食 品 防 腐 剤 フ リ ル フ ラ マ イ ド の カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ イ ー に よ る
シ ス 体 、 トラ ン ス 体 の 分 離 定 量
石 原 忠 ・高 本 健 一 ・保 田 正 人
Separation and Determination of Cis- and Trans-Furylfuramide as Food Preservatives by Silicagel Column Chromatography
Tadashi ISHIHARA, Kenichi KOMOTO and Masato YASUDA
A study was made on separation and determination of cis- and trans- furylfuramide which was extracted from kamaboko (fish cake).
The procedures and the results can be summerized as follows. Cis- and trans-furylfuramide were separated by silicagel column chromatographic procedure using WAKOGEL C-200, which was soaked in 5 volumes of 20%
acetic acid for 48 hours, then washed with boiling water 6 or 7 times, and after repeating the same treatment activated for 24 hours at 150°C, or which was refluxed with 5 volumes of 20% acetic acid on the free flame for 6 hours, then washed and activated.
The silicagel was packed in column with n-hexan and the elution was carried out with ethyl ether. (Fig. 1) Cis- and trans-furylfuramide, separated through the column, were determined by ultraviolet spectroscopy at 380mμ
(trans-furylfuramide) and 390mμ (cis-furylfuramide) in ethyl ether. Recovery
rates of cis- and trans-furylfuramide during the column chromatography were 95〜97%. (Tables 1, 2). The extract of kamaboko did not prevent the deter- mination of cis- and trans-furylfuramide. (Fig. 2, Table 2)
フ リル フ ラ マ イ ド(FF)の 定 量 法 に は 吸 光 度 法1)・2),ポ ー ラ ロ グ ラ フ イ ー 法3),4),ニ トロ基 の 発 色 に よ る方 法5)お よ びBioassayに よ る方 法6)が あ る.こ の うち 吸 光 度 法 は 操 作 が 簡 便 で あ る が,食 品 な ど にFFを 添 加 し た 場 合 測 定 に 使 用 す る 長 波 長 側 の 吸 収 極 大 の 位 置 の 移 動 と そ の 吸 光 系 数 に 変 化 が 起 る3),7)た め ほ と ん ど 行 な わ れ て い な い.こ の 原 因 を 知 る た め に 著 者 らは 先 にFFの2,3の 条 件 下 に お け る分 解 機 序 を シ リ カ ゲ ル に よ る TLC法 に よ っ て 追 究 し た8).そ の結 果 数 種 の 分 解 生 成 物 を 確 認 した が,食 品 中 で はtrans
*長 崎市西山町 長崎県立東高等学校
110 長崎大学水産学部研究報告 第29号（1970）
体として添加されたFFがまずcis体へ異1生化し次段階の分解へ進むことを認めた．した
がってFFは食品中でそのかなりの部分がois体に変化しており，吸収曲線，吸光系数の
変化はこの異性化に起因することが判明した．先にあげた定量法はこれらtrans体とcis体をまとめて定量しており，両者の分別定量
法は現在までなされていない．ポーラログラフィ一法は高価な特殊な機器を必要とするし，Bioassayはかなりの習熟を要する．これらのことを考慮し， ois体とtrans体の分離が できれば吸光度法の利用が可能になると考え，著者らはシリカゲルカラムクロマトグラフ ィーにより両者の分離を試みた結果，所期の目的を達することができ，各々の吸光度を測 定することによりFFの定量が可能となったので報告する．
実 験 方 法
1 試 薬
（1）カラム用シリカゲル：WAK：OGEL C−200
（2）FF（trans体）：純末，針状結晶（上野製薬製）
