Presence of membrane ecdysone receptor in the anterior silk gland of the silkworm, Bombyx mori : biochemical and molecular studies

Presence of membrane ecdysone receptor in the anterior silk gland of the silkworm, Bombyx mori : biochemical and molecular studies

著者 Elmogy Mohamed El sayed journal or

publication title

博士学位論文要旨 論文内容の要旨および論文審査 結果の要旨／金沢大学大学院自然科学研究科

volume 平成18年1月

page range 50‑55

year 2006‑01‑01

URL http://hdl.handle.net/2297/16704

氏名 学位の種類 学位記番号 学位授与の日付 学位授爬与の要件 学位授与の題目

ELlVENABAWYMOHAMEDELSAYEDELMOGY

博士（理学）

博甲第682号 平成１６年９月３０日

課程博士（学位規則第４条第１項）

Presenceofmelnbraneecdysonereceptorintheanteriorsilkglandofthe silkworm，βロノnzbJzxﾉmri：Biochemicalandmolecularstudies

(カイコガ前部絹糸腺におけるエクジソン膜受容体の存在：生化学的分子生物 学的研究）

櫻井勝（自然科学研究科・教授）

福森義宏（自然科学研究科・教授），松永司（自然科学研究科・教授），

東浩（自然科学研究科・助教授），岩見雅史（自然科学研究科・助教授）

論文審査委員(主査）

論文審査委員(副査）

学位 ^=△百m0 文要 ^』曰

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

NOngenomicactionofaninsectsteroidhonnone,Z0-hydroxyecdysone(ZOE)，

hasbeenimplicatedinseveralZOE-dependentdevelopmentaleventsincludingthe programmedcelldeath(PCD)ｏｆＢｏ腕加川'ianteriorsilkglands(ASGs),butｎｏ infbrlnationisavailablefbrtllemodeofaction・Weprovideseverallmesofevidencefbr、

aputativemembranereceptor(mEcR)locatedintlleplasmamembraneofASGsasan integralmembraneprotein・WeshowedthattheputativemEcRcouldmediatetherapid increaseincAMP1evelinASGcells,andmiglltbeinvolvedintheactivatｉｏｎｏｆ adcnylylcyclasethroughGsu・ThemembraneBactionsdidnotcontainconventional EcRasrevealedbywesternblotanalysisusingantiEcR-AantibodybThemEcR

exhibitedsaturablebindmgfbr[3H]ponasteroneA(KtF17､3,Ｍ,Ｂ,,腿zx＝O82pmol/mg)．

AssociationanddiSsociationkmeticslevealedthat［3mponAassociatedwithand

dissociatedfi･ommEcRwithinminutes．

Wealsodefinedtheexperimentalconditionstllatallowedsolubilizatｉｏｎｏｆ

､ＥＣＲ分omASGsmenlbraneswithpreserving75.1％oftllenativebindingactivibV．

Dissociationoftheprotein/lipid/detergentmixedmicelles，yieldedprotein/detergent

complexeswithpaltialbindingactivitybwhichappearedenouglltobeadoptedfbr

containecdysonereceptors，andthatthesteroidmembranereceptorsarecomnlonly

presentmmsectsandInammals．

FinallybwesuccessfilllyraisedamonoclonalantibodyagainsttheputativemEcR andobtainedtwoGPCRscandidates低omASGsofBo加伽"mbwhichgaveusthe hopetosteponthewayfiDrmEcRgenecloning．

IＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ

Theholometabolousinsect,ＥＣ加加加o74belongstoorderLepidoptera,andits larvaeundergometamolphosisintopupaethenintomoths・Attllepupalmetamorphosis，

mostoflarvalspecifictissuesdegenerate.、ｌｅｄegenerationisknownasprogrammed celldeath(PCD).Thesilkglandisalarval-specifictissuethatdegeneratesshortlyafter pupationTheanteriorsilkgland(ASG)isamereductcomposedofasinglecell-layer consistingofabout250cells・Itfbrmssilkfilamentoutofthesilkproteins､Ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆ thelarvalstage,afterthecocoonhasbeenspun,theASGsentertheprocessofPCDin responsetothehighhemolymphecdysterOidconcentration，whichinducespupal metamorphosis、ＴｈｅＰＣＤｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２０Ｅｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｔａｋｅｓｌ２０－１４４ｈｔｏｂｅ completed，atwhichtimc-pointanoligonucleosomalladderofDNAandapoptotic bodiesappear､DuringtlleperiodwithZOE,geneexpression肥quiredfbrtheCompletion ofthePCDoccursdurmgthefirst8hfbrtmnscriｐｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｌ８ｈｆｂｒ translationIfthegenomictheolyofsteroidactionisapplicabletothe20E-induced PＣＤ,ｔｈｅ２０Ｅｃｈａｕｃｎｇｅｆｂｒｌ８ｈｓｈｏｕｌｄｂｅｓufficientfbrfUllapoptosis・Neverthelcss，

