皮. に は整 然 と列 ん だ 線維 芽 形 細 胞 の シー トを形 成 した.. 膚 の4種 類 の 組 織 の 試 験管 内培 養 が 試 み られ,そ の. 従 つ て 第三 代 継代 培 養 の12日 目 に第 四 代 の 継 代培 養. 何 れ もが,前 記 の 如 き極 め て簡 単 な 方 法 に よ り容 易. を 行 な つ た.. に培 養 され た.試 験 管 内培 養 に お いて 出現 した細 胞. 第 四 代 の培 養1日. 目に は線 維 芽 形 細 胞 の 着 生 を 認. の形 態 と継 代 状 態 を表1に 纒 めた.即 ち 腎 お よび肝. めた が,着 生率 も,或 は又 以後 の細 胞 増 殖 も第三 代. の組 織 培 養 に おい て は 上皮 形 お よび 線維 芽 形 の 両細. 目 まで の もの に比 し可成 り低 下 して お り,培 養21日*. 胞 が 出現 し,肺 お よ び 筋皮 の もの にお いて は線 維芽. 表1.. 胎 児 組織 の 培養 に お け る出 現 細 胞 の 形態 と 増殖 度. 形細胞 のみが出現 した.腎 と肝で は上皮形および線. 培養 で 出現 した線 維 芽 形 細 胞 は容 易 に第 二 代 乃 至第. 維芽形 の両細胞が 出現 したが,そ の 出現様式は可成. 三 代 へ継 代 さ れ た.著 者 の 実 験 に お いて,胎 児 の細. り異 なつて お り,腎 で は上皮形細胞が線維芽形細胞. 胞 は 少 な くと も現 在 試 み られ た4つ の組 織 で は,そ. よりも多 く出現 し,肝 で は逆に上皮形細 胞は僅少 で. の種 類 の如 何 を 問わ ず,継 代 培 養 を続 け る と,遅 か. 大部分 は線維芽形細 胞であつた.又 腎細 胞の初代培. れ早 か れす べ て分 裂 増 殖 の能 力 を 失 な つ て いつ た.. 養において増生 して来た線維芽形細胞が第二代 目の. 又筋 皮 細 胞 に つ いて4ヵ 月 の もの と7ヵ 月 の ものに. 継 代において著明に減少 した ことは,肺 あ るいは筋. つ い て 比 較 して み る と,何 れ に おい て も線維 芽形 細. 皮 組織 の培養 におけ る線維 芽形細 胞の場合 と著 しく. 胞 の み の増 殖 が み られ たが,. 異 な ると ころであつた.即 ち肺 あ るいは筋 皮組織 の. 月 の もの に比 し細 胞 の着 生 お よび 増 殖 が 良好 で あ り,. 4ヵ 月 の もの で は7ヵ.
(5) 人胎児諸 組織の培養 とそのアデ ノウイルス12型に対 する感受 性の比較 的研究 又継 代培 養 に お い ても4ヵ 月 の もので は第 四 代 目 ま. 567. お よび 肝 の組 織 か らは 上皮 形 お よ び線 維 芽 の両 細 胞. で よ く継代 さ れ た の に対 し7ヵ 月 のも の で は二 代 の. が,又 肺 お よび 筋皮 の各 組 織 か らは線 維 芽 形 細 胞 が. 継 代培 養 で そ の 増殖 が 著 し く減 弱 した.. 増 殖 した.腎,肺. これ らの 知見 は組織 あ るい は細 胞 の成 熟 お よび 老. お よ び筋 肉 と皮 膚 の培 養 につ いて. 継 代 培 養 を 行 な つ た と ころ,腎 お よび 肺 細 胞 は第 三. 化 と い うこ と と対比 して極 め て興 味 深 い知 見 で あ る.. 代 で,筋 皮細 胞 は第 四 代 で そ れぞ れ 増 殖 が 殆 ん ど停. 人 胎 児 肺細 胞 の培 養 に関 して は他 に も報 告 が あ り,. 止 した.尚 腎 細 胞 の第 二 代 目で は 線 維 芽形 細 胞 は著. そ れ らで は細 胞 は現 在 の実 験 に お け る よ り も遙 か に. し く減 少 した.. 長 く継 代 され て い る10).そ の原 因 と して は い ろい ろ の実験 条 件 の差 が あ ろ うが,最. も大 きい もの は培 養. 液 で あ ろ う.現 在 の 実験 で はYLEを 他 の報 告 で はEagle氏 氏 液がYLEよ. 使 用 したが,. 液 が使 用 さ れ て お り, Eagle. 7ヵ 月 胎 児 の 筋 肉 と皮膚 を 同様 に培 養 した も の で は4ヵ 月 の もの と同様 線 維芽 形 細 胞 が 増 殖 したが, 4ヵ 月 の もの に比 し細 胞 の増 殖 が弱 く,又 二 代 の 継 代 で 増 殖 が 殆 ん ど停 止 した.. りも優 れ た培 養 液 で あ る こ と は既 に. 報告 され て い る11).. 稿 を終 え るに あた り終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 と御 校. 結. 閲 を 賜わ つ た 恩 師 村 上 栄 教授,橋 本 清教 授 並 び に 矢. 論. 4ヵ 月 人 胎児 の 腎,肺,肝. お よび 筋 肉 と皮 膚 を各. 部 講 師に 深 甚 の 謝 意 を 表 し ます. 組 織別 に ト リプ シ ン処 理 し試 験 管 内 で 培 養 し た.腎. 文 1. Henle,. G., and Deinhardt,. ment of strains J.. 79,. R.. S.:. epithelial-like Proc.. Soc.. The establish. Cancer. of human cells in tissue culture.. Immuaol.,. 2. Chang,. F.:. 献. 54〜59,. 1957.. Continuous. cells Exp.. subcultivation. from normal Biol.. &. Med.,. of. human tissues. 89,. the. (APC). J. Hyg., 61, 197218,. L.,. Soc.. Hovis,. J.. F.,. and. on some little-known Eap.. Biol.. &. Med.,. Bell,. J.. A.:. 