（3）・：FF（cis体）：菅野の方法9）によりtTans−FF O．59をメタノール200 m1に溶解 し，M／15リソ酸ナトリウム溶液130 mlを加え，数時間直射日光に照射後減圧濃縮し，
放冷して析出する結晶を濾幽する． この結晶をメタノール・水（4：1）から再結晶して
cis体を得るが，微量にtrans体を含む場合もあるのでこれをさらに前報8）のTLC法で
分離し，ois体の部分を集めエチルエーテルにて溶出し，実験に供した．濃度の決定は390 mμの吸光度で前門8）の標準曲線より求めた．2 操 作
（1）食品中からのFFの抽出：松田らの方法4）に準じ，煉製品（FFを添加した自作か まぼこ）109に対し5％メタリン酸20m1を加え，ブレンダーにて2分間ホモゲナイズ する．これを分液ロートに移し60m1のトルエン，酢酸ブチル混液（1：1）を加え10 分間振とう機にて振る．次に4000rpmで2，3分間遠心分離し上澄液を取る．この液 の一定量（通常30m1）をトルエンで調製した1×8cmのアルミナカラムに通し，試料 液が流下後20mlのエチルエーテルを流して溶出物質を除去し，ついでメタノール20 m1でFFを溶出させる。メタノールを減圧下で溜去後エチルエーテルに溶解してシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー用の試料液とした．
（2）cis体， trans体のカラムク・マトグラフィーによる分離：約3．59のWAKOGEL C−200を20ml程度のn一ヘキサンと混合し気泡を除き冷却用外套管のついた下コック
付のカラム管（0．8×40cm）に流し入れ；13〜14 cmに調製する．上部管壁についたシ リカゲルはなるべく除去する．n一ヘキサンを固定相すれすれまで流出後，エチルエーテルに溶解した試料液1〜2mlをのせ，エチルエーテルにて毎分約1mlの流速で展開す る．流出液を2m1つつ分取し，エタノール2．5m1を加え分光光度計（日立EPU一・2
型）にて390rnμで吸光度を測定する． さきに流出するcis体の最大吸収波長はエチルエーテル中で390mμ，あとに流出するtrans体は380 mμ近くである． 冷却用外套管
は室温が高い場合カラムにひびが入り易いのでこれをさけるためのものである．操作1，2は光分解をさけるため暗い室内で行なった．
実 験 結 果
1 cis体， trans体の分離におよぼすシリカゲルの前処理の影響
シリカゲルの前処理により分離能に優劣が生じるので以下の4種の方法を試験し比較し
た．
（1）WAKOGEL C−200を150Q C中に24時間保ち活性化し，減圧デシケーター中に
．1．時間放冷後使用する．
（fi） シリカゲ ルを5倍量の20％酢酸に48時間浸漬する．この間時々境ま半する． 吸引濾 過後さらに2，3倍量の20％o酢酸で2度洗い，ついで沸騰蒸溜水でpH 5．0〜5．5になる
まで洗浄をくり返す． これをエタノールで2回，エチルエーテルで2回洗い，エーテル臭 がなくなってから前記（1）と同様に活性化して使用する．
（皿）前記（9）の処理を2回ぐり返す．ただし1回目の処理後の活性化は行なわずに2
回目の処理をする．O．6
O．3
義E
oa
の
．O．6
Qo
cis
t ra ns
（1） cis （ lll ）
trans
O．3
（皿）
10 20 30 ， 10 20 30
Fraction number， 2ml／tube
Fig． 1． Silicagel co1umn chromatography of cis一 and trans−furylfuramides．
Cis一 and traras−furylfuramides were added either separately or in mixture to the silicagel column （O．8x13 cm） prepared with n−hexan．
Elution was carried out with ethyl ether at a flow rat ?@of 2 ml／min．
（1）： Silicagel （WAKOGEL C−200） was activated for 24 hrs． at 1500C
（U）： Silicagel was soaked in 5 volumes of 20％ acetic acid for 48 hrs． and then washed with boiling water 6 or 7 times．
Activation was carried out with the same method as described in （ 1 ）
（M）： Silicagel was soaked twice with the same methed as shown in （1） and then washed and activated
（rv） ： Silicagel was refluxed carefully with 5 volumes of 20％ acetic acid on the free flame for 6 hrs． and then washed and activated
112 長崎大学水産学部研究報告 第29号（1970）