withdrawalof20Eafterl8handupto42hOfcultureinterfereswiththeprogressionof apoptosis，andtheextentofinhibitionisreducｅｄｗｉｔｈｄｅｌａｙｉｎｇｔｈｅｔｉｍｅｏｆ２０Ｅ withdrawaLThissuggeststhateffectsofZOEduringthepcriodbetweenｌ８ａｎｄ４２ｈａｒｅ

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notaccompaniedbWgenccxpressionbutrathcrmcdiatedbyanongenomicpathwayb probablythroughamembranereceptorandsecondmessengenlfthisisthecase,ASG plasmamembranesshouldcontainhigdl-affinitybindingsitesfbrecdysteroid・Inthe presentsmdyBweprovidefbrthefirsttimephysiologicalandbioehemiGalevidencefbr

WedefinedtheexperilnentalconditionstllatallowedsolubilizatioｎｏｆｎｌＥｃＲ ffomASGsmembraneswithpreservin975.1％ofthenativebmdmgactivity．

Dissociationoftheprotein/lipid/detergentmixedmicelles，yieldedprotein/detelgent complexeswitllpartialbindingactivity;whichappearedenoughtobeadoptedｆｂｒ proteinpurification(ChapterⅡ)．

ＲＥＳｕＬｒｓＡＮＤＤＩＳＣＵＳＳＩｏＮ

Weprovideseverallinesofevidencefbraputativemembranereceptor(mEcR）

locatedintlleplasmamcmbraneofASGsasanimegralmemblnneproteinWesllowed thattheputativemEcRcouldmediatetherapidincreaseincAMPlevelinASGcells，

andmigdltbemvolvedintheactivationofadenylylcyclasethrougllGsqThemembrane ffactionsdidnotcontainconventionalEcRasrevealedbywesternblotanalysisusmg^● antiEcR-Aantibody(Fig.１).Themembranereceptorexllibitsaspecificandsaturable

bmdingfbr[3mPonAwithaKbof１７．２×１０~９Ｍ(Fig.2)mlisvalueisphysiologically

relevanttotheprevailinghemolymphconcentrationsof20E(rangingbetweenlO-7-10-6

Ｍ）intheprepupalperiodwhenPCDistriggeredmWvo・Theassociationand dissociationkineticsindicatethatPonAassociationwithanddissociationhPomits bindingsitesarerapid，whichischaracteristicofthebindingofseveralnatural

compoundstotheirmembranereceptors・Theobservedassociationconstant(Kb跡)ｗａｓ ０．９士０．２ｍｍ~'・ThedissociationofPonAffomthemembranesoccurswithinlOseconds withadissociationconstant(Kbl)ｏｆ2.3±０．５ｍin~1.Thecalculatedassociationmte constant(Kb")ｗａｓ13.3ｘｌＯ７Ｍｌｍｉｎ~1,ａｎｄｔｌｌｅｅstimateddissociationconstantat equilibrium(Kd)ｗａｓ17.5,Ｍ.ThesaturationcurVeindicatesthepresenceofasingle high-affinitybindingsiteandanappalentmaximalnumberofbindingsitesof０．８２pmol

mg1proteinTheobtainedKdvalueissupportedbygoodaccordanceofthMqiWiththe

PonAisｌｅｓｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆ２０ＥＴｈｅｂｉｎｄｉｎｇａｆｆinityofPonAtothenuclearreceptoｒ

competitionassayusingtheASGmemblanefiactionsshowsthatthebindingaffinityfbr PonAisone-fburlhofthatｉｂｒ２０Ｅａｎｄｔｈａｔｔｈｅｖａｌｕｅｓｆｂｒｎｏn-steroidalecdysone

threenon-steroidagonists,RH-5849,tebufbnozide（RH-5992）andmethoxyfenozide

ForcharacterizationofthenovelmEcR,wetriedthesolubilizationoffimctional

mEcRffomASGsofBol7zh〕ﾊﾌﾋﾟ加伽(ChapterII).Howeve“hereisnosingledetergcnt orsolubilizationschemeuniversallyapplicabletoallmembraneproteins,wedefined

protein/lipid/detergentmixedmicelles,yieldedprotein/detergentcolnplexeswithpartial bindingactivitybwhichappearedenoughtobeadoptedfbrprotempurificationBecause