113,. Coffman,. nicity. Tissue culture studies of the proliferative cervical. carcinoma. and normal. M. T.: capacity. epithelium.. 238〜240,. K. B.. 362〜364,. Proc. 1955.. 11.. 1963.. Kahn,. R. H.,. Publishing. Co., p. 162.. 和33年),丸. of. A.,. in 1955.. H.:. tissne. 善K.. 菌 学 実 習 提 要,全 K.,. p.. papovavirus cells.. Tumorige-. SV40. Nat.. and. Cancer. of. Inst.,. 1963.. Nutrition culture.. J.. 訂. 421〜422.. and Melnick, J. L.:. simian. 1227〜1266,. Eagle,. and Murphy,. Handbook of cell and organ culture.. virus-transformed. 166〜171,. W. D., Kubicek,. 89.. 伝 染 病 研 究 所 学 友 会 編:細. 30,. 5. Gey, G. O.,. Med.. medium of a. strain. Antibody response in rabbits. D. J.,. 10. Ashkenazi,. adenoviruses. 111,. Biol.. Med.,. Burgess 9.. 1962.. of. &. Esp.. 改 版(昭. Observation Proc.. Soc.. W. H. Jr.:. 1955. 4. Rosen,. carcinoma,. 8. Merchant,. R. H.: Studies of. adenoidal-pharyngeal conjunctival. group of viruses. Am.. 1952.. in a fluid. human epidermoid. &. Ward, T. G., and Parrott,. 264〜265,. to Adenovirus type 12. Proc. Soc. Exp. Biol.. 1955.. J. W.,. 12,. Propagation. 7. Rafajko, R. R.:. 362〜364,. 3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Hartley,. Res.,. 6. Eagle, H.:. needs of mammalian Science,. 122,. cells. 501〜504,.
(6) 森. 568. 山. 雍. 方. Studies on Tissue Culture of Human Embryonic Tissues and Their Susceptibility to Adenovirus Type 12 Part. Ⅰ.. Studies. on. Tissue. Culture. of. Human. Embryonic. Tissues. By Yasukata. Moriyama. Department of Microbiology, Okayama University Medical School (Director: Prof. Sakae Murakami and Dr. Yoshiro Yabe) Department of Obstetrics and Gynecology Oksyama University Medical School (Director: Prof. Kiyoshi Hashimoto) Each of the kidney, the lung, the liver and the mixture of the skin and the muscle of a four-month-old human embryo were separately minced, trypsinized and cultured in test tubes. In the cultures of the kidney and of the liver, both the epithelioid and fibroblastic cells proliferated. In the cultures of the lung and of the skin-muscle, only fibroblastic cells proliferated. Upon successive culture passages, cells of the kidney and the lung ceased the multiplication almost completely at the third passage and the cells of the skin-muscle did so at the fourth passage. The fibroblastic cells of the kidney which proliferated vigorously in the primary culture, decreased markedly at the second culture passage. The skin and muscle of a seven-month-old human embryo was treated and cultured by the same method as that of four-month-old embryo. Similarly fibroblastic cells proliferated, but the cell multiplication was much weaker than in those of the four-month-old embryo and ceased to multiply almost completely at the second culture passage..
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