（IV） 5倍量の20％酢酸に浸漬し，これを還流冷却管に接続し直火で約6時間還流を続け る．この間一度酢酸溶液をとりかえる．突沸が著しいので沸騰石を充分入れておく必要が ある．これを（9）と同様な方法で洗浄し活性化する．
FFのcis体， trans体の適当濃度の混合液を作り，上記4処理法により調製したシリ
カゲルを用いてその分離能を試験した．溶出は初めにcis体がついでtrans体となる．溶 出液量は，おずかのカラムの長さの差により異なってくるが，分離能には大差なく，その一一痰 Ｆig．1に示した． 図中の（1）〜（W）は前記（1）〜（IV）の処理方法によって調 製したシリカゲルを用いて行なった結果である．その結果（1）の処理方法ではcis体，
trans体の分離は非常に不完全であり，（皿）の処理方法では処理法（1）よりは分離状態 はよくなっているがまだ両者が幾分重なっている． これにたいし（皿），（IV）の処理を行 なったものは両者を完全に分離して溶出できることがわかった． したがって以下の実験で
はWAKOGEL C−200を（皿）または（IV）の方法によって調製したものを用いた．
2 カラムクロマトグラフィーの回収率試験
cis体， trans体と両者を混合した3通りについてカラムクロマトグラフィーを行ない，
その前後の吸光度をエチルエーテル中390mμで測定し，回収率を試験した． trans体は
Table 1． Recovery rates of furylfuramide （FF） during silicagel column chromatography．
Amount of cis−l and trans−FF added to column
Cis−FF （ptg）
Recovery rate of FF （％）
Trans−FF
Cis−FF
Mixture
50
IOO
200
97．9 98．6 95．4 98．1 96．9
（97．4土1．3）
96．2 98．8 96．4 97．9 95．8
（97．0土1。3）
98．5 97．3 96．1 98．4 98．2
（97．7±1．0）
97．7 95，2 98．1 95．2 98．0
（96．8±ユ．5）
97．8 97．2 99．0 97．6 95．7
（97．5土1．2）
97．5 98．4 98．ユ 97．3 95．8
（97．4土10．）
Trans−FF
96．3 98．2 97．6 96．7 95．4
（96．8ニヒ1．1）
95．2 94e4 95．8 96．8 97e9
（96．〇ニヒ1．4）
98．9 96．8 97．4 96．0 95．4
（96．9土ユ．4）
94．5 95．3 95．1 97．1 97．8
（96．0土：t．4）
98．7 96．2 96．8 98．0 97，2
（97．4土1．0）
94．7 97．7 95．2 96．4 98．2
（96．4土1．5）
Silicagel was prepared with the same method as shown Fig． 1 （M）， （rv）
1 or 2 ml of 50， 100， 200 ppm FF ethyl ether solution was added to column
（）： Average and standard deviation
50，100，200PPmの3段階の試料液を作り，その1m1または2mlをカラムにのせ
た．ois体は前門8）の標準曲線より求め前記3段階の濃さに分けて行なった． cis体，trans体の混合は同濃度の等量混合液を用いた． 溶出位置は各回毎に幾分異なるので，呈
色状態で両者の分離溶出状態を判断し，cis体， trans体に分取した．各5回の結果は
Table 1に示すごとく，50〜200μ9の間ではカラムに添加した試料量の差による回収率の差はほとんどなく，またcis体， trαns体ともに96〜97％の回収率を示しその偏差も小 さく満足のできる結果であった．
3 煉製品抽出液の分離におよぼす影響
ソーセイジ，かまぼこなどの煉製品からFFを抽出し，カラムクロマトグラフィーにか ける場合， その分離におよぼす抽出液中の來雑物の影響が考えられるのでこの点について
検討した．マアジ肉を摺りつぶしFF無添加のかまぼこを自作した．この609を用い前 述のFFの抽出法に準じトルエン：，酢酸ブチル混液で抽出しこの全量を3回に分けてア
ルミナカラムにかけメタノール溶出液を採った． これを減圧濃縮し，所定の濃度に調製したcis体，〃侃s体のエチルエーテル溶液6mlを添加し，濃縮乾固物を溶解しこの2ml
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて，溶出状態および回収率を試験した．．Table 2に回収率を示したが， cis体， trans体単独の場合は50〜200μ9の各濃度とも 96〜97％の回収率が得られ，またそのばらつきも小さく，前実験結果（Table 1）と比較 し差はなく爽雑物の影響はほとんど見られなかった．cis体とtrans体の混合物の場合は ois体の回収率はほとんど変らないが， trans体の回収率が各濃度ともわずかに低くなっ た．しかし大きな影響は見られなかった．この場合の溶出状態の一例をFig。2に示した がcis体， trans体ともに溶出が少し遅くなったのみで，両者の分離および溶出液量には 大差はなかった． またFF無添加の自作かまぼこの抽出液を同様の方法でカラムにかけ 390mμの吸光を測定したが何らの影響も見られなかった．