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membIanepreparationsandtheinabilitytomassisolatetheASGs，Weprepared membrane登actionsBomthefatbodycellsoftheGOlarvae・TY1eanalysisfiDrtllefat bodymembrane征actionsshowedtllepresenceofasmglehigh-aEfinitybindingsitein

eachmolecule,withanapparenMQﾉandBmxofl5､Ｏ８ｎＭａｎｄＯ､４２ｐｍｏｌｍｇ~'protem，

respectively6NevertllelessthepresCnceofmEcRinthefatbodiesprovideapossibility fbrpurificationandidentificationofmEcRffomtllemass-isolatedfatbodies・ＭＯＩ℃oveL thepresenceofmEcRintheftltbodiesindicatesanequivocalpresencelnvarious^● tissuesanditsimportanceinUnderStandingtheeHectof20Eatmolecularlevels．

(A）

ＫＤａ ｇ４ ｅ７

4３ ３０

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14.4 ^曰－m

騨讓篝篝蕊篝i鑿i篝

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(B）

iiiiiiiiiilHF

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戦拠

Fig．

rUg，LAbsenceofconventionalEcRinthemembranefractions.(A)Commassie briIliantBlue-stained１２％SDS-PAGEgel.(B)WesternblotfCrtheidenticaIgelusinganti- EcR-AmonoCIonalantibody（1:100）asafirstantibodyandHRP-conjugatedProteinA

nuclearextractSamplesfo「lanel-3werepreparedfromfresIydisSectedASGsLane4，

membranefractionpreparedfrｏｍｔｈｅｃｕＩｔｕｒｅｄＡＳＧｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｂｉｎdingexperiments、

TwentyUgfOreachlane.Ｍ,proteinmolecularweightmarker．

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ｏ伯ｏ３００４ｓｏｅｏｏ了ｓ０ｇｏｏ１０ｓｏ

［釉皿PonasteroneA[nM］

Fig.２PonAsaturationanalysisofASGmembranes,Membranepreparations(100 UgproteininlOOUlbuffer)wereincubatedwithincreasingconcentrationsof[3H]PonA

at25oCforlOminwithoutorwiｔｈａlOOO-fddexcessofunlabelledPonA,Ｔｈｅｄａｔａ

ｗａｓｆｉ廿edbynonlinea｢regressionanaIysis・lnsetisScatcharcIanalysesofthebinding daｔａＫｂ,＝17.３，Ｍ;Bmax＝O82pmolmg-1proteinEachdatumpointisamean±Ｓ、

(、＝Ｓ)．

学位論文審査結果の要旨

昆虫の成長、脱皮、変態は－種類のステロイドホルモン、20-ヒドロキシエクジソン（20E）により調節 されている。これまで２０Ｅの初期作用はheterodimerの核受容体（ECR/USP）と結合し、遺伝子の転写調 節にあるとされてきた。しかし、エルモギ君の所属する研究室ではこれまで２０Ｅによる前部絹糸腺の予定 細胞死において、核受容体を介した作用の他、恐らく膜受容体を介した作用経路もあることが示唆されてき た。エルモギ君は前部絹糸腺膜を材料として膜受容体の存在を証明することから研究を始めた。この分野は 未知領域であり、まず膜受容体のホルモン結合活性を測定する系を確立し、それにより結合部位の生化学 的特性を明らかにした。その結果、解離乗数は10,ＭオーダーでＥＣＲ/USPよりも優位に低いものの、体内 20Ｅ濃度で十分活性化されうる解離常数を示した。たまエクジソンアゴニストとの結合はＥＣＲ/USPに対す るよりも２桁弱かった事から､20Ｅの膜受容体の存在を補強するものであった。また､膜受容体のモノクロー ナル抗体の作成に成功し、これを用いて絹糸腺以外の組織で多量に入手できる脂肪体にも恐らく同一の膜受 容体があることを示し、膜受容体の精製の道も開いた。本学位論文は、同一細胞が膜受容体と核受容体の双 方を有し、これらを介して単一の細胞応答を調節するというステロイド作用機序の理解の基礎を与えるもの であり、学位授与に十分な業績といえる。

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