O．8
含
tLo．4 co
．︵一．0
cis△
1、
＝ ， l
ll
ll f「αns
コ ロ
1 覧 oρ㍉
1 魯 ノ
もロ ら ら コ な
1 ＼ ／ ＼
置 、
、 、
O 10 20 30 40
Fraction number， 2 ni 1／tube
Fig． 2． Silicagel column chromatogrphy of cis一 and trans−furylfuramides．
Silicagel was prepared with the same method as shovLTn in Fig． 1 （M）， （IV）．
Elution was the same as in Fig． 1．
一一@： Control
Extract of kamaboko （fish cake） contained
114 長崎大学水産学部研究報告 第29号（1970）
Table 2． Recovery rates of furylfuramide （FF）， added with extract of kamaboko， during silicagel column chromatography．
Amount of cis−
and tians−FF added to column
（，Lg）
50
100
200
Recovery rate of FF （％）
Cis−FF Trans−FF
98．5 95，7 96．2
（96．8土1．5）
96．4 97．2 98．1
（97．2土0．9）
Cis−FF
M i xture
Trans−FF
96．2 94．2 95．8
（95．4ニヒ1．1）
94．7 93．2 96．4
（94．8土1．6）
98．2 96．0 97．3
（97．2±1．1）
98．6 95．9 95．3
（96．4土1．8）
97．1 95．4 ． 98，7
（9．7．1土1．7）
97．0 94．2 96，8
（96．0土1．6）
97．0 95．4 96．8
（96．4土O．9）
94．9 96．3 94．0
（95．1 ：．一 1．2）
97．4 98．2 96．3
（97．3土1．0）
94．2 98．4 95．0
（95．9土2．2）
Silicagel was prepared 翌奄狽?@the same method as shown Fig． 1 （M）， （rv）
1 or 2 ml of 50， 100， 200 ppm FF ethyl ether solution cdntaining extract of kamaboko was added to column． Extract of kamaboko was obtained by the method of MATSUDA4）
（ ）： Average and standard deviation
Table 3． Quantity of furylfutamide （FF） remaining in the same extract from kamaboko （fish cake） determained by silicagel column chromato−
graphic procedure．
Amount of FF
Average and standard deviation
Ci．s−FF （ppm） Trates−FF （ppm） Total FF （ppm）
8．2 7．6 8．0 7．7 7．9
6．1 6．2 6．0 5．7 5．6
14．3 13．8 14．0 13．4 13．5
7．8土0．2 5．9±O．3 13．8土0．4
Kamaboko ： The fish meat containing FF （trans−FF） 100 ppm． was boiled for 30 rnin．
at 900C， and then exposed to room temperature （13 x・180C） for about 30 days．
Extract of kamaboko was obtained by the method of MATSUDA4）
4 煉製品から抽出したF：FのoiS体， tvans体の分離，
アジ肉を摺りつぶし，澱粉で50倍散したFFを使用して， FF 100 ppm含有．のすり身 を900C，30分間の熱処理をしてかまぼこを自作した．実験には製造後約1ケ月間室温（13
〜18。C）．に放置しておいたものを用いた．この609からトルエン・酢酸ブチル混液で抽
出 し,そ の30mlを ア ル ミナ カ ラ ム に 通 し,メ タ ノ ー ル 溶 出 液 を 減 圧 濃 縮 後3mlの エ チ ル エ ー テ ル に 溶 解 し,こ の2mlを シ リ カ ゲ ル カ ラ ム に よ っ てcis体,trans体 の 分 離 定 量 を 試 み た.な お 定 量 に あ た っ て カ ラ ム か ら の 溶 出 液 を 両 者 共15mlに 定 容 と し て 吸 光 度 を 測 定 し た.5回 の 実 験 結 果 はTable3に 示 す ご と く比 較 的 よ く一 致 し た.ま た 分 離 状 態 は 図 示 し な か っ た が,実 験3の 結 果 と比 較 し大 差 な く よ く分 離 した.
考 察
食 品 中 に残 存 して い るフ リル フ ラ マ イ ド(FF)は 添 加時 のtrans体 か ら一 部 がcis体 に 変 化 して お り,cis体,trans体 の 吸 光 系 数 お よび 吸 収 極 大 波 長 が こ とな る た めFFの 吸 光 度 法 に よ る定 量 法 は使 用 で き なか っ た.
著 者 らは先 に シ リカゲ ル薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィーで このcis体 とtrans体 を よ く分 離 で き る こ とを知 っ た8).こ れ を応 用 し本 実験 で はWAKOGEL C‑200を 用 い た カ ラ ム ク ロ マ トグ ラフ ィー を行 な い両 者 を完 全 に分 離 し,各 々 の吸 光 度 よ りFFが 定 量 で き る こ とを み い だ した.
本法 に使 用 す る装 置 は簡 単 な もの で あ るが 問 題 点 と して は 食 品 中 の 含 有 量 が 低 濃 度 の場 合,多 量 の 抽 出液 が 必 要 とな る.そ の た め ア ル ミナ カ ラ ムで の処 理 量 が 多 くな り,そ れ に 伴 う回収 率 低 下 の恐 れ も考 え られ るので,抽 出 法 お よび 前処 理 に 関 しては さ らに 検 討 が 必 要 と考 え る.ま たFFは 有 機 溶 媒 中で は 光 に 対 し非 常 に 不 安 定 で あ り10),本 実 験 の よ う に た えず 有 機 溶 剤 に て実 験 を進 め る方 法 で は実 験 室 内 の 遮 光 を な るべ く完 全 に す る こ とが 望 ま しい.
要 約
フ リル フ ラ マ イ ドのcis体 とtrans体 の シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィー に よ る 分 離 定 量 法 に つ い て 検 討 し 次 の 結 果 を 得 た.
1.分 離 用 シ リ カ ゲ ル はWAKOGEL C‑200を 前 処 理 と し て5倍 量 の20%酢 酸 で2日間 の 浸 漬 処 理 を2回 行 な うか ま た は 同 量,同 濃 度 の 酢 酸 に て6時 間 還 流 す る 必 要 が あ る.
2.上 記 の シ リ カ ゲ ル を150℃ で24時 間 活 性 化 し,n‑ヘ キ サ ン で カ ラ ム(0.8×13cm) を 調 製 し エ チ ル エ ー テ ル に て 毎 分1mlの 流 速 で ク ロ マ トグ ラ フ ィー を 行 な え ば 両 者 を 完 全 に 分 離 で き そ の 回 収 率 も 高 か っ た.
3.煉 製 品 の 抽 出 液 中 の夾 雑 物 は カ ラ ム ク ロマ トグ ラ フ ィー の 溶 出 位 置 を 少 し 遅 く らせ る が 分 離 お よ び 回 収 率 に は ほ と ん ど影 響 を 与 え な か っ た.
文 献
1)菅 野 三 郎,屋 宮 妙 子:食 衛 誌,4,205(1963) 2)竹 下 隆 三,他:食 衛 誌,8,127(1967)
3)松 田 敏 生,小 畠 渥,稲 嶺 成 男,荒 井 伸 一 郎:日 水 誌,31,146(1965) 4)荒 井 伸 一 郎,松 田 敏 生:日 水 誌,32,655(1966)
5)菅 野 三 郎,詫 摩 真 澄,渡 辺 重 信,村 井 絢 子:食 衛 誌,7,140(1966)
116 長崎大学水産学部研究報告 第29号（1970）
6）
7）
8）
9）
10）
松田敏生，小畠 渥：日水誌，31，208（1965）
小畠 渥，松田敏生：日水誌，31，214（1965）
石原 忠，保田正人：本誌，25，79（1968）
菅野三郎，詫摩真澄，渡辺重信，村井絢子：食衛誌，8，253（1967）
石原 忠，保田正人：昭和41年4月日本水産学会講演（1966）
